Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas

Apresentamos aqui um protocolo que envolve geneticamente acoplado espectroticamente distintos proteínas foto-ativadas e fluorescentes. Estas réguas internas permitem quantificação da fração PAFP que é foto ativada para ser fluorescente. Até agora, nenhum método foi disponibilizado para quantificar em massa em células de vida quantos dos PAFP expressos são ativados por foto para fluoresce. A quantificação apresentada da eficiência de foto-ativação é exemplificada para PA-GFP e PA Cherry em células vivas, mas é, em princípio, amplamente aplicável e pode ser usada para qualquer proteína fluorescente foto-ativada sob qualquer condição experimental. Sempre que se trabalha com proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, a quantidade absoluta de proteínas expressas varia de célula para célula e é desconhecida. Para padronizar a expressão entre as células, introduzimos governantes internos de proteínas fluorescentes geneticamente acoplizadas espectralmente distintas. Ao acoplar as informações genéticas de uma proteína florescente foto-ativada a uma proteína espectralmente distinta sempre em réguas internas de proteína fluorescente são criadas que ainda serão expressas a uma quantidade total desconhecida, mas em uma quantidade relativa conhecida fixa de um para um. Para começar a construir os plasmídeos como descrito no protocolo de texto que acompanha. Além disso, cultura na linha celular padrão em seu meio de perspectiva usando a versão livre de fenol vermelho. Quando estiver pronto para começar o experimento, colde as células usando trippsina sem fenol vermelho para reduzir a florescência de fundo. Após a colheita, encha uma pipeta de 2 ml com a suspensão celular de uma cultura celular confluente cultivada em um frasco de cultura celular T 12.5. Adicione uma gota em cada câmara de um escorregador de vidro de oito câmaras. Incubar o slide sob condições padrão de cultura celular por 24 horas. Em seguida, transfem as células usando reagentes comerciais seguindo o protocolo dos distribuidores. Transfectar as células com as quimeras GFP Cherry, PA-GFP Cherry e GFPPA Cherry. Em seguida, devolva as células à incubadora para permitir a expressão proteica, dobramento e maturação. Após um total de 20 horas após a transfecção, transfira as células para o estágio de um microscópio florescente confocal equipado com a câmara ambiental umidificada e aquecida pré-aquecida para 37