Name: Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a detectar e subtipar Salmonella em alimentos e amostras ambientais usando sequenciamento quase-metagenômico. Este método integra separação imunomagnética e amplificação por deslocamento múltiplo para rastreamento rápido de patógenos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostaria de agradecer a Mark Harrison e Gwen Hirsch da Universidade da Geórgia para fornecer gentilmente a estirpe bacteriana e outro apoio para este estudo.

1. preparação da amostra
Nota: Amostras de alimentos preparadas para pré-enriquecimento de acordo com o guia de laboratório de microbiologia (MLG) do Estados Unidos Departamento de agricultura da segurança alimentar e Inspection Service (USDA-FSIS)11 e bacteriológica manual analítico (BAM) do alimento de Estados Unidos e Drug Administration (FDA)12.
<ol><li>Assepticamente, coloque uma porção de 25 g de amostra de alimentos como pimenta preta, peito de frango, carne moída e brotos de alfafa ou um cotonete ambiental em um saco de liquidificador de laboratório estéril com um filtro incorporado. Prepare um cotonete ambiental assepticamente umedecendo uma esponja com caldo de enriquecimento (Rappaport-Vassiliadis, RV). Em seguida, arraste o swab sobre toda a superfície ou área pré-determinada e colocá-lo em um saco de liquidificador de laboratório.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58612/58612fig1.jpg"> Figura 1: representante alimentos e amostras ambientais para detecção de quasi-metagenômica e subtipos de salmonelas. As amostras são colocadas em sacos de filtro estéril stomacher juntamente com caldo de RV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58612/58612fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Misturar cuidadosamente cada 25 g amostra com 225 mL de enriquecimento RV caldo usando uma massagem de liquidificador ou mão de laboratório por 30 s. Nota: Variantes de caldo de RV, tal como recomendado pelo MLG e BAM podem ser utilizadas dependendo tipos de amostra.</li>
	<li>Incube a mistura amostra-enriquecimento caldo em uma incubadora de laboratório a 42 ° C para 4 – 24 h.</li>
	<li>Após a incubação, colete uma subamostra de 50 mL de caldo de enriquecimento do lado filtrado do saco em um tubo de centrífuga de 50ml separado.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 100 x g durante 10 minutos remover os resíduos sólidos no homogeneizado.</li>
	<li>Recupere o sobrenadante cuidadosamente para um novo 50ml centrifugar o tubo e centrifugar os tubos em 3.000-6.000 x g durante 10 minutos recuperar centrifugado.</li>
	<li>(Opcional) Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento por re-suspensão em 5 mL de água peptona tamponada (BPW) e centrifugar os tubos a 3.000-6.000 × g por 10 min. Nota: BPW pode preparado pela dissolução de 10 g de peptona, 5 g de cloreto de sódio, 3,5 g de dissódico fosfato, e 1,5 g de Fosfato monopotássico em 1 L de água destilada. O pH final deve ser ajustado para 7,2 ± 0,2 a 25 ° C. Autoclave a 121 ° c durante 15 min. BPW comercialmente disponível também pode ser usado.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de água peptonada tamponada.</li>
</ol>2. Fima separação (IMS) e vários deslocamento Amplification (MDA)
Nota: Para evitar a contaminação cruzada entre amostras, trabalhar em uma armário de biossegurança, mudar pontas de pipeta para cada tubo, evite tocar o tubo com a pipeta e não coloque os tubos juntos em suporte magnético durante a etapa de lavagem.
<ol><li>Descongele os buffers de amostra e a reação do kit de MDA no gelo ou a 4 ° C com antecedência.</li>
	<li>Misturar 1 mL de célula re-suspensa em BPW de pelotas com 20 μL de anti -Salmonella grânulos em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e coloque-o sobre o misturador rotativo durante 30 min à temperatura ambiente. Nota: Flora competitiva, partículas de gordura e proteínas em ressuspenso podem interferir com a IMS. Diluição de centrifugado re-suspenso em água peptonada tamponada é útil para reduzir a perda dos grânulo -Salmonella complexos do suporte magnético durante as etapas de lavagem.</li>
	<li>Inserir os tubos magnético stand e permitir que 3 min para a correcta recuperação dos grânulos do rack várias vezes por inversão para concentrar as contas em uma bolinha no lado do tubo.</li>
	<li>Manter os tubos sobre o suporte magnético. Aspirar e desprezar o sobrenadante de cada tubo, bem como o líquido restante na tampa de cada tubo. Nota: Tenha cuidado para não perturbar a pelota de grânulos IMS na parede lateral do tubo contra o ímã.</li>
	<li>Retire o suporte de tubo do suporte magnético e adicionar 1 mL de tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% (v/v) polissorbato 20) e inverter várias vezes para remover bactérias de ligação não específica do complexo.</li>
	<li>Repita as etapas de 2.3-2.5 duas vezes.</li>
	<li>Após a lavagem 3rd , realizar a separação magnética final de contas, repetindo as etapas 2.3 – 2.4. Retire os tubos do magnética cremalheira e colocá-los em uma microcentrífuga para 1 s para spin para baixo de grânulos. Em seguida, coloque os tubos no suporte magnético para 3 min antes de remover qualquer tampão de lavagem residual.</li>
	<li>Ressuspender os grânulo - complexos deSalmonella em 9 μL de tampão de amostra e incubar a 95 ° C por 3 min para desnaturação.</li>
	<li>Após refrigerar a 4 ° C, no gelo, combinar com 9 μL de tampão de reação mais 1 μL de enzima misturar e manter no gelo.</li>
	<li>Em um termociclador, incube os tubos a 30 ° C, durante 2 h para amplificação, seguida de aquecimento a 65 ° C durante 10 minutos para inativar a enzima e legal a 4 ° C no gelo.</li>
	<li>Avalie a quantidade e a qualidade dos produtos MDA medindo-se a concentração de DNA e pureza (260/280 relação &gt; 1.8) em um instrumento de fluorospectrometer. Nota: Por causa da ligação não-específica dos grânulos IMS, DNA genômico de organismos que não a Salmonella é susceptível de estar presente nos produtos da MDA, mas não afeta a jusante análise.</li>
	<li>Armazene os produtos finais (20 μL) a-20 ° C até o uso de PCR em tempo real e/ou elaboração de biblioteca para o sequenciamento de quasimetagenomics.</li>
</ol>3. real-time PCR
Nota: Este passo é opcional para a detecção de Salmonella sem subtipos, 1) e 2) avaliar a qualidade da amostra antes da sequenciação de quasimetagenomics.
<ol><li>Preparar 18 μL de mistura PCR por amostra, contendo Universal PCR Master Mix (10 μL), em frente a primeira demão (2 μL, 900 nM), reverter a primeira demão (2 μL, 900 nM), sonda (2 μL, 250 nM) e água da classe molecular (2 μL). Nota: Salmonella-primeiras demão do oligonucleotide específica (para a frente: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, reverso: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) e sonda foram concebidos para amplificar uma sequência dentro do gene ttr (GenBank adesão n 94. AF 282268)13.</li>
	<li>Misture o produto MDA da etapa 2.12 pipetando delicadamente acima e abaixo do grânulo -Salmonella complexos junto com líquido para criar uma suspensão. Adicione 2 µ l da suspensão em 18 μL de mistura PCR.</li>
	<li>Executar o PCR em tempo real, usando um protocolo otimizado de PCR em tempo real, especificar dois períodos de exploração, uma a 50 ° C por 2 min e outra a 95 ° C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 60 s.</li>
	<li>Calcule o ciclo de limiar (Ct), que é o número de ciclos necessários para a fluorescência de DNA amplificado para cruzar a linha de limite. Nota: A linha de limite é definida na fase linear entre a linha de base e planalto dos lotes de amplificação das amostras. Resultados negativos correspondem aos valores de Ct por 40 ou amostras com valores de Ct maiores do que a do controlo negativo.</li>
</ol>4. Biblioteca preparação para o sequenciamento de Quasimetagenomic
Nota: Os produtos MDA podem ser sequenciados por ambos curto ler e ler muito tempo (nanopore) plataformas de sequenciamento. Use a versão mais recente dos kits de preparação de biblioteca DNA fornecidas pelos fabricantes das plataformas de sequenciamento. Execute a preparação de biblioteca de DNA de acordo com as instruções dos fabricantes. Use o protocolo de DNA genômico baixa-entrada 2D para preparação de biblioteca para o sequenciamento de leitura longa plataforma5. Para a preparação de biblioteca para a plataforma de sequenciamento de curto-leitura, pequenas modificações ao protocolo do fabricante são fornecidas abaixo.
<ol><li>Segui métodos de preparação de biblioteca padrão, adicionando soluções tampão e reagentes para produtos MDA. Transferir 40 μL dos produtos MDA sequenciamento preparado para um novo prato e adicionar 20 μL de grânulos de purificação de PCR para cada poço.</li>
	<li>Incube a placa na temperatura de quarto por 10 min sem tremer.</li>
	<li>Lave os grânulos com 80% de etanol e secar as contas por 12 min.</li>
	<li>Re-suspender grânulos secos em 53 μL de tampão de ressuspensão e incubar por 2 min sem tremer.</li>
	<li>Diluir e bibliotecas, seguindo as instruções do fabricante da piscina. Nota: Uma 22:00 em pool e desnaturada biblioteca está agora pronta a ser sequenciado.</li>
</ol>

<ol><li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li>
<li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+metagenomic+sequencing+to+food+safety%3A+detection+of+Shiga+Toxin-producing+Escherichia+coli+on+fresh+bagged+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).</li>
<li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-Level+Discrimination+of+Shiga+Toxin-Producing+Escherichia+coli+in+Spinach+Using+Metagenomic+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing.</a> PLoS One. 11 (12), e0167870(2016).</li>
<li>Hyeon, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasi-metagenomics+and+realtime+sequencing+aided+detection+and+subtyping+of+Salmonella+enterica+from+food+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Hyeon, J. Y., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+raw+chicken+breast+using+real-time+PCR+combined+with+immunomagnetic+separation+and+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification.</a> Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).</li>
<li>Hosono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+whole-genome+amplification+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples.</a> Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).</li>
<li>Seth-Smith, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+to+prepare+samples+of+leafy+green+vegetables+for+preenrichment+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual+Salmonella+culture+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method.</a> Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).</li>
<li>Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+the+isolation+of+Salmonella+from+alfalfa+and+mung+bean+seeds+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual%27s+Salmonella+culture+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method.</a> Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+subtyping+methods+against+a+whole-genome-sequencing+standard+for+Salmonella+enterica+serotype+Enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).</li>
<li>Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook">https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook</a> (2018).</li>
<li>Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2018).</li>
<li>Malorny, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+real-time+PCR+for+detection+of+Salmonella+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).</li>
<li>June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth%2C+tetrathionate+broth%2C+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+from+raw+flesh+and+other+highly+contaminated+foods%3A+precollaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study.</a> Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).</li>
<li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth%2C+tetrathionate+broth%2C+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46(2014).</li>
<li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="https://peerj.com/articles/cs-20/?utm_source=TrendMD&utm_campaign=PeerJ_TrendMD_0&utm_medium=TrendMD">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li>
<li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864(2009).</li>
<li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+%28VBNC%29+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103(2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Por causa da abundância, muitas vezes de baixa e homogênea em presença de salmonelas em alimentos e amostras ambientais, enriquecimento de cultura antes de IMS-MDA é ainda necessário para a detecção de Salmonella e subtipos; é, portanto, uma etapa crítica do protocolo. Para identificar as condições ideais para aumentar a abundância de Salmonella em relação à flora de fundo de amostra, mídia de enriquecimento diferentes pode ser avaliadas para amostras específicas. De acordo com MLG e BAM, ambos...

Metagenômica sequenciamento teoricamente permite a deteção concertada e subtipos de agentes patogénicos de origem alimentar. No entanto, amostras de alimentos apresentam desafios para a análise de patógeno por sequenciamento direto de microbiome a comida. Primeiro, agentes patogénicos de origem alimentar estão frequentemente presentes em níveis baixos em amostras de alimentos. A maioria dos métodos de detecção rápida disponível comercialmente ainda exige 8 – 48 h cultivo para enriquecer as células do patógeno a um nível detectável1. Em segundo lugar, muitos alimentos contêm células microflora abundante e/ou comida DNA, fazendo o DNA de patógeno de origem alimentar uma pequena fração de metagenome de comida e um alvo evasivo para deteção e subtipos directo por sequenciamento de metagenomic.
Modificação de microbiomes de alimentos tem sido relatada para permitir uma concentração substancial de patógeno de origem alimentar DNA para facilitar a detecção baseada em sequenciamento de Shiga toxina-produzindo Escherichia coli2,3 e Salmonella typhi4. Porque os alimentos modificados microbiomes ainda são misturas de diferentes espécies microbianas, seu sequenciamento é denominado como análise de quasi-metagenomic4. Microbiome modificação pode ser executada por cultura enriquecimento sozinho2,3 , ou em combinação com separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA)4,5. IMS seletivamente pode capturar células do patógeno de cultura de enriquecimento através de grânulos magnéticos revestido de anticorpo. MDA pode gerar quantidades suficientes de DNA genômico para sequenciamento através de de DNA polimerase o altamente eficiente ɸ296. IMS-MDA permitiu a deteção do agente patogénico independente de cultura de amostras clínicas7e encurtamento do enriquecimento da cultura para a deteção de quasi-metagenomic e subtipos de salmonelas em alimentos amostras4.
O objetivo geral deste método é preparar DNA quasi-metagenomic de amostras de alimentos para permitir a concentração alvo de DNA genômico de Salmonella e detecção subsequente e subtipos do contaminante Salmonella por sequenciamento. Em comparação com métodos padrão para a deteção de Salmonella 8,9 e10de subtipos, a abordagem quasimetagenomic substancialmente pode encurtar o tempo de retorno de alimentos contaminados e amostras ambientais para subtipos moleculares do patógeno Unificando os dois normalmente separaram análises em um único fluxo de trabalho. Este método é particularmente útil para aplicações como reação a epidemias transmitidas por alimentos e outras investigações de volta de rastreamento onde patógeno robusto subtipos é necessário além de deteção de patógenos e rápida reversão analítica é importante.

<table><tbody><tr><td>Saco de liquidificador de laboratório com filtro</td><td>VWR</td><td>10048-886</td><td></td></tr><tr><td>Água peptonada tamponada</td><td>Produtos de Micorbiologia Oxóide</td><td>CM0509</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Rappaport Vassiliadis</td><td>Neogen Acumedia</td><td>7730A</td><td></td></tr><tr><td>Polissorbato 20&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Stomacher liquidificador</td><td>Seward&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> 30010108 <td>Fisher Scientific</td><td>75005194</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Techne Prime</td><td>EW-93945-13</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Termociclador em Tempo Real</td><td>Applied Biosystems</td><td>4.76357</td><td></td></tr><tr><td>Contas AMPure XP</td><td>Colar Beckman</td><td>A63881</td><td>grânulos de purificação de PCR; misture bem antes de usar; loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Nextera XT kit de preparação de biblioteca</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Loja em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>MinIon kit de preparação para biblioteca</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK108</td><td>Armazenar em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Dynabead Anti-Salmonella beads</td><td>Applied Biosystems</td><td>71002</td><td>Vortex bem antes de usar</td></tr><tr><td>Illustra GenomiPhi V2 Kit de amplificação de DNA (kit MDA) -Tampão de amostra -Tampão de reação -Mistura enzimática</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-30</td><td>Armazene a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>HulaMixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag rack magnético</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR mastermix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td>Misture bem antes de usar; armazene a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr></tbody></table>

quasi-metagenomic análise de salmonella de alimentos e amostras ambientais

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Sequenciamento de quasi-metagenomics refere-se à análise baseada no sequenciamento de microbiomes modificada de alimentos e amostras ambientais. Neste protocolo, modificação de microbiome é projetada para concentrar o DNA genômico de um contaminante de patógeno de origem alimentar alvo para facilitar a detecção e subtipos do patógeno em um único fluxo de trabalho. Aqui, vamos explicar e demonstrar as etapas de preparação de amostra para análise de Salmonella typhi quasi-metagenômica de representante alimentos e amostras ambientais, incluindo os rebentos de alfafa, pimenta preta moída, carne à terra, peito de frango e amostras ambientais. Amostras são submetidas primeiro para o enriquecimento da cultura de Salmonella para uma duração encurtada e ajustável (4 – 24 h). Células de Salmonella são então seletivamente capturadas da cultura enriquecimento por Fima separação (IMS). Finalmente, vários deslocamento amplificação (MDA) é executada para amplificar o DNA das células IMS-capturado. A saída de DNA do presente protocolo pode ser sequenciada por plataformas de sequenciamento de alto rendimento. Uma análise PCR quantitativa opcional pode ser realizada para substituir o sequenciamento para a deteção de Salmonella ou avaliar a concentração de salmonela DNA antes de sequenciamento.

Antes de sequenciamento de quasimetagenomic, a quantidade e a pureza dos produtos IMS-MDA geral podem ser avaliadas por fluorospectrometer (tabela 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Tempo de enriquecimento (h)</td>
			<td>Valor de CT</td>
			<td>Concentração (ng/ul)</td>
			<td>Pureza (260/280)</td>
		</tr>
<tr>
<...

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras de DNA de alimentos e ambiental microbiomes para detecção concertada e subtipos de salmonelas através do sequenciamento de quasimetagenomic. O uso combinado de enriquecimento da cultura, separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA) permite a concentração eficaz de salmonelas de DNA genômico de amostras ambientais e alimentos.

Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Este método pode ser usado para detectar Salmonella a partir de amostras de alimentos e identificar o patógeno ao nível da cepa através da impressão digital genética. A principal vantagem desta técnica é que ela combina a detecção e subtipação de Salmonella em um único fluxo de trabalho e encurta substancialmente o tempo de retorno da amostra de alimentos contaminadas por Salmonella à impressão digital do patógeno. Para começar, coloque aseptamente uma amostra de 25 gramas de alimento dentro de um saco de liquidificador de laboratório estéril com um filtro embutido ou prepare opcionalmente um cotonete ambiental, asepticamente umedecendo uma esponja com caldo de enriquecimento, arrastando-a através de uma superfície pré-determinada e colocando-a dentro de um saco de liquidificador.Usando um liquidificador de laboratório, misture completamente cada amostra com 225 mililitros de caldo de enriquecimento rv. Em seguida, incubar a mistura a 42 graus Celsius por quatro a 21 horas. Depois disso, colete uma subsamima de 50 mililitros de caldo de enriquecimento do lado filtrado da bolsa.Em seguida, centrifufique a subsample em 100 vezes g por 10 minutos. Transfira cuidadosamente o supernasal

quasi-metagenomic-analysis-salmonella-from-food-environmental

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda...

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A imunoprecipitação de cromatina, juntamente com o sequenciamento de última geração (ChIP-seq), é um método usado para estabelecer interações entre fatores de transcrição e as sequências genômicas que eles controlam. Este protocolo descreve técnicas para a realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, usando salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme bacteriano como um exemplo.

Descobrindo metas regulatórias csgd em salmonella biofilme usando imunoprecipitação de cromatina e sequenciamento de alta produtividade (ChIP-seq)

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) que tem atraído amplo interesse no campo de detecção de patógenos. Aqui, apresentamos um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios como um método rápido, confiável e robusto para a triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmando salmonela presuntiva do isolamento cultural.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Esta plataforma computacional analítica fornece orientação prática para microbiologistas, ecologistas e epidemiologistas interessados em genômica populacional bacteriana. Especificamente, o trabalho aqui apresentado demonstrou como realizar: i) mapeamento guiado por filogenia de genótipos hierárquicos; ii) análise baseada em frequência de genótipos; iii) análises de parentesco e clonalidade; iv) identificação da linhagem diferenciando loci acessório.

Mineração heurística de genótipos hierárquicos e genoma acessório Loci em populações bacterianas

A salmonela invade e se replica no interior das células epiteliais intestinais tanto em vacúolos específicos de Salmonella quanto livre no citosol (hiper-replicação). Um protocolo baseado em microscopia de fluorescência de alto rendimento é descrito aqui para quantificar os fenótipos intracelulares de Salmonella por meio de duas análises de imagem complementares através do ImageJ, alcançando resolução e pontuação de célula única.

Análise Automatizada de Fenótipos Intracelulares de Salmonella utilizando ImageJ

A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

Aprenda a detectar e subtipar Salmonella em alimentos e amostras ambientais usando sequenciamento quase-metagenômico. Este método integra separação imunomagnética e amplificação por deslocamento múltiplo para rastreamento rápido de patógenos.

Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais

Explorar mais vídeos