Estimativa do número de néfron em rim inteiro usando o método de maceração ácida

O método de maceração ácida pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o rim e como genes específicos contribuem ou influenciam o desenvolvimento de nefron, bem como como condições específicas, como diabetes ou hipertensão, afetam o número de nefron. Isso é importante, pois um número total de nefrões com os indivíduos nascidos é determinado durante o desenvolvimento fetal e a perda de nefrões tem sido associada à patologia renal. As principais vantagens do método de maceração ácida são que ele é mais rápido, mais reproduzível, barato e menos demorado do que outros métodos de contagem de nefradeiras, como a ressonância magnética.

Essa técnica facilita a correlação do impacto no número de nefron na função renal, o que é importante para aprofundar nossa compreensão de como genes específicos influenciam a função e o desenvolvimento do nefron. O estudo de genes ou fatores que influenciam o número global de nefrons será fundamental no desenvolvimento de abordagens farmacológicas ou genéticas projetadas para limitar a perda de nefron associada à doença. Com uma boa técnica experimental e prática, os indivíduos novos neste método devem facilmente ganhar domínio do método de maceração ácida, permitindo estimativas confiáveis e reprodutíveis de números inteiros de nefronais.

Comece usando uma tesoura cirúrgica fina para abrir a cavidade abdominal do rato ao longo da linha média. Mude cuidadosamente os intestinos e adiposos reprodutivos para o lado direito do animal. Usando dissecção grosseira, isole o rim esquerdo e corte a artéria renal esquerda e a veia para remover cuidadosamente o rim colocando o órgão em um barco de pesagem apropriadamente rotulado de PBS.

Colete o rim direito da mesma maneira e coloque ambos os rins em uma gaze cirúrgica pré-umedecido com PBS. Remova rapidamente qualquer tecido não renal aderente e as cápsulas renais. Em seguida, peso cada rim registrando individualmente o peso do órgão esquerdo e direito separadamente.

Após a pesagem, coloque cada rim de volta em um barco de pesagem apropriadamente rotulado sem PBS e use uma lâmina de barbear limpa para cortar cada órgão ao meio do comprimento. Coloque cada rim meio cortado lado para baixo e corte cada metade em dois milímetros ou pedaços menores. Usando a mesma lâmina de barbear, transfira cuidadosamente os pedaços de rim picados em um tubo cônico de 15 mililitros apropriadamente rotulado.

Em um capô de fumaça bem ventilado, adicione cinco mililitros de seis ácidos clorídricos molares a cada tubo. Em seguida, agitar suavemente as misturas de ácido renal antes de colocar os tubos em um banho de água de 37 graus Celsius por 90 minutos. No final da maceração ácida, conecte uma agulha de calibre 18 a uma seringa de cinco mililitros por rim e remova cuidadosamente os êmbolos da seringa.

Coloque as seringas em tubos cônicos individuais de 50 mililitros no capô da fumaça e despeje as soluções renais na extremidade aberta de cada seringa, deixando os tubos vazios de lado em um rack de tubo de ensaio. Em seguida, substitua cuidadosamente os êmbolos pela lenta extrusão de cada solução através das agulhas nos tubos de 50 mililitros. Lave os tubos cônicos de 15 mililitros com cinco mililitros de solução PBS por tubo rodando o PBS para solubilizar qualquer tecido renal restante.

Extrude o conteúdo da lavagem no tubo apropriado de 50 mililitros como apenas demonstrado. Depois de extrusir a terceira lavagem, aparelha cada seringa com uma agulha calibre 21. Extrude o conteúdo dos tubos de 50 mililitros em um segundo conjunto de tubos de 50 mililitros através da menor lavagem de agulha de furo e extrude o conteúdo do primeiro tubo de 50 mililitros três vezes com PBS fresco como demonstrado.

Após a terceira lavagem e extrusão, leve o volume total em cada tubo até 50 mililitros com PBS adicional e coloque os tubos em um rack em uma placa de roqueiro a quatro graus Celsius durante a noite. Dentro de cinco dias após o processamento, coloque uma grade contendo 16 seções separadas na parte inferior de seis poços de uma placa de 12 poços. Inverter suavemente os tubos de solução renal várias vezes para resuspensar os tecidos pelleted.

Adicione cuidadosamente três alíquotas de 500 microliter de cada solução homogeneizada por rim a cada um dos três poços da placa de 12 poços. Diluir o conteúdo de cada poço com um volume igual de PBS. Coloque a placa no palco de um microscópio invertido.

Identifique o glomeruli por sua estrutura esférica, matiz avermelhado, e as pressáculas pré ou pós-arterials ligadas aos corpos de glomeruli individual. Conte o número de glomeruli por cada seção gridded para somar a contagem por grade para cálculo do número total de glomeruli por poço. Em seguida, multiplique o número de glomeruli por bem vezes 100 para obter o número médio de glomeruli por rim.

Neste experimento representativo, o número total de nefron em camundongos infundidos com veículo por 14 dias foi de cerca de 12.500 nefrões por rim. A angiotensina duas infusão, no entanto, aumentou a pressão atrial em aproximadamente 40 milímetros de mercúrio e foi associada a uma redução significativa de quase 26% no número total de nefron. Neste modelo genético de agênese renal de rato, os animais nascidos com dois rins foram calculados para conter cerca de 27.500 nefrões por rim após maceração ácida como demonstrado, enquanto ratos nascidos com um rim solitário foram encontrados com números de nefron total significativamente menores.

As estimativas de ambos os experimentos foram consistentes com as faixas relatadas anteriormente em ratos. O método de maceração ácida é ideal para estimar números de nefron em rins inteiros, especialmente em laboratórios não equipados com técnicas mais intensivas e proibitivas de custo para a contagem de nefrões, como o método fracionado de setor ou ressonância magnética. Este método permite uma estimativa elevada, eficiente e reprodutível de um número inteiro de nefron renal que está dentro de 5% dos números determinados por ressonância magnética.

A avaliação do número de nefron é de relevância clínica, pois a redução do número de nefrons tem sido associada a um aumento do risco de doenças cardiovasculares, como doença renal crônica. Não se esqueça que trabalhar com ácido clorídrico pode ser extremamente perigoso e que precauções devem ser tomadas, como usar luvas, óculos de proteção e um casaco de laboratório.