Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas
7 de janeiro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo que envolve photoactivatable espectralmente distinto geneticamente acoplado e proteínas fluorescentes. Estas quimeras de proteína fluorescente permitam a quantificação da fração de PA-FP que é fotoativo ser fluorescente, ou seja, a eficiência de fotoativação. O protocolo revela que diferentes modos de fotoativação produzem photoactivation diferentes eficiências.
Apresentamos aqui um protocolo que envolve geneticamente acoplado espectroticamente distintos proteínas foto-ativadas e fluorescentes. Estas réguas internas permitem quantificação da fração PAFP que é foto ativada para ser fluorescente. Até agora, nenhum método foi disponibilizado para quantificar em massa em células de vida quantos dos PAFP expressos são ativados por foto para fluoresce. A quantificação apresentada da eficiência de foto-ativação é exemplificada para PA-GFP e PA Cherry em células vivas, mas é, em princípio, amplamente aplicável e pode ser usada para qualquer proteína fluorescente foto-ativada sob qualquer condição experimental. Sempre que se trabalha com proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, a quantidade absoluta de proteínas expressas varia de célula para célula e é desconhecida. Para padronizar a expressão entre as células, introduzimos governantes internos de proteínas fluorescentes geneticamente acoplizadas espectralmente distintas. Ao acoplar as informações genéticas de uma proteína florescente foto-ativada a uma proteína espectralmente distinta sempre em réguas internas de proteína fluorescente são criadas que ainda serão expressas a uma quantidade total desconhecida, mas em uma quantidade relativa conhecida fixa de um para um. Para começar a construir os plasmídeos como descrito no protocolo de texto que acompanha. Além disso, cultura na linha celular padrão em seu meio de perspectiva usando a versão livre de fenol vermelho. Quando estiver pronto para começar o experimento, colde as células usando trippsina sem fenol vermelho para reduzir a florescência de fundo. Após a colheita, encha uma pipeta de 2 ml com a suspensão celular de uma cultura celular confluente cultivada em um frasco de cultura celular T 12.5. Adicione uma gota em cada câmara de um escorregador de vidro de oito câmaras. Incubar o slide sob condições padrão de cultura celular por 24 horas. Em seguida, transfem as células usando reagentes comerciais seguindo o protocolo dos distribuidores. Transfectar as células com as quimeras GFP Cherry, PA-GFP Cherry e GFPPA Cherry. Em seguida, devolva as células à incubadora para permitir a expressão proteica, dobramento e maturação. Após um total de 20 horas após a transfecção, transfira as células para o estágio de um microscópio florescente confocal equipado com a câmara ambiental umidificada e aquecida pré-aquecida para 37
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo que utiliza proteínas fotoativáveis e fluorescentes geneticamente acopladas e espectralmente distintas. Essas quimeras permitem a quantificação da eficiência de fotoativação da fração de proteínas fotoativáveis que se torna fluorescente, revelando que diferentes modos de fotoativação resultam em eficiências variáveis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Tecnologia de Proteínas Fluorescentes
- Técnicas de Fotoativação
Contexto
- As proteínas fluorescentes são ferramentas essenciais na pesquisa biológica.
- As proteínas fluorescentes fotoativáveis permitem o controle espaciotemporal da fluorescência.
- Compreender a eficiência de fotoativação é crucial para resultados experimentais precisos.
- Diferentes métodos de ativação podem influenciar o desempenho dessas proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para avaliar a eficiência de fotoativação.
- Comparar os efeitos de diversos modos de fotoativação.
- Ampliar a utilidade das quimeras de proteínas fluorescentes na pesquisa.
Métodos Utilizados
- Acoplamento genético de proteínas fotoativáveis e fluorescentes.
- Quantificação da fração fotoativada.
- Comparação de diferentes técnicas de fotoativação.
- Análise das eficiências de fotoativação.
Resultados Principais
- Diferentes modos de fotoativação resultaram em eficiências variáveis.
- O protocolo quantificou com sucesso a eficiência de fotoativação.
- As quimeras de proteínas fluorescentes demonstraram potencial significativo para aplicações em pesquisa.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar estudos futuros que utilizem proteínas fotoativáveis.
Conclusões
- O estudo fornece um protocolo valioso para pesquisadores.
- Compreender a eficiência de fotoativação é essencial para o planejamento experimental.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes resultados para otimizar o uso de proteínas fluorescentes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da eficiência de fotoativação de proteínas fluorescentes preenche uma lacuna crítica na imagem de células vivas, permitindo uma interpretação mais confiável do comportamento dinâmico das proteínas. Essa capacidade apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios ao fornecer um parâmetro mensurável para o desempenho de sondas fotoativáveis. A melhoria na confiança preditiva da ativação da sonda reduz a ambiguidade mecanicista em aplicações posteriores, como triagem fenotípica e estudos translacionais de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da fração de proteínas fotoativáveis ativadas com sucesso.
- Valor Operacional: Fornece um controle interno ratiométrico para normalização da variabilidade de expressão entre células.
- Valor Preditivo: Apoia a identificação de compostos líderes ao permitir a comparação das eficiências de fotoativação entre diferentes variantes proteicas ou condições.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera leituras quantitativas padronizadas da eficiência de fotoativação para otimização de ensaios.
- Reprodutibilidade: Utiliza padrões internos geneticamente acoplados para garantir expressão relativa consistente entre réplicas experimentais.
- Escalabilidade: Compatível com formatos em massa e de células vivas, permitindo integração em fluxos de trabalho de triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Facilita a desmistificação mecanicista ao vincular a eficiência de fotoativação a leituras funcionais em sistemas relevantes para doenças.
- Confiabilidade Preditiva: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base no desempenho quantitativo da fotoativação.
- Alinhamento com Biomarcadores: Apoia o desenvolvimento de repórteres fotoativáveis para o rastreamento longitudinal em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até o desenvolvimento de ensaios e avaliação pré-clínica, especialmente nos casos em que é necessária a controle espacial e temporal da atividade proteica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação da fração ativada de sondas fotoativáveis em células vivas.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de medição ratiométrica independente dos níveis absolutos de expressão.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (fração de fotoativação) que permitem a comparação de modos de ativação.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao possibilitar a avaliação padronizada de repórteres fotoativáveis em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar qualquer par de proteínas fluorescentes fotoativáveis espectroscopicamente distintas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no desempenho de sondas fotoativáveis e reduz resultados falsos negativos em ensaios baseados em ativação.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios e configurações experimentais.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou não na seleção de sondas, fornecendo dados quantitativos sobre eficiência de ativação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de ferramentas fotoativáveis com base em métricas de desempenho validadas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular para gerar quimeras de proteínas fluorescentes geneticamente acopladas.
- Depende do acesso a microscopia de fluorescência confocal ou de campo amplo com capacidades de fotoativação.
- Necessita padronização dos parâmetros de imagem e protocolos de fotoativação entre diferentes usuários.
- Exige validação da funcionalidade da quimera e da separação espectral na linhagem celular-alvo.
- Limitado a sistemas nos quais o acoplamento genético de fluoróforos não prejudica a função ou a localização da proteína.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:20
Cell Culture and Transfection
2:31
Imaging and Photoactivation
5:45
Imaging Analysis and Algorithm for Ratiometric Intensity-based Quantification of Photoactivation Efficiency
9:09
Results: Maximizing Photoactivation Efficiency
9:50
Conclusion
