Name: Recuperação de Biocytin e reconstruções 3D de CA2 Hippocampal enchido interneurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprenda a recuperar biocytin e reconstruir interneurônios do hipocampo CA2 em 3D após registros eletrofisiológicos. Este protocolo preserva a ultraestrutura neuronal para análises anatômicas detalhadas.

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Esta pesquisa recebeu financiamento da Novartis Pharma (Basel) e o Conselho de pesquisa médica, atribuído a Prof Alex Thomson, a biotecnologia e biológicas Ciências do Conselho de pesquisa (BBSRC-BB/G008639/1), a sociedade Physiological, União Europeia Horizonte de 2020 programa-quadro de investigação e inovação sob o subsídio específico acordo n. º 720270 (cérebro humano projeto SGA1) e sob o acordo específico Grant n º 785907 (cérebro humano projeto SGA2). Somos extremamente gratos ao Prof Alex Thomson para configurar o protocolo em outras regiões corticais, financiamento e o seu contínuo apoio para este projeto. Contribuições feitas pelo laboratório-Membros, que ajudou a optimização do protocolo de recuperação e reconstruíram CA2 neurônios são reconhecidas com gratidão: Deuchars J. H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
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<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
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<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
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<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Eletrofisiológicos gravações em vitro (Figura 1 Ac,d e A.c., d) combinado com histoquímico e imuno-histoquímica procedimentos permitem a morfologia detalhada, conteúdo de proteína de ligação de cálcio e identidade do adultos interneurônios corticais registrado para ser revelado. Na região de CA2, esta técnica permitiu o estudo do circuito local pela primeira vez e revelou as subclasses de interneurônios que não tinham sido descritas anteriormente em CA1 ou CA3: células de cesta da árvore dendrítica e axonal larga (figura 1B), células bistratified e interneurônios SP-SR.
O protocolo descrito aqui foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de mandris axonal e dendríticas (incluindo espinhos). Passos críticos inclui o uso da técnica dupla fixação para realçar o contraste para microscopia de luz26 e a adição da solução de glutaraldeído e ácido pícrico à solução fixador para aumentar a penetração do anticorpo e preservar o neuronal ultraestrutura27. Permeabilização de congelamento-descongelamento suave dá melhor preservação de estrutura fina, enquanto osmication e resina incorporação reduzem encolhimento do plano z28. Além disso, a visualização de muito belas estruturas (multa axônios com pequenas boutons, por exemplo) é melhorada incubando-se as seções com H2O2 e NaBH4 reduzir a coloração de fundo. Contraste também pode ser aumentada com a adição de NiCl2 para a reação de HRP.
O procedimento histológico detalhado aqui oferece excelentes resultados em termos de confiabilidade e reprodutibilidade. No entanto, a duração das gravações eletrofisiológicas irá determinar a qualidade da coloração, com gravações mais curtas, geralmente associadas com coloração axonal pobre biocytin/fluorescência. A escolha de gravação de protocolos (intracelulares gravações usando eletrodos afiados vs aperto de células inteiras remendo) também pode influenciar o biocytin retenção e preservação da anatomia bem.
Enquanto as dificuldades encontradas na preservação de estrutura fina durante o processamento histológico, descrito aqui e o tempo necessário para reconstruir a ampliação de 100 X (1-4weeks dependendo da complexidade do axônio) são apreciados, este método dá um Represtação precisa de diâmetros dendríticas e axonal. O uso de menos exigentes protocolos para revelar biocytin-rotulagem é compreensível, no entanto, estas muitas vezes impedem a visualização clara de galhos finos axonal. Detergentes, para promover a entrada de avidina-HRP para revelar o biocytin e anticorpos, são muitas vezes necessárias em seções grossas, mas podem atrapalhar a estrutura fina. Neurocientistas busca constantemente para métodos semi-automático de reconstrução, mas, para agora e para axônios especialmente, biocytin-HRP com reconstrução manual continua a ser o padrão-ouro de31.
Altamente detalhados reconstruções neuronais, especialmente desenhos precisos de boutons axonal e nós, a presença ou ausência de mielina e mais geralmente o desenho da arbor axonal completa, com a representação do axônio-diâmetro exato muda ao longo de sua comprimento, fornecer mais informações para a identificação precisa de um tipo distinto de interneurone. Embora muitos interneurônios podem não se encaixam exatamente uma classe específica, a técnica descrita acima fornece dados correlacionados em Propriedades eletrofisiológicas neuronais, a plasticidade a curto prazo, associado a um tipo específico de conexão e detalhadas reconstruções neuronais, permitindo que o diagrama de fiação, na região de CA2, por exemplo, para ser estudado em detalhe.
Estrutura fina, detalhada é frequentemente simplificada em modelos computacionais. Embora compreensível, isto resulta na perda da informação que poderia provar crítica no futuro. Análise das reconstruções 3D detalhadas com dados paralelos sinápticas permitirá a adição de novos critérios para a classificação interneuronal. Dados podem ser depositados em repositórios públicos e usados por modeladores para explorar o resultado de mudanças esporádicas no diâmetro do axônio e mielinização na propagação do potencial de ação computacionalmente.

O córtex e hipocampo são estruturas de complexidade que a classificação de neuronal subtipos1,2,3,4, mapas das conexões entre eles5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 e como este circuito suporta funções cognitivas12,13,14,15 ainda estão sob intenso estudo e objecto de debate contínuo. Por exemplo, para entender os detalhes e complexidades do circuito e coordenar dados obtidos de muitos estudos diferentes, é extremamente útil ser capaz de definir e descrever os componentes, mas continua a ser tema de debate como muitos diferentes classes de neurônios existem, ou mesmo se é possível definir todos os neurônios como pertencendo a uma classe específica. Ferramentas computacionais que podem construir e testar circuitos com diferentes graus de complexidade estão sendo desenvolvidos16,17,18, mas central para estes empreendimentos é a necessidade de estudos detalhados, os tipos de células e as propriedades das conexões entre eles. Uma grande quantidade de informações sobre os circuitos locais do neocórtex de ratos adultos já foram coletada usando o protocolo descrito aqui10,19,20,21, 22. embora o "diagrama de fiação" está longe de ser completa, alguns limpar padrões ou regras surgiram. Além disso, embora alguns detalhes variam, estas regras são comuns a duas espécies de mamíferos (rato e gato) e através de várias regiões neocortical, permitindo o desenvolvimento de blocos de construção básicos que são susceptíveis de ser igualmente aplicável ao neocórtex humano. A técnica descrita aqui é usada para estender a nossa compreensão do mapa funcional de circuitos corticais identificando os neurônios pré-sináptica e pós-sináptica envolvidos nas conexões, nas regiões que não têm sido estudadas em detalhe antes, usando um protocolo Isso permite que tecido excelente preservação e recuperação de coloração notável no tecido do cérebro de um adulto. Foram coletados dados sobre os circuitos locais em CA2 e propriedades neuronais neste subcampo com este método combinando intracelulares eletrofisiológicas gravações (emparelhado com microeletrodos afiados) com biocytin de enchimento, imunofluorescência, procedimentos histológicos e reconstruções neuronais altamente detalhados, permitindo a comparação direta com o vizinho CA regiões23,24,25.
A técnica descrita neste artigo foi desenvolvida ao longo dos anos para obter detalhadas sobre anatomia neuronal, permitindo a correcta classificação das células e da alta qualidade e precisa reconstruções de ambos seus dendríticas e axonal mandris, dados que podem ser correlacionados com dados eletrofisiológicos coletados de emparelhados gravações usando eletrodos afiados. O protocolo histológico foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de mandris axonal e dendríticas (incluindo espinhos). Por exemplo, o princípio da técnica dupla fixação imergindo-se em primeiro lugar em uma solução de fixador e em segundo lugar, pós-fixação em tetróxido de ósmio dá um bom contraste para microscopia de luz26. Uma pequena quantidade de solução de ácido pícrico e glutaraldeído são adicionados à solução fixador para melhorar a penetração do anticorpo e preservar a ultraestrutura das células, como sugerido em um anterior de estudo27. A permeabilização das fatias de cérebro usando o método de congelamento-descongelamento combinado com cryo-proteção com sacarose, ao invés de um detergente tradicional, também oferece óptima preservação dos tecidos para análise morfológica detalhada das células gravadas. Além disso, a visualização particularmente de muito belas estruturas é melhorada através da redução de coloração de fundo, com a incubação com peróxido de hidrogênio (H2O2) e o boro-hidreto de sódio (NaBH4). Adição de cloreto de níquel (NiCl2) para a peroxidase de rábano (HRP) reação para obtenção de um produto de reação de pigmento preto também aumenta o contraste.
O protocolo seguinte descreve os procedimentos utilizados para determinar a preservação de tecido excelente e altamente detalhadas reconstruções 3D neuronais após gravações intracelular em vitro. A descrição da preparação fatia, intracelulares emparelhadas gravações usando eletrodos em ponto e subsequentes procedimentos histológicos utilizados em nosso laboratório têm sido relatado anteriormente28. Embora o protocolo aplica-se às células intracelular repleta de biocytin em fatias grossas de 450-500 μm, o mesmo protocolo pode ser usado após gravações de células inteiras. No entanto, o uso das mais finas fatias resultará em menos completas reconstruções das células.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo Avidin-7-amino-4-metilcumarina-3-ácido acético (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/mL&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin&nbsp; &ge; 98% (TLC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 comprimido de diaminobenzidina (DAB), Para preparar 5 mL</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi Durcupan A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi Durcupan B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi Durcupan C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi Durcupan D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, puriss. p.a., absoluto, &ge; 99,8%</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído, grau I, 25% em H2O</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, &ge; 99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína anti-camundongo de cabra (FITC) - 14,3 mg / mL</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho Texas Red (TR) - 3,3 mg / mL</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio, solução a 30%</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão, viscosidade 1,250 cSt (lit.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de níquel (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio, para microscopia eletrônica, 4% em H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, grau reagente, cristalino&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pícrico, umedecido com água, &ge; Tampão de fosfato 98%</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidroborato de sódio</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Trizma, &ge; 99.0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma, &ge; 99.9%</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montagem Média, , índice de refração 1.45&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kit</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento usado&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Pranchetas de alumínio em forma de concha&nbsp;</td><td>GA-MA & ASSOCIADOS, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Leica DMR&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; fonte de luz de fluorescência</td><td>Excelitas Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera de microscópio digital Leica DFC450</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caneta de desenho técnico Rapidograph 0.18mm&nbsp;</td>Centro <td></td><td></td><td>gráfico de Londres</td></tr><tr><td>0.18 mm ponta</td> de gráfico <td>de Londres Centro de gráficos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Londres Caneta de desenho técnico de rapidógrafo 0.25mm&nbsp;</td>Centro <td></td><td></td><td>gráfico de Londres</td></tr> ponta rápida de <tr><td>0,25 mm</td> Centro <td>gráfico</td><td></td><td></td>de Londres</tr><tr><td>Sistema Neurolucida incluindo estação de trabalho para PC, palco, câmera e joystic para controle de palco XYZ</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida software versão 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW graphics Suite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de edição de vídeo&nbsp;</td>Frascos de vidro <td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 mL</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recuperação de biocytin e reconstruções 3d de ca2 hippocampal enchido interneurônios

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Como atividade cortical rede processa informações é de importância para um grande número de questões científicas básicas e clínicas. O protocolo descrito aqui identifica os blocos de construção básicos deste circuito. Os estudos em profundidade das regiões corticais, finalmente, irão fornecer outros cientistas com os componentes do circuito necessário para a compreensão de como o cérebro adquire, processa e armazena as informações e o que dá errado na doença, enquanto o eletrofisiológicos e dados morfológicos são amplamente utilizados pelos neurocientistas computacionais na construção de redes de modelo que explorar o processamento de informações. O protocolo descrito aqui descreve como células cheias de biocytin gravadas na região do hipocampo de CA2 são recuperadas e depois reconstruídas em 3D. Além disso, o protocolo descreve a demonstração da proteína de ligação de cálcio ou peptídeo conteúdo em interneurônios gravados.

Neurônios no hipocampo CA2 estavam cheios de biocytin seguindo eletrofisiológicas gravações (figuras 1Ac, Ad e 1Bc, Bd). As fatias foram corrigidas durante a noite, após as gravações e a neuroquímica e caracterização morfológica de neurônios foram revelados seguindo o protocolo descrito aqui.
A proteína de ligação de cálcio ou teor de proteínas dos interneurônios preenchidos foi determinada por incubar as fatias primeiro com os anticorpos primários e, em seguida, com fluorescente etiquetados anticorpos secundários. As características de disparo dos interneurônios durante as gravações irão ditar a escolha de anticorpos primários usados. Avidina-AMCA foi usado para visualizar o interneurônio cheio de biocytin e isotiocianato de fluoresceína anti-rato (FITC) e de cabra anticoelho vermelho Texas (TR) foram usado para caracterizar a neuroquímica interneuronal (Figura 1Bb).
Após a visualização de fluorescência, utilizou-se um protocolo HRP para revelar o biocytin (Figura 1Ab). Bem anatomia detalhada do CA2 interneurônios então foi desenhada em 3D usando um software de reconstrução do neurônio (Figura 2 e Figura 3a). Um vídeo de uma reconstrução 3D de uma célula de cesta gravado e preenchido CA2 é exibido no vídeo. Neuronais reconstruções foram consideradas como concluída se ambos os mandris dendríticas e axonal foram confinados a profundidade da fatia 450-500 μm. Pobre arbor axonal coloração foi avaliada pela presença de ramos truncados com um final aberto no topo ou no fundo da fatia, ou por uma mancha que foi limitada para o segmento inicial do axônio e ramos muito proximais. A Figura 4 representa os exemplos de uma boa e uma má HRP coloração seguir biocytin visualização.
Análise morfométrica de reconstruções 3D (Figura 3) pode ser realizada para demonstrar a complexidade do ramo, área de superfície de soma e a área de superfície e volume dos mandris dendríticas e axonal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> Figura 1 : Neuronais reconstruções de dois tipos de células de cesta gravado e preenchido na região CA2 hippocampal e correlacionaram eletrofisiológicos dados obtidos após as gravações intracelulares em vitro. Esta figura foi modificada em anteriores estudos23,24. Então Stratum Oriens, SP estrato Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM estrato Lacunosum Moleculare. (A) Aa: reconstrução de uma célula de cesta de CA2 com restrito da árvore dendrítica e axonal usando um tubo de desenho (1000 X). Os dendritos são em preto, e o axônio é em vermelho. AB: Imagem da célula de cesto cheio de biocytin, seguindo o protocolo de avidina-HRP descrito aqui. AC: Traço representativo de respostas tensão hiperpolarização e despolarizantes injeção atual de uma célula de cesta de CA2 com restrito da árvore dendrítica e axonal. Anúncio: Exemplo de uma pirâmide de CA2 para restringir ligações de celular cesta arbor gravado usando eletrodos afiados. Potencial pós-sináptico excitatório composto (EPSP) médias mostram trem breve depressão aparente durante respostas para trens de três pontas. (B) Ba: reconstrução 2D de uma célula de cesta de CA2 com mandris dendríticas e axonal larga usando um tubo de desenho (1000 X). A árvore dendrítica desta célula de cesta (em preto) estendida radialmente por meio de todas as camadas da região CA2 e horizontalmente em SO e SP das regiões CA2 e CA3. Um dendrito horizontal também atingiu a região CA1. O axônio (em vermelho) estendido às regiões CA3 e CA1. BB: A biocytin-cheia (AMCA coloração) célula cesta foi PV-immunopositive (coloração de FITC) e CB-immunonegative (coloração vermelho-Texas). BC: Traço representativo de respostas tensão hiperpolarização e despolarizantes injeção atual de uma célula de cesta de CA2 com largura dendrítica e axonal arbor. BD: Composto EPSP médias mostram breve trem facilitação aparente durante respostas para trens de três pontas. Exemplos de outros tipos de interneurônios gravados em CA2 podem ser encontrados em anteriores estudos25,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> Figura 2 : Reconstrução 3D corpo celular. (A) rastreamento 3D do corpo celular. Vista de contornos diferentes rastreados em posições diferentes z enquanto centrando-se através do corpo celular. (B) vista 3D de contornos diferentes. (C) vista 3D do corpo celular em um ângulo diferente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> Figura 3 : Análises de morfometria das reconstruções 3D de neuronais. (A) reconstrução 3D de uma célula de cesta CA2 arbor estreitas. Cada ramificação dendrítica é representada por uma cor (verde, azul, vermelho e rosa) e axônio é em azul claro. (B) dendrograma da célula cesta que representa o número de ramificações dendríticas e o comprimento de cada segmento contido em esferas concêntricas com o soma e a 100 μm intervalos do soma. As cores sobre a dendrograma correspondem dos dendritos na. (C) exemplo de Análise morfométrica realizada em células piramidais de CA2 (adaptadas de um anterior estudo23). O número de ramificações dendríticas foi plotado contra a distância entre a soma das células piramidais CA2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> Figura 4 : Exemplos de bom (A) e pobre (B) HRP coloração. (A) Biocytin recuperação revelou um interneurônio muito bem preenchido em CA2. O corpo celular (CB) é límpdo e tem contornos claros. Os dendritos são frisados e exibido algumas espinhas (representadas por estrelas vermelhas). A arbor axonal (A) é densa e apresenta pequenas boutons. (B) exemplo de um pobre dendrítica e axonal coloração de 2 células piramidais em CA2. A coloração de CB é fraca com nenhum esquema claro. Coloração pobre é frequentemente associada com gravações eletrofisiológicas mais curtas, resultando na presença de muito poucos ramos biocytin-cheia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
Vídeo 1: Reconstrução neuronal 3D de uma célula de cesta de CA2 com arbor dendrítica restrita (também referida como célula de cesto estreito arbor CA2) com sua soma no estrato pyramidale, dendrites, abrangendo todas as camadas e axônio em CA2 estrato pyramidale e estrato adjacentes oriens e radiatum. Muito poucos ramos chegaram a proximal CA3 estrato oriens e CA3 estrato pyramidale. Esta célula foi preenchida com biocytin após gravações eletrofisiológicas e seções foram processadas com avidina-HRP seguindo o protocolo descrito aqui. Devido ao corte, apenas o axônio dentro da profundidade da fatia foi recuperado, embora os dendritos estão intactos. Dendritos são em rosa escuro e axônio em branco. Limites de camada e região foram adicionados no início do vídeo. Reconstrução 3D por Georgia Economides-3D de vídeo por Svenja Falk. O vídeo foi gravado com um software de reconstrução do neurônio, como indicado no passo 2.17 e editado com um software de edição de vídeo. Link para o vídeo:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluções utilizadas</td>
			<td>Composição/instruções</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de fixação</td>
			<td>paraformaldeído 4%, 0,2% solução saturada de ácido pícrico, solução de glutaraldeído 0.025% em tampão de fosfato 0,1 M (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 M tampão fosfato pH 7,6</td>
			<td>Adicionar 100 mL de Buffer de 1 M de fosfato de estoque para 900 mL de água destilada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4/7.5</td>
			<td>Adicionar 10 mL de tampão de fosfato 0,1 M, 0,2 g de KCl e 8,76 g de NaCl a 990 mL de água destilada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de pH TRIS 7.5</td>
			<td>Dissolva 5,72 g de cloridrato de Tris e 1,66 g de Tris Base em 50 mL de água destilada. Então faça até 1 L com água destilada.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução tamponada de fixador glutaraldeído e paraformaldeído</td>
			<td>paraformaldeído 4%, 0,2% saturada, solução de ácido pícrico, solução de glutaraldeído 0.025% em tampão de fosfato 0,1 M.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de ABC</td>
			<td>Solução a ser feita pelo menos 30 min antes do uso do kit de ABC. Adicione 1 gota da solução A e 1 gota de solução B a 2,5 mL de PBS.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resina epóxi de Durcupan:</td>
			<td>Para fazer 20 potes: 20 g de um componente, 20 g de componente B, 0,6 g de componente C e 0,4 g de componente D -</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Protege o equilíbrio dos derramamentos, cobrindo a placa com um círculo de papel de filtro. Pese cuidadosamente os reagentes para um copo de tripour nas proporções acima referido. Misture bem, agitando vigorosamente usando duas varas de madeira pelo menos 5 min. A mistura deve tornar-se uma cor marrom escura de densidade uniforme. Coloca o copo no forno a ~ 50 ° C por um período máximo de 10 min para remover todas as bolhas de ar possível. Nota: A resina vai começar a curar, se você deixa o béquer no forno mais 10 min. decantar a resina em potes de plástico ou seringas de 5ml, datá-los e guarde no congelador-20 ° C pronto para uso.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Tabela de soluções.

O protocolo descrito aqui descreve a análise de imunofluorescência, recuperação de biocytin e reconstruções de alta qualidade de hippocampal CA2 interneurônios seguindo o intracelulares gravações eletrofisiológicas in vitro, permitindo neuronal caracterização e anatomia neuronal, finalmente, bem a ser estudado.

Recuperação de Biocytin e reconstruções 3D de CA2 Hippocampal enchido interneurônios

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Este método pode ajudar a classificar subtipos neuronais e estender nossa compreensão do mapa funcional dos circuitos corticais. Este protocolo foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de arbores dendríticas e axionais, permitindo reconstruções de alta qualidade. No final de uma gravação eletrofisiológica, transfisiológico, transfira a fatia contendo a célula gravada para um pequeno prato de ACSF.Enquanto trabalha em um capô de fumaça, enrole a fatia em um pequeno pedaço de papel filtro de qualidade fina e coloque outro pedaço de papel filtro umedecido sobre a fatia. Coloque o tecido em um pequeno pote plástico contendo 5 a 10 mililitros de solução fixa e armazene a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, transfira o tecido do recipiente com solução fixa para um recipiente com dois mililitros de tampão de fosfato molar de 0,1 molar para enxaguar e corte qualquer excesso de tecido com uma lâmina de bisturi.Remova o excesso de tecido colocando a fatia em uma placa de Petri, e corte o excesso de tecido com uma lâmina de bisturi. Transfira o tecido aparado para uma placa de Petri limpa, garantindo que ele fique liso sem dobras ou vincos. Remova o excesso de tampão usando uma escova de tinta seca.Cubra o tecido com solução de gelatina quente e coloque a placa de Petri em um bloco congelado para esfriar rapidamente a solução. Em seguida, mova o prato de definição de gelatina para 4 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Em um capô de fumaça, use uma lâmina de bisturi para cortar um pequeno bloco de 1 X 1 centímetro contendo o tecido embutido da gelatina.Levante o bloco usando uma pequena espátula e transfira cuidadosamente para uma solução fixativa fresca. Deixe fixar por pelo menos 30 minutos a quatro graus Celsius. Após esta segunda fixação, lave o bloco de gelatina em cinco mililitros de PB três vezes.Depois de lavar, seque o bloco usando um pedaço de tecido de papel. Em seguida, use uma pequena quantidade de cola cianoacrilato para furar o bloco, orientado com o tecido na parte superior, em um caminhão vibratome usando super cola. Sele a fatia a 50 mícrons de espessura usando um vibratome e coloque cada seção cuidadosamente em um frasco de vidro contendo 10% de sacarose.Após a secção, pegue cuidadosamente uma seção do frasco e coloque-a plana em uma tampa de placa de Petri. Em seguida, use uma lâmina de bisturi fresco para remover a gelatina ao redor da seção. Coloque as seções em um frasco contendo 2 mililitros de sacarose fresca de 10% na PB, e agitar por 10 minutos para iniciar o processo de crioproteção.Após a crioproteção, coloque as seções planas sobre um pequeno retângulo de papel alumínio usando uma escova de tinta. Remova qualquer excesso de líquido das seções e dobre cuidadosamente a folha em uma parcela. Segure a folha de alumínio perto da superfície do nitrogênio líquido sem tocar na superfície por 30 segundos.E então permitir que as seções descongelem completamente por aproximadamente 30 segundos. Repita o congelamento mais duas vezes. Remova todas as seções da folha com um pincel e coloque-as em um frasco de vidro contendo dois mililitros de PB para lavar o excesso de sacarose sob agitação constante.Depois de imunostaining para imagens de fluorescência, coloque o slide em uma placa de vidro Petri contendo PBS, e remova cuidadosamente o deslizamento da tampa. Em seguida, lave as seções do slide usando pulsos suaves de PBS de uma pipeta Pasteur. Coloque as seções em um frasco de vidro limpo contendo PBS.Realize a reação do HRP Avidin incubando primeiro as seções no complexo de biotina Avidin ou ABC, por pelo menos duas horas para amplificar o produto de reação HRP. Em seguida, lave as seções com PBS 3 vezes por 10 minutos e, em seguida, com tampão tris duas vezes por 10 minutos. Depois de remover a última lavagem tampão tris, adicione rapidamente uma gota de 8% de solução de cloreto de níquel à solução diaminobenzidina ou solução DAB.Em seguida, pipeta a solução para misturar e adicionar rapidamente um mililitro desta solução sobre as seções. Incubar as seções nesta solução por 15 minutos. Em seguida, adicione 10 microliters de 1% de peróxido de hidrogênio à solução DAB.Deixe a reação prosseguir no escuro sob agitação constante por cerca de um a dois minutos até que as células sejam rotuladas. Em um capô de fumaça, coloque um pequeno círculo de papel filtro em uma placa de Petri e umedeça-o com PB. Levante as seções uma de cada vez do frasco de vidro usando um pincel de tinta e coloque-as cuidadosamente sobre o papel. Cubra as seções com outro círculo umedecido de papel filtro e remova o excesso de tampão tocando suavemente o papel de tecido na superfície.Aplique oito ou nove gotas de 1% de tetroxida de ósmio na PB ao papel superior. Cubra o prato e mantenha no capô da fumaça por pelo menos 30 minutos, mas não mais do que 1 hora. Depois de enxaguar, montar e cobrir as seções, desidratar através de uma série de 50%, 70%, 95% e 100% de soluções alcoólicas.Após a etapa de desidratação, transfira as seções para um frasco de vidro contendo 100% de etanol em um agitador por aproximadamente cinco minutos. Substitua a solução alcoólica por óxido de propileno e lave três vezes por cinco minutos. Após a última lavagem, mantenha em torno de dois mililitros de óxido de propileno no frasco e adicione resina a uma proporção de 1:1.Certifique-se de que a resina está dissolvida e mantenha as seções sob constante agitação por 30 minutos. Após 30 minutos, use uma vara de madeira para colocar cada seção em uma planchette de alumínio contendo resina epóxi, e incubar durante a noite. No dia seguinte, coloque o planchette em uma placa quente por aproximadamente 10 minutos.Em seguida, pegue cada seção com uma vara de madeira e coloque em um slide limpo. Uma vez que todas as seções tenham sido transferidas para o slide, visualize o slide sob um microscópio dissecando para verificar a orientação das fatias e coloque uma mancha de cobertura sobre as seções. Cura no forno por 48 horas a 56 graus Celsius.Use um objetivo de baixa ampliação para se concentrar na seção doméstica que contém o corpo celular. Em seguida, use um objetivo de 100x, concentre-se no corpo celular e clique no centro para marcar o ponto de referência. Para rastrear a soma em 3D usando o objetivo de 100x, selecione contorno da guia de rastreamento e selecione o contorno do corpo celular.Use o joystick para mover o foco para a parte superior do corpo celular. Coloque os pontos clicando ao redor do perímetro da peça que está atualmente em foco. Clique com o botão direito do mouse e selecione contorno próximo para finalizar este primeiro contorno.Repita este processo em diferentes posições z até que a parte inferior do corpo celular seja atingida. Para rastrear a árvore dendrítica, selecione dendrito ou dendrito apical, no menu de neurônios. Primeiro, rastreie um segmento inicial curto para cada dendrito usando a roda de rolagem do mouse para ajustar o diâmetro do cursor para combinar com o diâmetro do dendrito.Rastreie cada dendrite. Quando um nó na árvore é alcançado, clique com o botão direito do mouse e selecione nó bifurcado ou nó de trifurcação no menu suspenso. Para identificar pontos de correspondência entre os dendritos em uma seção que corresponde à seção concluída, clique na guia mover e selecione match points.Selecione o número de pontos necessários para ser correspondido e pressione OK. Clique no final de uma filial completa e clique no ramo. Repita isso para cada match point. Uma vez que todos os dendritos de cada seção tenham sido rastreados, rastreie o axônio usando o mesmo processo Mostrado aqui é uma reconstrução de uma célula cesta CA2 com dendrítica restrita e axona arbornal usando um tubo de desenho.Os dendritos estão em preto e o axônio está em vermelho. Esta é uma imagem de exemplo da célula de cesta cheia de biocytina seguindo o protocolo Avidin HRP descrito aqui. Mostrado aqui é um vídeo de uma reconstrução neuronal 3D da célula cesta CA2.Dendrites estão em rosa escuro e o axônio está em branco. Por fim, esta imagem mostra um dendrograma da célula cesta CA2. Levará tempo para se tornar proficiente com este protocolo.No entanto, essa abordagem otimizada pode gerar imagens de alta resolução de estruturas corticais e hipocampais complexas in vitro.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o processo de visualização de um interneurônio preenchido com biocitina em uma seção do hipocampo de ratos, destacando sua identidade neuroquímica por meio do uso de anticorpos específicos e microscopia de fluorescência.

Imunomarcação de interneurônios em uma secção hipocampal de rato

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir fatias fixas de cérebro de rato contendo interneurônios cheios de biocitina. O protocolo inclui incubação com complexo avidina-biotina (ABC), coloração com HRP e substrato cromogênico, preservação de estruturas com tetróxido de ósmio e incorporação do tecido em resina para imagem.

Marcação de interneurônios preenchidos com biocitina em fatias de hipocampo de rato para visualização

Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.

Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

Culturas de baixa densidade de neurônios primários do hipocampo geralmente requerem camada alimentadora da glia para suprir fatores neurotróficos e sustentar a longevidade. Descrevemos aqui um método simplificado para cultivar neurônios de densidade ultrabaixa em lamínulas de vidro na presença de uma camada alimentadora neuronal de alta densidade, o que facilita a investigação de mecanismos neuronais autônomos específicos.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

Apresentamos um protocolo para preparar fatias agudas do hipocampo dorsal-intermediário de camundongos. Comparamos esta preparação transversal com o corte coronal em termos de qualidade de gravações e preservação de características morfológicas de neurônios registrados.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.

Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Aprenda a recuperar biocytin e reconstruir interneurônios do hipocampo CA2 em 3D após registros eletrofisiológicos. Este protocolo preserva a ultraestrutura neuronal para análises anatômicas detalhadas.

Recuperação de Biocytin e reconstruções 3D de CA2 Hippocampal enchido interneurônios

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