Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR
10 de novembro de 2018
Este protocolo diagnostica vírus de Lago de tilápia (TiLV) em tecidos de tilápia, utilizando metodologias de RT-PCR. Todo o método é descrito de dissecção de tecidos para extração de RNA total, seguida pela síntese do cDNA e detecção de TiLV por PCR convencional ou PCR quantitativo usando dsDNA vinculando um corante fluorescente de vinculação.
Bem-vindos a todos. Meu nome é Win Surachetpong. Sou professor assistente em Microbiologia Veterinária e Faculdade de Imunologia de Medicina Veterinária na Universidade kasetstart, Tailândia.
Eu e minha equipe estamos especializados em doenças virais emergentes na tilápia. Estamos trabalhando agora no vírus do lago da tilápia que causam alta mortalidade na tilápia. Como a tilápia é a segunda espécie de peixe mais importante que é a cultura em todo o mundo, ela fornece fonte de proteína para um milhão de pessoas e desempenha papel importante para a segurança alimentar.
Assim, o recente surto do vírus do lago de tilápia causa impacto socioeconômico que levou muitos cientistas a tentar encontrar uma solução para este problema. Até agora precisamos de um método muito sensível, rápido e preciso para detectar o vírus. Neste vídeo, mostraremos passo a passo para detectar o vírus do lago de tilápia no tecido de peixes a partir da coleta de amostras, população de amostras e análise de PCR em tempo real.
Primeiro, solubilize a overdose de óleo de pano na água para eutanásia do peixe. Coloque o peixe morto em uma bandeja, esterilize o equipamento usando 95% de etanol e depois queime com um queimador de álcool. Corte lentamente o peixe do abdômen inferior para cima, para coletar o fígado.
Colete parte do fígado em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. A primeira parte da extração de RNA deve ser realizada em um Capô de Fluxo Laminar, e usar equipamento de proteção. Adicione um mililitro de reagente de extração de RNA no tubo.
Pulverize o fígado usando um pilão de tecido em homogêneo. Adicione 200 microliters de clorofórmio no tubo. Em seguida, misture suavemente invertendo o tubo várias vezes.
Reserve por três minutos em temperatura ambiente. Centrífuga a 4 graus celsius a 12.000 RCF por 15 minutos. Colecione cuidadosamente os tubos da centrífuga.
Transfira suavemente 500 microliters da fase aquosa superior incolor em um novo tubo. Adicione um volume de isopropanol no tubo. Aqueça a menos 20 graus celsius por duas horas ou até a noite para precipitar o RNA.
Após a incubação, centrifufique a solução na mesma condição de centrífuga. Recolhe os tubos da centrífuga e, em seguida, descarte o supernatante. A pelota de RNA pode ser vista como apontada pela seta.
Adicione um mililitro de 75% de etanol no tubo para lavar a pelota de RNA e inverta várias vezes. Centrífuga a 4 graus celsius, a 10.000 RCF por 15 minutos. Recolhe os tubos da centrífuga e, em seguida, descarte o supernatante.
Desenhe o etanol que sobra usando a tubulação automática e o ar seco à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Adicione 30 a 60 microliters RNase água livre, pré-aquecida a 55 a 60 graus celsius para solubilizar a pelota de RNA. Use de um a dois microliters de solução RNA para medir a concentração usando um espectrômetro de micro volume.
Os resultados aparecerão na tela. Diluir a concentração para 200 nanogramas por microliter usando água livre RNase. Realize a síntese de CDNA utilizando os produtos químicos e condições listados da seguinte forma.
Use um termociclador para converter RNA em cDNA com condições sugeridas. A seguir estão os produtos químicos e condições utilizados para determinar a carga TiLV usando PCR em tempo real. Dispense seis mililitros da mistura mestre qPCR em cada frasco de tubo branco de tira qPCR.
Posteriormente, quatro mililitros de amostra de CDNA são carregados no poço. Nesta fase, uma nova ponta de tubulação deve ser trocada em cada poço, para evitar contaminação de amostra para amostra. Sele firmemente a tira qPCR com uma tampa de tira qPCR transparente.
Misture suavemente a solução apertando uma ponta da tira. Em seguida, gire para baixo usando micro centrífuga para coletar todo o líquido na parte inferior dos vasos. Use a condição de dois passos como mostrado no vídeo, selecione o poço em placa de 96 poços que você vai usar.
Selecione o verde cibernético como a flora para corante. Selecione desconhecido como o tipo de amostra e insira um nome em uma caixa de nome de amostra. Abra a tampa de uma máquina PCR em tempo real e coloque a tira qPCR no poço atribuído.
Em seguida, feche a tampa. Execute a máquina com a condição selecionada. A máquina iniciará e funcionará depois que a tampa atingir a temperatura desejada.
Após o término das condições qPCR, a curva de amplificação é mostrada. Aqui, a seta de taxa aponta onde o nível limiar corta entre a fase exponencial e a fase linear que resulta em valor de TC. O valor da TC é então extrapolado em número de cópia de registro de vírus para calcular um número de vírus permanece usando a curva padrão.
O pico de fusão também é exibido para identificar se o vírus detectado pelo qPCR é, de fato, TiLV no qual os picos de derretimento geralmente variam entre 79,5 e 80,5 graus celsius. Por isso, esperamos que este método seja uma ferramenta importante para os agricultores e a organização em todo o mundo, que podem exigir a implementação de um controle e limitar a propagação da infecção por TiLV.
Visão Geral
Este protocolo detalha o diagnóstico do vírus do lago da tilápia (TiLV) em tecidos de tilápia utilizando metodologias de RT-PCR. Ele abrange todo o processo, desde a dissecação dos tecidos até a extração de RNA, síntese de cDNA e detecção de TiLV por meio de PCR convencional ou quantitativa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia Veterinária
- Virologia
- Manejo da Saúde de Peixes
Antecedentes
- O vírus do lago tilápia causa mortalidade significativa em tilápias, impactando a segurança alimentar.
- A tilápia é a segunda espécie de peixe mais importante globalmente.
- Métodos rápidos e precisos de detecção são essenciais para o controle de surtos.
- Este protocolo tem como objetivo fornecer um método confiável para a detecção do TiLV.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método altamente sensível para detectar TiLV em tecidos de peixes.
- Auxiliar produtores e organizações no controle da disseminação do TiLV.
- Fornecer um guia passo a passo para pesquisadores e profissionais.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras e eutanásia de peixes utilizando óleo de pano.
- Extração de RNA de tecido hepático utilizando capela de fluxo laminar.
- Síntese de cDNA seguida de PCR em tempo real para detecção de TiLV.
- Análise das curvas de amplificação e valores de CT para quantificar a carga de TiLV.
Resultados Principais
- Extração e quantificação bem-sucedidas de RNA de tecidos de tilápia.
- Detecção do TiLV por PCR em tempo real com condições específicas.
- Estabelecimento de uma curva padrão para quantificação do vírus.
- Identificação do TiLV por meio de análise do pico de fusão.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para detecção do TiLV.
- Pode auxiliar no controle de surtos e na garantia da segurança alimentar.
- Aplicações futuras podem aprimorar o controle de doenças virais na aquicultura.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção rápida e sensível do vírus do lago da tilápia (TiLV) é fundamental para a biossegurança e o manejo de doenças na aquicultura, impactando diretamente a segurança alimentar e as cadeias globais de suprimento de proteína. A integração da RT-PCR convencional e da RT-qPCR com SYBR Green permite a detecção qualitativa e quantitativa do vírus, apoiando programas de vigilância e intervenção precoce. Esses diagnósticos moleculares fornecem dados acionáveis para a mitigação de riscos e a alocação de recursos em ambientes de pesquisa e operacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a detecção precisa de RNA do TiLV, apoiando a vigilância de patógenos baseada em hipóteses.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao distinguir amostras de tecido infectadas de não infectadas.
- Oferece confiança preditiva nas estratégias de monitoramento de doenças e resposta a surtos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece protocolos validados para extração de RNA e configuração de ensaio de qPCR, garantindo reprodutibilidade.
- Fornece resultados quantitativos (valores de CT, número de cópias virais) para padronização robusta do ensaio.
- Permite triagem escalonável de grandes coortes de amostras para estudos de vigilância e pesquisa.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se ao desenvolvimento translacional de biomarcadores mediante a quantificação da carga viral em casos subclínicos.
- Apóia a continuidade desde a detecção laboratorial até a vigilância em campo e o planejamento de intervenções.
- Reduz o risco biológico na validação de modelos pré-clínicos para pesquisa de doenças aquáticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho de PCR dupla conecta a descoberta inicial, o desenvolvimento de ensaios e a pesquisa translacional para patógenos virais aquáticos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação mecanicista da dinâmica de infecção pelo TiLV.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para análise de amostras em alto rendimento.
- Análises: Fornece valores de CT e quantificação baseada em curva padrão para estudos comparativos.
- Pesquisa Translacional: Permite a detecção de infecções em níveis baixos, orientando estratégias de vigilância e intervenção.
- Reutilização Institucional: Oferece um protocolo padronizado e adaptável para programas contínuos de vigilância e pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade na detecção de patógenos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho diagnósticos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir em resposta a surtos e na alocação de recursos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco dos esforços de vigilância e intervenção.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em biologia molecular e na configuração de ensaios de qPCR.
- Requer acesso a reagentes para extração de RNA, termocicladores e equipamentos de PCR em tempo real.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para garantir a comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diversos tipos de tecidos e matrizes de amostras mediante otimização do protocolo.
- Depende da qualidade da amostra e da integridade do RNA para resultados confiáveis.
