Name: Expressão independente de metanol por Pichia Pastoris , empregando tecnologias de repressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprenda a expressão de proteínas recombinantes sem metanol em Pichia pastoris usando promotores regulados por fonte de carbono. Este método permite monitoramento online de parâmetros de cultivo para otimização do rendimento proteico.

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ROBOX recebeu financiamento do projeto da União Europeia (UE) ROBOX (concessão acordo n ° 635734) sob o Horizonte 2020 programa de investigação e inovação da UE ações H2020-LEIT BIO-2014-1. As visões e opiniões aqui expressados são apenas dos autores e não refletem necessariamente aquelas da Agência de investigação da União Europeia. A União Europeia não é responsável por qualquer uso que pode ser feito das informações contidas neste documento.
A tese de doutorado de J. Fischer é co-financiado por uma concessão para "Industrienahe dissertação" da Agência de financiamento austríaco FFG.
Agradecemos Gernot John (PreSens GmbH) as discussões útil e valiosa contribuição para o projecto do manuscrito.

1. preparação de mídia
<ol><li>Preparação de mídia mínima tamponada (BMG com glicerol, BMD com glicose como fonte de carbono) (1 L)<ol>
<li>650 mL de água destilada em uma garrafa de vidro de tampa de rosca de 1 L de autoclave. Depois de arrefecer, completar o médio adicionando-se 100 mL de autoclavado 10 x YNB (134 g/L base de nitrogênio levedura w/o aminoácidos), 200 mL de tampão fosfato de potássio (1 M, pH 6), 30-100 mL de 10% p/v glucose ou glicerol (dependendo da quantidade de biomassa gerada desejado durante o lote), água destilada, 2 mL de estéril 500 x solução de biotina (10 mg/mL) e encha até 1 L com estéril. Nota: Todos os ingredientes devem estar autoclavados em frascos separados. Biotina é destruída quando autoclavados e, portanto, tem de ser esterilizado com 0,2 µm filtros de membrana de filtro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mídia rica tamponada (BYPG) (1 L)<ol>
<li>700 mL de água destilada com 1% w/v levedura extrato e 2% p/v peptona em um frasco de tampa de rosca de 1 L de autoclave. Depois de arrefecer, adicione 30-100 mL do glicerol a 10% w/v autoclavados separadamente, 200 mL de tampão fosfato de potássio (1 M, pH 6) e encha até 1 L com água destilada estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. agitar frascos preparação
<ol><li>Adicionar 5 mL de água destilada no 250 mL perplexo agitar frascos, cubra-o com duas camadas de tecido de algodão e fixá-lo com um elástico. Cobrir o pano com um pedaço de papel alumínio.</li>
	<li>Autoclave os frascos a 121 ° C por 20 min para esterilização completa.</li>
	<li>Retire água residual do frasco e alíquota de 50 mL dos meios de comunicação previamente preparados para cada balão.</li>
</ol>3. durante a noite inoculação da cultura
<ol><li>Começa uma cultura durante a noite (ONC) com uma única colônia fresca da estirpe desejada expressão em 5 mL de YPD (extrato de levedura 1% p/v, peptona 2% p/v, glicose 2% p/v) em um tubo de centrífuga de 50 mL, deixando a tampa um pouco aberta para permitir a aeração adequada.</li>
	<li>Deixe crescer durante a noite a 28 ° C, umidade de 80%, em uma coqueteleira a 100-130 rpm (tremendo de 2,5 cm de diâmetro).</li>
</ol>4. medida instalação e cultura principal cultivo
<ol><li>Para configurar o sistema de monitoramento on-line, siga as instruções do fabricante para a calibração adequada dos dispositivos.</li>
	<li>Coloque um computador, onde o software apropriado para monitoramento é instalado no intervalo de uma conexão Bluetooth para as estações de medição. Inicie o software para conectar os dispositivos através de Bluetooth.<ol>
<li>Ative a conexão Bluetooth do dispositivo de medição de biomassa, pressionando o botão prateado na frente.</li>
		<li>No software, clique em dispositivos , em seguida, Encontrar dispositivos. Nota: Os dispositivos devem aparecer como uma lista na janela abaixo da linha da tarefa. Se não o fizerem, é aconselhável verificar se a bateria estiver carregada e o computador está ao seu alcance para uma conexão Bluetooth.</li>
		<li>Arraste e solte os dispositivos encontrados aos quadrados no lado direito da tela Bandeja de medição.</li>
		<li>Clique em conectar. Nota: Quando a conexão foi bem sucedida, aparece uma tela de controle.</li>
		<li>Para iniciar um teste para a conexão de Bluetooth, clique em medição.</li>
		<li>Configure o experimento.<ol>
<li>Clique em Iniciar a medição, nome do experimento e permitir que todos os parâmetros necessários para monitorar. Nota: As licenças são necessárias para cada um dos possíveis parâmetros medidos.</li>
			<li>Definir o intervalo de 3 min. Nota: O intervalo determina quantas vezes pontos de medição são tomados e cada ponto de medição resulta em um valor depois. Medir cada minuto é muito preciso, mas muitos dados são gerados que o torna mais trabalhoso avaliar.</li>
			<li>Definir Pontos de medição de média de 11. Nota: Essa configuração determina quantos pontos de medição são realmente tomados a cada 3 min. Portanto, a saída é o valor médio de 11 pontos de medição mais 11 s.</li>
			<li>Insira os nomes para as amostras.</li>
			<li>Ignore a próxima tela, como o ângulo já foi calibrado antes (passo 4.1). Nota: Aconselha-se um teste para a conexão de Bluetooth antes de inocular as principais culturas para assegurar conexões estáveis e local apropriado do computador conectado. Além disso, as baterias devem ser cobrados.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a densidade de células da ONC (passo 3.1) diluído em meios de cultivo (01:20) em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm. Inocular 50 mL do meio (recomendado a concentração de carbono fonte 0,3-1%, possível de diferentes meios de comunicação, conforme descrito na etapa 1.) com a ONC para uma OD600 de 0.05 usando o seguinte cálculo. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq1.jpg">
</li>
	<li>Coloque os frascos com os detectores e agitar em 28 ° C, 130 rpm e 80% de umidade. Nota: É muito importante dar a cultura 5 min de agitação antes de iniciar a medição para evitar células furar a parte inferior do frasco e produzindo valores errados.</li>
	<li>Clique em Iniciar a medição no software.</li>
	<li>Colher amostras de 0,2 mL para medição de densidade celular 4h após a inoculação, e quando a fonte de carbono fica empobrecido (determinação descrita na etapa 4.7) em triplica. Diluir as amostras adequadamente em meios de cultivo (primeira medição 1:5, segunda medição 01:20) e medir a absorção no comprimento de onda de 600 nm em um espectrofotômetro. Antes de retirar os frascos e mesmo antes de parar o abanador, sempre pause a medição no software. Nota: Os detectores são calibrados para gravar os parâmetros sob condições definidas de agitação e renderão para medições de bobagens durante a gravação de culturas ainda. Além disso, certifique-se de sempre esperar 5 min de agitação antes de começar a medir novamente. As medições de densidade celular são essenciais porque o detector está entregando apenas valores de biomassa e densidade de pilha não é real. Uma função de calibração entre os valores de600 OD (x valores) e os valores obtidos pelo sistema de medição on-line (valores de y) podem ser conseguidos por vários momentos de medição espectrofotometricamente. Os valores são não em um linear, mas em uma relação logarítmica de acordo com a função de calibração a seguir: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq2.jpg"> y: valores de600 OD obtidos por espectrofotômetro x: valores obtidos pelo sistema de medição on-line k: inclinação d: interceptação do eixo A inclinação e o eixo podem ser usados para converter qualquer valor para o valor correspondente de600 OD. No Excel pode-se plotar os valores de600 OD espectrofotometricamente obtidos contra os valores do sistema on-line de Commit do mesmo. A adição de uma linha de tendência logarítmica e a correspondente equação dar-se-á a função de calibração mostrada acima.</li>
	<li>Cultive até a fonte de carbono é quase empobrecido (App. 12-20 h). Para esse efeito, deixe as culturas crescem até que pode ser visto em diagramas de software que a concentração de oxigênio se aproxima de zero, e as células estão em fase de crescimento exponencial. Nota: Este é o caso para as concentrações de fonte de carbono utilizada no presente protocolo. O Commit de esgotamento da fonte de carbono pode ser determinado com o sistema de monitoramento on-line, como é mostrado exemplarily na Figura 1 , na seção de resultados de representante, quando o nível de oxigênio se aproxima de zero e as células estão em crescimento exponencial fase.</li>
</ol>5. a proteína expressão pela repressão de
<ol><li>Quando é alcançado o Commit descrito no passo 4.6, começa a alimentar as culturas pela adição de quatro discos de alimentação por balão sob condições estéreis. Nota: Nas condições descritas, quatro discos de alimentação de glicerol liberar glicerol 2 mg/h de acordo com o fabricante.</li>
	<li>Continuar o cultivo de 60-90 h ao tomar amostras a cada 24 h para monitorar a expressão da proteína por um ensaio de escolha (EG., Bradford ensaio15, SDS PAGE16 ou atividade ensaios) e medições de densidade de células.</li>
</ol>6. cultura da colheita
<ol><li>Após o 60-90 h do cultivo, encha as culturas em tubos de centrífuga de 50 mL para a colheita por centrifugação a 4.000 x g, 4 ° C por 10 min. Nota: O sobrenadante (para proteínas secretados) ou as células (intracelular na expressão de proteínas) podem ser colhidas por centrifugação a 4.000 x g, 4 ° C por 10 min e mais análises podem ser feitas.</li>
	<li>Exporte os dados de medição on-line como um arquivo de planilha do software para uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Encha a 5-10 mL de água destilada para todos os frascos e autoclave para inactivar as células restantes.</li>
</ol>

<ol><li>Bill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Playing+catch-up+with+escherichia+coli%3A+Using+yeast+to+increase+success+rates+in+recombinant+protein+production+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments.</a> Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1385/MB:16:1:23">Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris).</a> Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).</li>
<li>Vogl, T., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Pichia+pastoris+promoters+and+its+consequences+for+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production.</a> New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).</li>
<li>Rußmayer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+organization+of+yeast+methylotrophic+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle.</a> BMC Biology. 13 (1), 80(2015).</li>
<li>Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peroxisomal+proteins+and+organelle+proliferation+by+multiple+carbon+sources+in+the+methylotrophic+yeast%2C+Candida+boidinii%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii.</a> Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).</li>
<li>Hartner, F. S., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+methanol+utilisation+pathway+genes+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 5, 39(2006).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toolbox+of+Diverse+Promoters+Related+to+Methanol+Utilization%3A+Functionally+Verified+Parts+for+Heterologous+Pathway+Expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).</li>
<li>Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+lignocellulolytic+enzymes+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris.</a> Microbial Cell Factories. 11 (1), 61(2012).</li>
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<li>Jeude, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fed-batch+mode+in+shake+flasks+by+slow-release+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+slow+glucose+feed+cultivation+of+Pichia+pastoris+without+repression+of+AOX1+promoter%3A+towards+high+throughput+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).</li>
</ol>

Embora o protocolo apresentado é geralmente aplicável para cultivo e indução sob condições derepressed, bisy União Europeia declara ter interesse na comercialização dos novos promotores derepressed utilizado neste estudo.

Esse método apresenta um protocolo confiável para metanol eficiente inducible expressão independente de p. pastoris como uma alternativa para expressão de proteínas de metanol clássica induzido impulsionado por PAOX112. Promotores de repressible, como o PDC, o PDF ou descrito anteriormente mutante PAOX1 variantes17, constroem a base molecular para este novo conceito de produção de proteína. Os mostrado resultados representativos sublinham a utilidade e a exequibilidade da expressão de proteínas recombinantes em p. pastoris pelos promotores de reprimida e triagem em pequena escala com simples monitoramento on-line. Por um lado, o metanol nocivo e tóxico que normalmente é usado para a indução do promotor AOX1 pode ser eliminado a partir do cultivo. Por outro lado, o crescimento e a fase de produção de proteína são desacopladas9 em contraste com a expressão de proteínas constitutivas, por exemplo., com o comumente usado PGAP. Isto é especialmente benéfico quando as células devem expressar proteínas tóxicas ou nocivas que exibem um fardo para eles.
A possibilidade de iniciar os cultivos com concentrações de fonte de carbono diferentes permite que a decisão de quanta biomassa um gostaria de ganhar antes da fase de produção de proteína começa. Ao escolher uma baixa concentração de fonte de carbono no lote, limitações de transferência de oxigênio devido a densidades de pilha demasiado elevada podem ser reduzidas, enquanto por outro lado maiores densidades de pilha também podem resultar em maior concentração de proteína. Ao monitorar o desenvolvimento da cultura em termos de geração de biomassa e as concentrações de oxigênio, o ponto ideal de tempo para iniciação alimentados em lotes pode ser determinado facilmente como é mostrado na Figura 1.
Para o monitoramento on-line desses parâmetros de cultivo, deve ser aplicado um sistema de medição adequados. A biomassa (por exemplo, SFR Vario) dispositivo de medição é um simples e sistema de medição on-line econômico para cultura monitoramento em agitar frascos. O leitor optoelectronic determina o crescimento de células no balão através de detecção de luz dispersa e lê o sinal do sensor de oxigênio, integrado no frasco. A ótica para medição de biomassa consistem de um LED que emite um sinal luminoso, que é espalhado por partículas (células) do caldo de cultura e detectado com um fotodiodo. Os sensores ópticos emitem fluorescência quando excitado com a luz de um determinado comprimento de onda. Dependendo da quantidade de moléculas do analito presentes, este sinal de fluorescência muda, que é detectado pela óptica do leitor e traduzida em valores de concentração. No entanto, uma calibração de medição de densidade celular tem que ser estabelecida previamente, desde que o sistema de medição não é medir valores de600 reais do OD. A taxa de absorção de oxigênio pode ser calculada a partir do declive da curva de oxigênio com o software do leitor, e a temperatura, bem como o rpm é registradas continuamente junto com os outros parâmetros. Para habilitar o monitoramento com este sistema, os frascos de agitação tem que anteriormente ser equipados com os sensores apropriados para os parâmetros desejados.
Pela adição de polímero de liberação lenta quatro discos fornecendo uma quantidade constante de glicerol para o caldo de cultura, acúmulo de biomassa está quase parado, e produção de proteína recombinante é continuada. A determinação do ponto de tempo de adição de disco feed não é um passo crítico neste experimento, mas deve-se considerar que um prematuro iniciar alimentação antes da fase de crescimento exponencial poderia ser inibindo a ativação do promotor, como a expressão começa em cima depleção de fonte de carbono. Além disso, o total de tempo devido às limitações de capacidade de polímero de alimentação pode ser reduzido, Considerando que atrasar o feed depois que as células têm atingido a fase estacionária pode levar à fome e degradação do já produzido proteína. A quantidade de alimentação discos utilizados neste protocolo foi determinada experimentalmente para a liberação de fonte de carbono ideal manter o promotor de reprimida, mantendo a geração de biomassa baixa (dados não mostrados). Desta forma, os cultivos podem ser realizados facilmente mais de 160-180 h sem qualquer intervenção.
Aplicações principais deste novo protocolo será no clone de expressão triagem, evolução de enzima e a descoberta, caracterização e engenharia de novos promotores empregando um protocolo de cultivo livre de metanol em condições bem monitorados. Em princípio, o mesmo protocolo deve ser aplicável para estratégias de alimentação misturado empregando metanol e feeds de fonte de carbono fermentativa limitado como descritos por Panula-Perälä et al. em 2014,18.

Melhoria no rendimento e condições de cultivo confiável em grande escala para a produção de proteínas recombinantes por microorganismos tais como bactérias ou fungos é uma das maiores necessidades de biotecnologia1 hoje e o sucesso comercial do industrial aplicações. Procedimentos de cultivo simples dueto e mídia, altos rendimentos e ferramentas bem caracterizadas2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) é uma levedura amplamente utilizada não convencionais para a produção de proteínas recombinantes. Ferramentas inovadoras adicionais são constantemente desenvolvidas para esta espécie, como novos vetores de expressão, incluindo novos promotores como alternativas para o amplamente utilizado PAOX1, na região promotora do álcool oxidase 1 gene3, 4,5. Um 500 bp longa sequência de DNA montante do gene CAT1 (CTA1) foi identificada como a região do promotor, que permite que uma nova estratégia de expressão livre de metanol e versátil em p. pastoris. O gene CAT1 é o gene da catalase única de p. pastoris e a proteína está localizada nos peroxissomos. A catalase desempenha um papel importante na desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, que são decorrentes, por exemplo., da oxidação do metanol na via MUT Peroxissômicos ou durante a beta-oxidação de ácidos graxos6,7. A expressão do gene CAT1 é reprimida na presença de glicose ou de glicerol em meio de cultivo e derepressed após o esgotamento destes de fontes de carbono8. Além disso, a expressão do gene da catalase pode ser induzida com metanol e remarkebly também com ácido oleico, sendo aparentemente o único gene da via de p. pastoris MUT que pode ser induzida com ácido oleico mesmo a atingir níveis de expressão similar como com indução de metanol9.
O fragmento de bp 500 este promotor de p. pastoris CAT1 , que é chamado de PDC (às vezes também abreviado PCAT1-500), já foi testada para a produção de proteínas intracelular expressadas e secretadas e provou para ser um uma alternativa atraente para os clássico de dois promotores de p. pastoris – o forte constitutiva PGAP e o metanol inducible PAOX1, que foram desenvolvidos há mais de 20 anos. O PDC foi capaz de chegar a 21% (CalB) e 35% (HRP) das actividades volumétricas em comparação à PGAP em meio rico de açúcar. Após indução de metanol, o PDC não só respondeu mais rápido do que o de PAOX1, mas também claramente poderia superar isso por um 2,8 vezes maior título final do CalB9.
Além do PDC, um promotor de ortólogos (PDF) tinha sido identificado exibindo um perfil similar do regulamento. No entanto, é significativamente mais forte do que o PDC abaixo dos derepressed, bem como em induzida por metanol condições (manuscrito em preparação)3.
Em casos onde o forte constitutiva PGAP falhou devido a fisiologicamente problemático ou citotóxicos proteínas10,11, o PDC e o PDF representam uma alternativa ideal. Em experiências em micro escala, a expressão conduzida por estes promotores começa após o esgotamento da fonte de carbono inicial (ex., glicose ou glicerol), que facilita a produção de biomassa sem sobrecarregar as células com a superexpressão de a proteína recombinante desde o início. Enquanto ambos esses promotores são ainda inducible por metanol, a ativação por derepression faz uso adicional da fase preinduction, em comparação com as expressões empregando PAOX1. Além disso, o PDC e PDF podem ser usado para a produção de proteína livre de metanol, que é um objetivo desejável para grandes processos industriais12.
Para o desenvolvimento de cepas de produção aplicável e construções de expressão, várias etapas no desenvolvimento tem que ser passado a fim de estreitar-se de um grande número de transformants para o candidato preferido para aumentar. Sessões geralmente são realizadas em alto throughput em placas multi bem (micro escala: menos de 0,5 mL) a fim de capturar uma série de clones tão grandes quanto possível. Posterior re-seleção e re-re-screening são o próximo passo, seguido por shake de balão (pequena escala: 50-250 mL) ou (micro-) biorreator12sessões. No entanto, é desejável ter um método, que é a mais similar entre as diferentes escalas de centenas de microlitros em placas de poços profundos até vários mililitros em agitar frascos até mais tarde aumentar de produção livre de metanol em bem controlados biorreatores. Embora agitar frascos podem fornecer volumes já similares como biorreatores pequenos, existem várias limitações, que são altamente relevantes para a produção de proteína em larga escala como alimentação constante, aeração e monitoramento on-line13 de crescimento e suprimento de oxigênio. Empregando monitoramento óptico adaptado agitar frascos e agitação dispositivos fornecem uma alternativa econômica para o equipamento mais sofisticado para cultivo paralelo enquanto continua a fornecer tais como constantes on-line informações sobre parâmetros importantes da cultura biomassa e concentração de oxigénio dissolvido. Liberação lenta de fonte de carbono de transportadoras de polímero pode ser aplicada para garantir uma alimentação constante e controlada, sem depender de soluções técnicas complexas e dispositivos, simulando condições mais semelhantes de biorreatores do que simples plenamente aplicada anteriormente depleção de carbono fonte9,10, onde a energia para a expressão da proteína em curso torna-se limitando.
O método a seguir descreve um pequeno para expressão de proteínas livre de metanol controlável de média escala sistema em p. pastoris baseado em novos promotores PDC e PDF. Indução por derepression envolve duas fases. Uma primeira fase curta de acúmulo de biomassa sem a produção da proteína de interesse, usando uma fonte de carbono que reprime os promotores e uma segunda fase de produção de proteína alvo, onde uma fonte de carbono é fornecida em concentrações pequenas, mas constantes mantendo o promotor derepressed. Monitoramento on-line de parâmetros mais críticos do cultivo é aplicado durante o período inteiro de cultivo. O objetivo era fornecer um sistema de cultivo confiável e escalável, metanol livre para p. pastoris.

<table><tbody><tr><td>Extrato de levedura Bacto</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Frasco defletor 250 mL</td><td>DWK Ciências da vida</td><td>212833655</td><td></td></tr><tr><td>BBL Phytone Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>298147</td><td></td></tr><tr><td>Biofotômetro</td><td>Eppendorf AG</td><td>5500-200-10</td><td></td></tr><tr><td>Certoclav-EL</td><td>CertoClav GmbH</td><td>9.842 014</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura Difco com o aminoácidos</td><td>BD Biosciences</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Discos de alimentação glicerol</td><td>Adolf Kuhner AG</td><td>315060</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-monohidrato</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6887</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol &ge; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6875</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard&nbsp;</td><td>Infors AG</td><td>444-4226</td><td></td></tr><tr><td>SFR Vario v2</td><td>PreSens GmbH</td><td>200001689</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão independente de metanol por pichia pastoris , empregando tecnologias de repressão

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

O metanol é uma fonte de carbono bem estabelecida e indutor para a produção de proteína eficiente empregando Pichia pastoris (p. pastoris) como um host em escala micro, laboratório e industrial. No entanto, devido à sua toxicidade e inflamabilidade, há um desejo de evitar o metanol, mantendo a alta produtividade de p. pastoris. Cultivos de biorreator de pequena escala (0,5-5 volume de trabalho L) são comumente usados para avaliar uma estirpe e suas características de produção de proteína, pois microescala cultivo em placas de poço profundo pode ser mal controlado ou se baseia em um equipamento caro. Além disso, protocolos tradicionais para o cultivo e a indução de p. pastoris foram estabelecidos para indução de expressão ou metanol constitutiva e, até agora, que nenhum confiáveis protocolos foram descritos para a expressão de p. pastoris de tela cepas de derepressible promotores em cultivos paralelos (controlados e monitorados). Para simplificar esses cultivos iniciais para caracterizar e comparar novas cepas de produção de proteína, nós estabelecemos um sistema de cultivo de balão simples agitar para metanol livre expressão que simula condições de biorreator incluindo um glicerol lenta constante alimentar e monitoramento on-line, assim, aproximar-se às condições reais de biorreatores em comparação com cultivos de lote na maior parte aplicada em pequena escala. Para dirigir a expressão de proteínas recombinantes em p. pastoris, a fonte de carbono reprimida promotores PDC e PDF foram aplicados. Polímero discos com fonte de carbono incorporado, liberando uma quantidade constante de glicerol, garantida uma taxa de alimentação, fornecendo a energia necessária para manter os promotores ativo, mantendo a geração de biomassa baixa.

Conforme descrito na seção de protocolo, o software grava os parâmetros de cultivo importante sobre o cultivo de todo. A Figura 1 mostra a visualização do desenvolvimento da biomassa e a concentração de oxigênio durante um cultivo começado com 0,5% (figura 1A) ou fonte de carbono de 0,3% (figura 1B) do lote, seguido pela adição de glicerol alimentar discos. O sistema de monitoramento on-line é especialmente útil para os cultivos de reprimida como o Commit de esgotamento da fonte de carbono após o lote pode ser determinado exatamente. Como pode ser visto na Figura 1, a concentração de oxigênio no meio está diminuindo rapidamente e próximos de zero, especialmente para 0,5% de glicerol no lote (figura 1A) enquanto a biomassa está aumentando exponencialmente neste ponto. Aqui, as células estão em fase de crescimento exponencial, e a fim de fazer o melhor uso da versão de fonte de carbono, pouco antes da cultura atinge a fase estacionária, os discos de alimentação devem ser adicionados como é descrito no protocolo. A adição dos discos alimentação antes que a concentração de oxigênio atinge zero é importante de reprimidas na expressão de proteínas evitar que as células de limitação de oxigênio. Concentrações de glicerol reduzem o efeito de curto prazo limitações de oxigênio, como pode ser visto na figura 1B e, portanto, são recomendados para a expressão da proteína de reprimida.
A seguir, os resultados do cultivo de diferentes dois experimentos – empregando o protocolo descrito e o sistema de monitoramento, mostrado na Figura 1 – são descritos. No primeiro experimento, uma estirpe de p. pastoris , produzindo a glicose oxidase de Aspergillus niger (a. niger) sob o controle do PDC e no segundo uma estirpe de p. pastoris , produzindo o hormônio do crescimento humano sob o controle da PDF é mostrado.
Neste experimento, foi investigada a produção de glicose oxidase sob o controle do PDC . Portanto, estratégias de cultivo diferentes foram comparadas: pulsando de glicerol, o glicerol constante alimentar pela adição de alimentação discos e cultivo sem qualquer alimentação ou pulsante. O cultivo foi feito em media mínimos no buffer de 50 mL com 0,5% de glicose como fonte de carbono único em frascos de 250 mL shake (tabela 1).
Ao cultivo de 160H, obtiveram-se as maiores concentrações de biomassa, quando uma estratégia alimentar usando um lote de glicose para a produção de biomassa (h-38) e glicerol pulsando (0,25% glicerol w/v após 38 h, h 61 e 86 h cultivo) foi empregado (total 0,21 g/L secretora proteína, 8.4 U/mL). Apesar de uma redução de 2 vezes a concentração de biomassa e a quantidade total de proteína secretada foram obtidos, quando os discos de alimentação foram adicionados depois lote de glicose 38 h, a atividade volumétrica foi até 1 U/mL superior em comparação com o cultivo usando glicerol pulsando . Isso indica que uma quantidade substancial de proteína secretada não contribui para a atividade volumétrica no sobrenadante e pode ser secretada em uma forma inativa. Portanto, altas concentrações de glicerol de pulsos de glicerol aparentemente favorecem a formação de biomassa em vez de produção de proteína alvo e lançamento de glicerol baixa constante levado à mais de duas vezes maior produtividade específica.
Outro experimento empregando o método de eliminação reprimida expressão foi feito por expressar o hormônio do crescimento humano (hGH) sob controle de PDF. A construção foi integrada estàvel no genoma de p. pastoris estirpe BSYBG11. Aqui, 50 mL de BYPG, tampão médio rico, 250ml perplexo agitar frascos foi utilizado com 0,3% (p/v) glicerol como fonte de carbono no lote. Após o esgotamento de glicerol, a expressão da proteína com glicerol constante alimentar foi assegurada pela adição de 4 avanço discos por balão e em comparação com nenhuma glicerol alimentar (Figura 2).
A Figura 2 mostra a comparação entre a expressão de hGH e desenvolvimento da biomassa da mesma estirpe cultivada com e sem constante glicerol alimentar. Sanduíche de ensaio ELISA foi usada com o anticorpo secundário fundido ao HRP e deteção foi realizada com 3,3′, 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) como substrato. Especialmente para esta proteína, parecia ser o caso que sem qualquer alimentação, as células começam a se degradar a proteína produzida após aproximadamente 30 h (luz azuis quadrados), Considerando que o alimentando, esta degradação pode ser impedido (triângulos azuis escuros) e até mesmo o concentração de proteína por biomassa ainda aumentou após 150 h de cultivo. Como já observado por Hansenula polymorpha14, este resultado mostra como mudar de lote, que é usado geralmente na escala de balão agitar, ao modo de lote alimentado pode otimizar cultivos de p. pastoris .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig1.jpg"> Figura 1: visualização do online gravado parâmetros durante dois cultivos com concentrações diferentes de glicerol no lote. Os cultivos foram iniciados com 0,5% p/v (A) e glicerol de 0,3% p/v (B) do lote, seguido por fase de repressão, onde as células foram alimentadas pela aplicação de 4 discos de alimentação por balão (liberar a taxa de 0,5 mg/h/disco de acordo com o fabricante). As linhas tracejadas mostram a concentração de oxigênio no meio, enquanto as linhas contínuas mostram a densidade celular (OD600). Barras de erro mostram que o desvio-padrão de seis repetições (2 biológico, técnico três cada). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig2.jpg"> Figura 2: comparação da expressão do hormônio do crescimento humano (hGH) no modo em lotes e lotes alimentados. conteúdo de hGH é indicado por valores de absorção em 405 nm por um ELISA onde o anticorpo 2nd foi uma fusão de HRP e TMB foi usado como um substrato para a deteção. São mostrados os resultados de duas culturas diferentes: luz azul visor linha e praças, a densidade celular e concentração de hGH normalizado as densidades de célula de uma cultura sem qualquer alimentação após o lote, em comparação com uma cultura, onde o glicerol alimenta discos foram aplicada (linhas de azuis escuras e triângulos). Barras de erro mostram que o desvio-padrão de seis repetições (2 biológico, técnico três cada). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">PDC- GOX, ao tempo de cultivo 160H</td>
			<td colspan="2">OD600</td>
			<td colspan="2">atividade Vol. [U/mL]</td>
			<td colspan="2">quantidade total de proteína secretada [mg/mL]</td>
			<td>actividade aferida por densidade celular</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quer dizer</td>
			<td>SD</td>
			<td>Quer dizer</td>
			<td>SD</td>
			<td>Quer dizer</td>
			<td>SD</td>
			<td>Quer dizer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lote de % BMD1 + glicerol pulsando</td>
			<td>74,6</td>
			<td>2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lote de % BMD1 + glicerol constante alimentar</td>
			<td>32.5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>9.4</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0,29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lote de BMD1%</td>
			<td>18,8</td>
			<td>0.6</td>
			<td>3.7</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: resultados de expressão independente de GOX metanol sob o controle do promotor de reprimida PDC .

Este método pela primeira vez descreve procedimentos experimentais confiáveis para produção de proteína recombinante isento de metanol inducible eficiente em Pichia pastoris (Komagataella phaffii), empregando os promotores de fonte regulada de carbono P DCe PDF em experiências de pequena escala, enquanto o cultivo parâmetros podem ser monitorados on-line, e um feed de glicerol constante é aplicado.

Expressão independente de metanol por Pichia Pastoris , empregando tecnologias de repressão

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Este método pode ajudar na pré-seleção de clones de cromossomos por pichia pastoris cepas expressando proteínas recombinantes sob condições desprimidas por um simples shake flask cultivos antes de escalar. A principal vantagem dessa técnica é que a expressão proteica livre de metanol de alto nível pode ser alcançada usando Pichia pastoris, que é apoiada pelo monitoramento on-line exato de importantes parâmetros de cultivo. Geralmente, indivíduos novos nesse método podem lutar porque o ponto de tempo para iniciar a alimentação de cultivo de vidro tem que ser adaptado às características de crescimento da cepa de produção específica.Antes de montar a cultura principal, semeou uma única colônia fresca da expressão de interesse em 5 ml de pepto de levedura e caldo de dextrose em um tubo cônico de 50 ml. Deixe a tampa ligeiramente aberta para permitir a aeração adequada. Do que, coloque a cultura em um shaker a 28 graus Celsius, 80% de umidade e 100 a 130 RPM durante a noite.Na manhã seguinte, inicie o software para conectar os dispositivos via Bluetooth. Em seguida, pressione o botão prata na parte frontal do dispositivo de medição de biomassa para ligar a conexão Bluetooth ao dispositivo e clicar em encontrar dispositivos no software de monitoramento do computador. Arraste e solte os dispositivos encontrados para os quadrados na bandeja de medição e clique em conectar.Quando uma conexão bem sucedida é feita, uma tela de controle aparecerá. Para configurar um experimento, clique na medição de início. Nomeie o experimento e verifique se todos os parâmetros necessários para o monitoramento estão ativados.Defina o intervalo para três minutos e a média de medição aponta para 11. Digite os nomes das amostras e pule a calibração do ângulo. Meça a densidade celular da cultura overnight diluída em uma proporção de um a vinte em meio de cultivo em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 600 nanômetros.Inocular 50 ml do meio com a cultura da noite para o dia para um OD 600 de 05. Do que, coloque os frascos nos detectores a 28 graus Celsius, 130 RPM e 80% de umidade por cinco minutos. Clique na medição iniciar no software.Quatro horas após a inoculação, use uma amostra de 2 ml para medição da densidade celular como apenas demonstrado. Quando a concentração de oxigênio está se aproximando de zero e as células estão na fase de crescimento exponencial adicione quatro discos de alimentação de glicerol a cada frasco sob condições estéreis. Do que, devolva os frascos à incubadora por mais 60 a 90 horas.Pegue amostras a cada 24 horas para monitorar a densidade celular e a expressão proteica pelo ensaio de escolha. Ao final do cultivo, transfira as culturas para tubos cônicos de 50 ml para centrifugação. Exporte os dados de medição on-line como um arquivo de planilha do software para análise suplementar.Neste cultivo representativo, a concentração inicial de glicerol foi de 5% Embora os discos de alimentação tenham sido adicionados quando a biomassa estava aumentando exponencialmente, o oxigênio diminuiu para quase zero. Concentrações de glicerol mais baixas reduziram o efeito das limitações de oxigênio a curto prazo e, portanto, são recomendadas para a expressão proteica desprimida. Neste experimento representativo em que o hormônio do crescimento humano foi expresso sob o controle de um promotor de fonte de carbono reprimido após o esgotamento do glicerol, a expressão proteica por despressão foi assegurada pela adição de quatro discos de alimentação por frasco.Como esperado, a expressão hormonal de crescimento humano e o desenvolvimento da biomassa aumentaram ao longo do tempo na presença dos discos de alimentação de glicerol, enquanto a expressão proteica diminuiu ao longo do tempo e a biomassa permaneceu constante na ausência do suplemento de glicerol. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de observar cuidadosamente os parâmetros de cultivo para determinar um tempo de início de expressão ideal. Após este procedimento, outros métodos como a determinação da concentração de proteínas ou ensaios de atividade podem ser realizados para avaliação de rendimento de proteínas, bem como experimentos bioreatores de pequena escala para responder a perguntas adicionais sobre o desempenho da cepa individual em uma escala maior.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da expressão proteica recombinante livre de metanol explorarem uma alternativa promissora ao promotor aoX1 dependente de metanol comumente usado em Pichia pastoris.

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Research

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