Name: Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a empacotar oligonucleotídeos com nanotubos de carbono de parede simples para entrega de fármacos em mieloma múltiplo. Este método melhora a eficiência terapêutica in vitro e in vivo.

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Os autores agradecer o Lerner Research Institute proteômica, genômica e núcleos de imagens para sua assistência e apoio. Financiamento: Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH/ICN grant R00 CA172292 (J.J.Z.) e fundos de start-up (para J.J.Z.) e clínica e translacional ciência colaborativa (CTSC) do caso Western Reserve University núcleo utilização piloto Grant (para J.J.Z.). Este trabalho utilizou o microscópio confocal Leica SP8 que foi comprado com financiamento da concessão de institutos nacionais de saúde SIG 1S10OD019972-01.

Todos os experimentos envolvendo animais foram pré-aprovados pela Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso e cuidado institucional do Animal).
1. síntese de SWCNTs funcionalizados
<ol><li>Mistura de SWCNTs de 1 mg, 5 mg de DSPE-PEG2000-amina e 5 mL de água esterilizada nuclease-livre, em um frasco de cintilação (20 mL). Sacode bem para dissolver todos os reagentes completamente.</li>
	<li>Proceda à sonicação do frasco em um sonicador de banho de água a um nível de potência de 40 W por 1h à temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, mudam a cada 20 min de água para evitar o superaquecimento). Em seguida, centrifugá-lo a 24.000 x g durante 6 h e recolher o sobrenadante. Esta solução SWCNT funcional pode ser armazenada a 4 ° C durante 2 meses.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução SWCNT da etapa 1.2 para um dispositivo de filtragem centrífuga de MWCO kDa 100, seguido de 4 mL de água esterilizada nuclease-livre. Centrifugação por 10min a 4.000 x g em RT para remover extra DSPE-PEG2000-amina. Repetir a adição de 4 mL de água e a centrifugação 5 x. Mais de 0,5 mL de solução SWCNT sobra será deixado no filtro após cada centrifugação.</li>
	<li>Medir a concentração da solução SWCNT sobra no filtro usando um espectrômetro UV/VIS em 808 nm após a lavagem final. A concentração final é normalmente cerca de 50 mg/L (calculado de acordo com o método desenvolvido por Kam et al.18). Nota: Certifique-se que DSPE-PEG-acrescida SWCNTs são solúveis em água após etapa 1.4 e são estáveis em soluções biológicas diferentes sem agregação visível após algumas semanas.</li>
</ol>2. conjugação de Anti-MALAT1 Gapmer DNA ladeado por 2'-O RNAs modificados para SWCNT Funcionalizado
<ol><li>Adicione 0,5 mg de Sulfo-LC-SPDP em 450 µ l de DSPE-PEG2000-amina acrescida SWCNT. Adicionar 50 µ l de PBS de x 10 e então incubar durante 2 h em RT</li>
	<li>Para remover extra Sulfo-LC-SPDP, adicione a reação da etapa 2.1 para um dispositivo de filtragem centrífuga de MWCO kDa 100, seguida por 4 mL de água livre de nuclease. Centrifugar durante 10 min a 4.000 x g em RT. Repeat a adição de 4 mL de água e a centrifugação x 5.</li>
	<li>Adicionar 200 nM thiol-modificado Cy3-anti-MALAT1 gapmer DNA em 1,5 mL de solução comercial de TDT e incubar durante 90 min no RT. Purify o produto com uma coluna de NAP-5, seguindo o protocolo do fabricante. Eluir o anti-MALAT1-Cy3 com 500 µ l de esterilizado nuclease-free 1 x PBS. Nota: O SWCNT funcionalizado pode ser armazenado com TDT adicionado, que pode cleave dissulfeto formado durante o armazenamento do anti-MALAT1 de thiolated gapmer DNA. A DTT adicionado pode ser removido por aNAP-5 coluna antes de conjugação com SWCNT.</li>
	<li>Recolher a solução de DSPE-PEG2000-amina SWCNT sulfo-LC-SPDP-Tratado deixada no filtro e dilui-lo com 500 µ l de solução de Cy3-anti-MALAT1. Em seguida, incube a 4 ° C por 24 h. O conjugado SWCNT-anti-MALAT1 pode ser armazenadas a 4 ° C por 3 semanas. Seguindo o mesmo procedimento, o SWCNT conjugado com oligo antisentido scramble pode ser sintetizado e utilizado como SWCNT-controle.</li>
</ol>3. cauda veia injeção de SWCNT-Anti-MALAT1
<ol><li>
Gere um modelo de rato disseminadas MM.
	<ol>
<li>Para alcançar os melhores resultados da comparação, aleatoriamente organize 14 NOD. CB17-Prkdcscid/J ratos (8 semanas de idade), em julgamento ou controle grupos (sete em cada grupo) com a mesma relação macho/fêmea.</li>
		<li>Limpar o banco de operação e esterilize-a com álcool a 70%.</li>
		<li>Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer o mouse para ajudar a cauda veia para aparecer. Contenha o mouse corretamente com uma retenção de injeção de cauda.</li>
		<li>Injete células de 5 x 106 mCherry-MM.1S-Luc em 50 µ l de PBS na veia da cauda sem anestesia. Pressione o local da injeção com um algodão embebido em álcool para Mark s. 30 o mouse injetado e devolvê-lo para uma gaiola limpa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
O tratamento tem início no dia 7 após a injeção de células MM.1S.
	<ol>
<li>Injete 50 µ l de PBS contendo SWCNT-anti-MALAT1 para a veia da cauda do rato. Uso PBS contendo SWCNT-controle como um controle.</li>
		<li>Pressione o local da injeção com um algodão embebido em álcool por 30 s.</li>
		<li>Observar o sangramento local na cauda e o comportamento geral do rato por 1 min e depois devolvê-lo para uma gaiola limpa. Observe tudo injetados ratos novamente antes de retornar a gaiola ao rack, para certificar-se de que as injeções são toleradas bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Repeti a injeção a cada 7 dias até o término do experimento.
	<ol>
<li>Encerrar o experimento quando degrada a saúde geral do mouse: quando não comer ou beber, a aparência de patas pálidas, qualquer hemorragia subcutânea, uma falta de ar, diminuição da atividade, uma paralisia dos membros inferiores, e/ou uma massa palpável na abdômen é observado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. avaliação da progressão da doença
<ol><li>Avalie o estado geral dos ratos todos os dias após a injeção de células de mCherry-MM.1S-Luc. Preste atenção particular se os ratos desenvolvem paralisa dos membros inferiores.</li>
	<li>
Avalie o crescimento do tumor usando um sistema de imagens in vivo 1 x por semana, antes da injeção de SWCNT-anti-MALAT1.
	<ol>
<li>Prepare-se 15 mg/mL D-luciferina fresco com PBS 1x.</li>
		<li>Anestesia os ratos com um vaporizador de isoflurano (3 – 5% para a indução e 1-3% para a manutenção, dependendo do estado dos ratos).</li>
		<li>Injetar 150 mg/kg em cada rato D-luciferina intraperitonealmente, 5 min antes de imagem; Então, imagem os ratos em posição com um espectro de sistema de imagem.</li>
		<li>Recolha imagens sequenciais dos ratos cada 2 min, até atingir a saturação da luminescência. Ajuste o intervalo de tempo de acordo com o absorção de D-luciferina/sinal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use o CO2 para sacrificar os ratos, uma vez atingido o término do experimento.</li>
	<li>
Já que este é um modelo disseminado MM, processe os ratos como segue.
	<ol>
<li>Pese o mouse antes de dissecação.</li>
		<li>Colete sangue periférico do coração por um hemograma completo (CBC) ensaio realizado por uma máquina de contador de células do sangue. As contagens de células brancas e células vermelhas do sangue, bem como a proporção de linfócitos, é os principais índices.</li>
		<li>Isolar o baço e pesá-lo. Calcular a relação do peso de corpo/baço; Considere > 0,5% como alargamento do baço.</li>
		<li>Recolha os tecidos da medula óssea, baço, linfonodos, rim e o tecido com metástase visível.</li>
		<li>Recolha a espinha se o mouse desenvolvido uma paralisia dos membros inferiores.</li>
		<li>Extrai o ARN e proteínas de amostras de medula óssea.</li>
		<li>Corrigi todos os tecidos remanescentes em formol.</li>
		<li>Para descalcificação, mergulhe as amostras de osso em 0,25 M de solução de EDTA (pH 8.0) durante 5 dias após 24h de fixação.</li>
		<li>Mergulhe todas as amostras em álcool 75% para o armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Compare a intensidade do sinal de luciferase nos mesmos pontos tempo em dois grupos. De ambos os grupos, gravar as datas do sacrifício de cada rato e calcular as curvas de sobrevivência dos dois grupos com o software. Nota: Todos os procedimentos são resumidos na Figura 1.</li>
</ol>

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<li>Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+reduction+of+disulfide+bonds+in+lysosomes%3A+characterization+of+a+gamma-interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).</li>
<li>Lelimousin, M., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perturbation+by+carbon+nanotube+insertion%3A+pathways+to+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization.</a> Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).</li>
<li>Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+mechanism+and+stability+of+boron+nitride+nanotubes+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers.</a> J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+of+endocytosis+and+exocytosis+of+single-walled+carbon+nanotubes+in+NIH-3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells.</a> Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cellular+uptake+and+expulsion+of+single-walled+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Nano%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).</li>
<li>Ruggiero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+glomerular+filtration+of+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação de numerosos processos fisiológicos e fisiopatológicos em cânceres, incluindo MM7,8,9; Eles têm o potencial para ser direcionado para o tratamento de câncer, que pode ser realizado por oligonucleotides antisentido20,21,22. O E.U. Food and Drug Administration (FDA) aprovou várias dr...

O SWCNT é um romance nanomaterial que pode fornecer vários tipos de drogas, tais como pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos, estàvel e eficientemente com ideal tolerabilidade e toxicidade mínima em vitro1 e2de in vivo. Um SWCNT funcionalizado tem grande solubilidade em água e biocompatibilidade, pode ser usado como um serviço de transporte para moléculas menores e pode transportá-los para penetrar a membrana celular3,4,5.
lncRNAs são um aglomerado de RNA (> 200 nt) que são transcritas do genoma de mRNA, mas não pode ser traduzido em proteínas. Aumentando a evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação da expressão de gene6 e estão envolvidas na iniciação e progressão da maioria dos tipos de câncer, incluindo MM7,8,9. MALAT1 é uma transcrição não-codificante nuclear enriquecido 2 (NEAT2) e um altamente conservadas lncRNA10. MALAT1 é inicialmente reconhecido em metastásico pulmão não-pequenas células de câncer (NSCLC)11, mas tem sido overexpressed em inúmeros tumores5,12,13; é um do mais altamente expressa lncRNAs e está correlacionada com um prognóstico pobre em MM8,14. O nível de expressão de MALAT1 é significativamente maior nos pacientes MM extra-medulares curso fatal em relação aos diagnosticados apenas como MM15.
Em um estudo anterior, confirmamos que anti-MALAT1 oligos robustamente originar danos ao DNA e apoptose em MM16 usando oligonucleotides antisentido de DNA de gapmer MALAT1 de segmentação (anti-MALAT1) em células MM. O DNA de gapmer é composto de DNA antisentido e ligado por 2'-OMe-RNAs, que poderiam solicitar MALAT1 de clivagem por RNase H atividade uma vez acoplada17. A eficiência de entrega in vivo de oligos antisentidos ainda limita seu uso clínico.
Para testar a entrega o efeito de SWCNT para anti-MALAT1 gapmer oligos, o anti-MALAT1 gapmer DNA é conjugado a DSPE-PEG2000-amina acrescida SWCNT. O SWCNT-anti-MALAT1 então é injetado por via intravenosa em um modelo de rato disseminadas MM; observa-se uma inibição marcante depois de quatro tratamentos.

<table><tbody><tr><td>SWCNTs</td><td>Millipore-Sigma</td><td>704113</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000-Amine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880128</td><td></td></tr><tr><td>sonicator de banho</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrífugo de 4 mL</td><td>Espectrômetro Millipore-Sigma</td><td>Z740208-8EA</td><td></td></tr><tr>UV<td>/VIS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer</td><td>coeficiente de extinção de 0,0465 L/mg/cm a 808 nm</td></tr><tr><td>Sulfo-LC-SPDP</td><td>ProteoChem</td><td>c1118</td><td></td></tr><tr><td>solução de TDT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>coluna NAP-5</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>sistema de imagem in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD. Camundongos CB17-Prkdcscid/J</td><td>Charles River lab</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Becton Dickinso</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine2000</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 meio</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>MALAT1-QF:</td> <td>sintetizado por IDT Companhia</td><td></td><td>5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'</td></tr><tr><td>MALAT1-QR:</td> <td>sintetizado pela IDT Company</td><td></td><td>5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'</td></tr><tr><td>GAPDH-QF:</td> <td>sintetizado pela IDT Company</td><td></td><td>5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3'</td></tr><tr><td>GAPDH-QR:</td> <td>sintetizado pela IDT Company</td><td></td><td>5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'</td></tr><tr><td>PCR quantitativo usando SYBR Green PCR master mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid kit de síntese de cDNA de primeiro suporte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>anti-MALAT1</td><td>sintetizado pela IDT Company</td><td></td><td>5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Viabilidade Celular</td><td>Promega Corporation</td><td>G7570</td><td>CellTiter-GloLuminescent Kit de Ensaio de Viabilidade Celular</td></tr><tr><td>accuSkan GO UV/Vis Microplaca Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific Filtro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífugo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>software SPSS</td><td>IBM</td><td>versão 24.0</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr></tbody></table>

repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na vivo por nanotubo de carbono de parede simples (swcnt)-entregue malat1 antisentido oligos

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos

O nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT) é um novo tipo de nanopartículas, que tem sido usado para entregar vários tipos de drogas em células, como proteínas, oligonucleotides e drogas sintéticas da pequeno-molécula. O SWCNT tem dimensões personalizáveis, uma grande área superficial e com flexibilidade pode vincular com drogas através de diferentes modificações na sua superfície; Portanto, é um sistema ideal para o transporte de drogas em células. Há muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) são um conjunto de RNA não-codificante mais de 200 nt, que não pode ser convertido em proteína, mas desempenham um papel importante nos processos biológicos e fisiopatológicos. Transcrição de adenocarcinoma do pulmão metástase-associado 1 (MALAT1) é uma lncRNA altamente conservada. Foi demonstrado que níveis mais elevados de MALAT1 estão relacionados com o mau prognóstico de vários tipos de câncer, incluindo mieloma múltiplo (MM). Temos revelou que MALAT1 regula a morte de reparação e célula de DNA em MM; assim, o MALAT1 pode ser considerado como um alvo terapêutico para MM. No entanto, a entrega eficiente do oligo antisentido para inibir/nocaute MALAT1 in vivo ainda é um problema. Neste estudo, podemos modificar o SWCNT com PEG-2000 e conjugado um oligo anti-MALAT1 para isso, testar a entrega deste composto em vitro, injetá-lo por via intravenosa em um modelo de mouse MM disseminado e observar uma significativa inibição da progressão de MM, o que indica Esse SWCNT é um vaivém de entrega ideal para gapmer anti-MALAT1 DNA.

Para demonstrar o efeito de inibição de anti-MALAT1 gapmer DNA em MM, que derrubou a expressão de MALAT1 e usado em células H929 e MM.1S. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram coletadas para a análise da eficiência do knock-down e o status de apoptose em células transfectadas com anti-MALAT1 gapmer ou controle de DNA. qRT-PCR os resultados mostraram que anti-MALAT1 gapmer DNA derrubou a expressão de MALAT1 nas células H929 e MM.1S com eficiência(F...

Este manuscrito descreve a síntese de um nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA do oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demonstra a entrega confiável do SWCNT e o potente efeito terapêutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para síntese, modificação, conjugação, e injeção de SWCNT-anti-MALAT1 são descritos.

Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos

The single-wall carbon nanotube (SWCNT) is a new type of nanoparticle, which has been used to deliver multiple kinds of drugs into cells, such as ...

O método que estamos usando aqui pode ajudar a embalar oligonucleotídeo com nanotubo de carbono de parede única, que é um novo tipo de nanopartícula para entrega de drogas. A principal vantagem dessa técnica é a entrega mais eficiente de medicamentos oligonucleotídeos em células in vivo. As implicações desta técnica se estendem à pesquisa de mieloma múltiplo, porque introduziu nanopartículas para melhorar a entrega de medicamentos oligonucleotídeos.Através deste método pode fornecer insights sobre o tratamento para mieloma múltiplo. Também pode ser aplicado a outras doenças e conjugado com outras cargas, como proteínas e pequenas moléculas. Primeiro, misture um miligrama de nanotubos de carbono de parede única, cinco miligramas de DSPE-PEG 2000 amina, e cinco mililitros de água esterilizada sem nuclease em um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros.Sonicar o frasco em um sonicator de banho d'água a um nível de potência de 90 watts por uma hora em temperatura ambiente. Após a sônicação, centrifugar o frasco a 24.000 vezes g durante seis horas. Então colete a solução sobrenante.Adicione um mililitro da solução de nanotubo de carbono de parede única a um dispositivo de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 quilodalton, seguido por quatro mililitros de água esterilizada sem nuclease. Centrifugar por 10 minutos a 4.000 vezes g à temperatura ambiente para remover o excesso de amina. Adicione 0,5 miligramas de Sulfo-LC-SPDP a 450 microliters do nanotubo de carbono de parede única funcionalizado amina.Em seguida, adicione 50 microliters de 10x PBS, e incubar por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura de reação a um dispositivo de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 quilodalton, seguido por quatro mililitros de água sem nuclease. Centrifugar a amostra por 10 minutos a 4.000 vezes g à temperatura ambiente para remover o excesso de Sulfo-LC-SPDP.Colete a solução de nanotubo de carbono de uma parede única tratada pelo Sulfo-LC-SPDP deixada no filtro e dilua-a com 500 microliters de solução anti-MALAT1-Cy3 previamente preparada. Em seguida, incubar a amostra a quatro graus Celsius durante a noite. Para alcançar os melhores resultados de comparação, organize aleatoriamente 14 ratos em grupos de ensaio ou controle com sete em cada grupo, e com a mesma proporção homem-mulher em cada grupo.Em seguida, limpe o banco de operação e esterilize-o com 70% de álcool etílico. Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer um dos ratos para ajudar a veia da cauda a aparecer. Contenha o mouse corretamente com um conterrático de injeção de cauda.Injete células MM.1S-luc/mCherry em 50 microliters de PBS através da veia traseira. Pressione o local da injeção com um cotonete de álcool por 30 segundos. Em seguida, marque o rato injetado e devolva-o para uma gaiola limpa.No sétimo dia, após a injeção de células MM1S, injete 50 microliters de PBS contendo nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1 na veia traseira do mouse. Em seguida, pressione o local da injeção com um cotonete de álcool por 30 segundos. Observe o sangramento local na cauda e o comportamento geral do rato por um minuto e, em seguida, devolva-o para uma gaiola limpa.Observe todos os camundongos injetados novamente antes de retornar a gaiola para o rack para garantir que as injeções sejam toleradas bem. Pesar cada rato antes da dissecação. Colete sangue periférico do coração para um ensaio completo de contagem sanguínea realizado por uma máquina de contador de células sanguíneas.Em seguida, recolham os tecidos da medula óssea, baço, linfonodo, rim e tecido com metástase visível. Extrair RNA e proteína das amostras de medula óssea. Conserte todos os tecidos restantes em formalina.Após 24 horas de fixação, mergulhe as amostras ósseas em uma solução EDTA 0,5 molar por cinco dias para descalcificação. Em seguida, mergulhe todas as amostras em 75% de álcool etílico para armazenamento a longo prazo. Os resultados do QRT PCR mostraram que o DNA de gapmer anti-MALAT1 derrubou a expressão MALAT1 e induziu significativamente a apoptose nas células H929 e MM.1S.Nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1-Cy3 foi entregue no núcleo das células MM, e suprimiu significativamente o nível de MALAT1 endógeno em ambas as células H929 e MM.1S. A viabilidade da célula BMEC-1 não tem diferença significativa após o tratamento do nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1-Cy3 ou controle em diferentes dosagens e pontos de tempo. Isso indica que a toxicidade do nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1-Cy3 tem uma toxicidade limitada e aceitável para células normais em alta dosagem.Um modelo de camundongos disseminado por MM humano foi criado para avaliar os efeitos de tratamento do nanotubo de carbono de parede única anti-MALAT1 in vivo. Os sinais de luciferon de camundongos no grupo de tratamento anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de parede única foram notavelmente menores em comparação com o controle após 21 dias de tratamento. A partir desses resultados, concluiu-se que o tratamento anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de parede única através de injeção intravenosa poderia fornecer os oligos anti-MALAT1 para as células tumorais efetivamente.Não foram observados efeitos colaterais significativos do tratamento, indicando que a injeção anti-MALAT1 de nanotubo de carbono de parede única é um tratamento seguro para camundongos. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que a composição da molécula celular influenciará a entrega, eficiência e efeito terapêutico dos medicamentos oligonucleotídeos. Após esse procedimento, outros métodos como a conjugação de proteínas ou pequenas moléculas podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais.Como usar nanotubos de carbono de parede única para entregar outras drogas.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

As células humanas mieloma múltiplo (MM) requerem o microambiente favorável de células mesenquimais e componentes da matriz extracelular para a sobrevivência e proliferação. Nós estabelecemos um modelo vivo de embriões em frango com células de mieloma e mesenquimais humanas enxertados para estudar os efeitos de medicamentos contra o câncer no crescimento do tumor, invasão e angiogênese.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Aqui, descrevemos um método de microscopia de lapso de tempo de longo prazo para rastrear longitudinalmente células individuais em resposta à terapêutica anticâncer.

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

Aqui descrevemos a entrega de microRNA utilizando um vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 em um modelo do rato de uma doença neuromuscular. Uma única administração periférica em camundongos resultou em superexpressão de miRNA sustentada no músculo e neurônios motores, oferecendo uma oportunidade de estudo miRNA função e potencial terapêutico em vivo.

Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

Este protocolo descreve o xenograft e os modelos transplantação orthotopic do do rato do tumorigênese humano do tiróide como uma plataforma para testar tratamentos microRNA-baseados do inibidor. Esta abordagem é ideal para estudar a função de RNAs não codificantes e seu potencial como novos alvos terapêuticos.

In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Aqui, descrevemos o protocolo para entrega in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro carregando oligômeros de RNA para câncer de mama metastático em modelos animais, fornecendo uma abordagem clinicamente viável para o silenciamento terapêutico de ácidos nucléicos oncogênicos.

Monitoramento do acúmulo de nanodrogas em metástases de câncer de mama murino

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeo em um modelo animal de glioblastoma multiforme

Aprenda a empacotar oligonucleotídeos com nanotubos de carbono de parede simples para entrega de fármacos em mieloma múltiplo. Este método melhora a eficiência terapêutica in vitro e in vivo.

Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos (Vídeo) | JoVE Journal

Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos

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