Name: Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a manipulação optogenética de circuitos neurais durante o monitoramento de sono e vigília em ratos. Este método combina EEG/EMG em tempo real para estudar a regulação do sono.

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Este estudo foi apoiado pelo programa de estudos do investigador da Merck (#54843), um subsídio de ajuda de KAKENHI para pesquisa científica sobre áreas inovadoras, "WillDynamics" (16H06401) (TS), e um subsídio de KAKENHI para pesquisa exploratória em áreas inovadoras (TS) (18H02595).

Todos os experimentos aqui foram aprovados pelo Comitê de experimentação e uso de animais da Universidade de Tsukuba, cumprindo as diretrizes da NIH.
1. cirurgia animal, injeção de vírus, eletrodo para EEG/EMG, e implante de fibra óptica
Atenção: Devem ser seleccionadas técnicas adequadas de protecção e manuseamento, com base no nível de biossegurança do vírus a ser utilizado. O AAV deve ser usado em um quarto isolado P1A classific para a injeção, e o tubo que carreg AAV deve ser sterilized com uma autoclave depois que todo o volume é usado acima. O local cirúrgico e todo o material implantado devem ser limpos e estéreis durante o uso. Nota: Consulte a Figura 1.
<ol><li>Desinfecte o equipamento cirúrgico com a autoclave.</li>
	<li>Anestesie os camundongos com isoflurano usando um vaporizador anestésico. Observe até que o mouse atingiu a profundidade desejada de anestesia, determinada pela perda de resposta para beliscar a cauda com fórceps. Aplique a pomada oftálmica aos olhos para impedi-los de secar.</li>
	<li>Desinfete o campo cirúrgico com solução de iodo ou 70% EtOH (3x) e seque suficientemente. Permita que o vírus descongele no gelo enquanto a cirurgia está sendo executada. Cubra a área cirúrgica com papel de bancada de laboratório absorvente.</li>
	<li>Fixar a cabeça do mouse no aparelho estereotáxica com barras de ouvido e uma pitada de nariz. Depois de confirmar a cabeça é mantida de forma estável, fazer uma incisão midsagital no couro cabeludo para garantir que as posições da Bregma e lambda estão localizados no mesmo nível em uma linha horizontal.</li>
	<li>Para evitar uma lacuna de posicionamento, ajuste apropriadamente os níveis da pitada de nariz e das barras de orelha para cima e para baixo. A Bregma e a lambda referem-se à interseção entre os sutura saggitalis e sutura coronalis ou sutura lambdoidal, respectivamente (Figura 2).</li>
	<li>Use as braçadeiras de Serafin para prender a pele para manter o acesso ao crânio. Após a exposição do crânio, desinfete a superfície do crânio com iodo ou 5% H2o2, para permitir que as suturas cranianas, incluindo a Bregma e lambda para ser visualizado mais claramente.</li>
	<li>Prepare a injeção do vetor de AAV:
	<ol>
<li>Lave o interior de uma seringa de 10 mL (ver tabela de materiais) sequencialmente com 70% etoh, 100% EtOH, e água esterilizada, 5 vezes cada. Fixe a seringa na braçadeira de um braço da bomba da microinjecção e certifique-se que toda a solução na seringa está descarregada.</li>
		<li>Aspirar com cuidado 2 μL de óleo mineral sem bolhas de ar, em seguida, aspirar o volume designado da solução de vírus. Após a aspiração, manipule o botão do êmbolo e confirme que a solução de vírus surge na ponta da agulha. Nota: O volume de injeção da solução de vírus foi determinado em experimentos piloto usando a mesma cepa do mouse e o mesmo produto de vírus. A relação entre o volume de solução de vírus e a extensão da área de infecção deve ser estimada com antecedência.</li>
	</ol></li>
	<li>Injete o vetor de AAV:
	<ol>
<li>Ajuste a ponta da agulha de microinjecção na Bregma e anote as coordenadas como o ponto original. Mova a ponta para o local de injeção designado (para o BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) e coloque a ponta da agulha sobre a posição. Coloque uma marca no crânio e faça furos de aproximadamente 2 mm de diâmetro usando uma broca odontológica com um cortador de carboneto de 0,7 mm. Tenha cuidado para não danificar a dura ou o tecido cerebral.</li>
		<li>Depois de remover o sangue ao redor dos furos com um cotonete, mova lentamente a agulha para a posição do BNST. Injete lentamente a quantidade designada de solução de vírus (0, 7 μl/min) com um microinjector mecânico. Depois de completar a injeção, deixe a agulha durante 5 min para permitir que a solução se infiltre suficientemente no tecido BNST. Retire cuidadosamente a agulha.</li>
		<li>Para a injecção bilateral, repita os passos 1.8.1-1.8.2 do outro lado. Durante todo o procedimento, mantenha o crânio úmido com aplicações de soro fisiológico estéril. Nota: Utilizamos implantes de EEG/EMG personalizados (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) com quatro eletrodos de EEG (4 mm), dois eletrodos EMG (2 mm; corte o eletrodo de 4 mm a 2 mm com pinças) e 6 eletrodos (4,5 mm) (Figura 2a).</li>
	</ol></li>
	<li>Solda dois fios de aço inoxidável (ver tabela de materiais) a partir do qual 1 mm do isolamento é retirado ambas as extremidades para os eletrodos EMG. Ajustar o centro dos eletrodos para a Bregma e marcar a posição de cada eletrodo de EEG (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm), e determinar a posição do implante (Figura 2b).</li>
	<li>Implante fibras ópticas:
	<ol>
<li>Prenda uma ponteira de fibra óptica ao manipulador e gire o braço manipulador para que ele tenha um ângulo de ± 30 ° contra uma linha horizontal (este processo só é necessário para evitar interferências entre eletrodos e fibras ópticas, como no caso da estimulação BNST). Coloque a ponta de fibra na Bregma e registre as coordenadas.</li>
		<li>Mova a ponta para a linha de inserção direcionada e marque a posição no crânio. Também colocar marcas adicionais perto do local de inserção para os parafusos de ancoragem. Perfure o crânio em cada local com uma broca dental para inserir a fibra óptica e fixar o parafuso. Conserte o parafuso no crânio. Tenha cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido por parafuso.</li>
		<li>Insira a fibra óptica suavemente até chegar acima do BNST com um manipulador. A virola deve descansar sobre o crânio remanescente (Figura 1b).</li>
		<li>Aplique o cimento dental photocurable (veja a tabela dos materiais) para cobrir a fibra e o parafuso. O tempo de reação para solidificar a cola deve ser especificado pelo manual do fabricante (nosso material precisa de exposição à luz para pelo menos 10 s com comprimento de onda específico Photo-Generator. É desnecessário secar a cola depois disso).</li>
		<li>Nesta etapa, certifique-se de que nenhum material (parafuso ou cola) ocupe o espaço de montagem para os eletrodos. Além, evite fazer qualquer interrupção no cimento para a virola que conecta à fibra óptica e ao cabo. Repita as etapas 1.10.1-1.10.4 no lado oposto para a estimulação bilateral.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfure furos para elétrodos de EEG/EMG. Insira as pontas dos eléctrodos nos orifícios. Segure o implante e aplique adesivo de cianoacrilato no espaço entre o crânio e os eletrodos. Inserir novamente com atenção para não interferir com quaisquer materiais.</li>
	<li>Cubra a circunferência dos eletrodos e fibras ópticas com adesivo de cianoacrilato seguido de aplicação de cianoacrilato acelerante sobre o adesivo. Esta etapa evita causar qualquer interrupção no cabo de ponteira-a-ótica e na zona de conexão do fio eletrodo-a-chumbo (Figura 1C). Nota: Adesivo de cianoacrilato e seu acelerador são prejudiciais para o olho do mouse. Preste atenção para não causar derramamento destas substâncias químicas. Além disso, tenha cuidado para não tocar fortemente os eletrodos e as fibras, a fim de evitar o desvio inesperado imediatamente após a solidificação adesiva.</li>
	<li>Expor os músculos do pescoço do mouse e inserir os fios para o eletrodo EMG o músculo. Ajuste o comprimento do elétrodo do EMG de modo que localize apenas os músculos nuchal. A conexão clara entre a ponta do elétrodo e a fáscia do músculo é bastante para travar o sinal do EMG.</li>
	<li>Aplique adesivo de cianoacrilato para encher os implantes e solidificar o adesivo com líquido de aceleração. Em seguida, coloque o mouse sobre uma almofada de calor para a recuperação até que o reflexo postural aparece. Ajuste a temperatura da almofada de calor para a temperatura corporal de repouso animal (36,0 ° c no ZT 0-12 no caso de camundongos C57BL6; não exceda 38,0 ° c). Nota: Um antibiótico não é necessário para a cirurgia estéril.</li>
	<li>Siga suas diretrizes institucionais locais para analgesia pós-operatória. Manter os ratos em uma gaiola de casa para um período de recuperação de pelo menos 7 dias.</li>
</ol>2. monitoração de EEG/EMG com foto-Excitation de neurônios alvejados em Estados específicos do sono
Atenção: Este protocolo inclui o uso de equipamentos a laser classe 3B ou dispositivos LED. Os experimentadores devem estar cientes das informações de segurança. São necessários óculos de proteção para os olhos.
<ol><li>Antes de conectar o cabo do laser à fibra óptica, ajuste a intensidade do laser com um scaler. Tether a ponta do cabo do laser a uma fibra ótica não utilizada com uma virola e confirme que não há nenhum espaço na junção entre a fibra e o cabo.</li>
	<li>Gire sobre o interruptor principal do laser e espere 20 minutos para que aqueça acima.</li>
	<li>Emita o laser ao verificador da intensidade e ajuste a intensidade do laser a 10 mW/mm2. Mude o modo do laser à lógica do transistor e confirme que os pulsos claros estão emitidos da fibra controlada pelo regulador do teste padrão que é ajustado em 10 ms para a duração, 40 MS para o descanso, 20 vezes para o ciclo, e 20 vezes repetem (isto é, 20 hertz de pulsos claros de 10 ms para 20 s).</li>
	<li>Após o período de recuperação, mova os camundongos para a câmara experimental para a gravação de EEG/EMG. Os ratos da casa em uma constante 23 ° c com um 12 h de luz/ciclo escuro com alimentos e água disponível ad libitum.</li>
	<li>Conecte o eletrodo implantado e o adaptador de cabo que está amarrado a um anel deslizante para evitar o emaranhamento. Recomenda-se cobrir a junção com o material Light-impermeable tal como a folha de alumínio para impedir o escapamento do laser. Se for necessário um experimento bilateral, use um anel deslizante com um acessório bifurcado para os cabos.</li>
	<li>Neste protocolo, avaliamos a latência para vigília de sono NREM ou sono REM, de modo que o tempo de gravação deve ser limitado em tempo de zeitgeber otimizado (ZT0 é definido como o tempo em que a luz está ligado). Este protocolo foi conduzido entre ZT4-ZT10. Deixe os camundongos permanecer livremente na câmara experimental por pelo menos 1 h como aclimatização.</li>
	<li>Durante o período experimental, monitore os sinais de EEG e EMG no mesmo monitor e avalie o estado do mouse como vigília, sono NREM ou sono REM. Use o controle de ganho para cada onda para facilitar a distinção de cada Estado.</li>
	<li>Para a medida do sono de NREM à latência do vigília, observe o sono estável de NREM para 40 s ou o sono estável do rem por 30 s, a seguir gire sobre o interruptor do gerador do teste padrão para a fotoestimulação (este protocolo gera 20 hertz de pulsos claros de 10 ms para 20 s). Confirme a emissão de laser para as fibras ópticas implantadas.</li>
	<li>Grave sinais de EEG/EMG até que o estado adormecido mude para a vigília. Se dois ou mais ensaios experimentais forem necessários, limite a manipulação optogenética para uma vez por dia, porque a fotoestimulação é uma intervenção artificial que pode afetar a arquitetura do sono/vigília.</li>
	<li>Após o experimento, profundamente anestesiado e perfuso com soro fisiológico estéril e paraformaldeído (PFA) para amostragem de todo o cérebro para análise imuno-histoquímica26.</li>
</ol>3. análise do tempo de latência de NREM Sleep to wakefulness
<ol><li>Após a gravação de sinais de EEG/EMG, transfira os dados do sinal a um computador para marcar Estados do sono/vigília. Este protocolo descreve o método para a análise de EEG com software de gravação (veja tabela de materiais).</li>
	<li>Inicie o aplicativo de sinal de suspensão e clique na guia arquivo e selecione abrir para escolher os dados gravados (arquivo. KCD). Clique na guia Sleep para selecionar o tempo Epoch para ajustar a janela de tempo para cada Epoch (usamos 1 Epoch/4 seg).</li>
	<li>Marcar manualmente Estados de sono/vigília com base em sinais de EEG/EMG, de acordo com os seguintes critérios: vigília, alta EMG e baixa tensão de EEG com alta freqüência; NREM, baixo tom do EMG e tensão elevada de EEG com δ elevado (0.5-4 hertz) freqüência; e REM, EMG indica atonia muscular e baixa tensão de EEG com frequência alta θ (6-9 Hz). Um estado que não continue consecutivamente por 16 s (ou seja, 4 epochs) não é definido como uma alteração de estado porque não é um estado estável.</li>
	<li>Clique e segure o botão esquerdo do mouse na primeira época e arraste o cursor até que a tendência específica de mais de 16 s (4 epochs) seja encerrada. Em seguida, solte o botão esquerdo do mouse e escolha o estado apropriado (vigília ou sono NREM ou sono REM) na janela pop-up. Repita este procedimento para marcar todos os sinais de EEG/EMG gravados no arquivo.</li>
	<li>Encontre a hora exata da estimulação na época onde o EEG mostra o sono de NREM ou de REM, e a época que mostra a transição do estado que segue o ponto da estimulação. Conte o número de epochs entre os períodos logo após a estimulação e pouco antes da transição do estado.</li>
	<li>Em seguida, multiplicar número contado de epochs por 4 s (A). Na época da estimulação, tome um tiro de tela e meça a largura entre o ponto da estimulação e a extremidade do Epoch. Então, divida o comprimento medido pelo comprimento inteiro do Epoch e multiplique por 4 s (B). Da mesma forma, calcule a duração do sono NREM na época da mudança de estado, o que significa o tempo entre o início da época e o ponto de mudança de estado (C).</li>
	<li>Soma a, B e C para obter a latência do sono NREM para vigília. O mesmo procedimento é usado para a análise da transição do estado do sono do REM ao wakefulness.</li>
</ol>

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</ol>

Este projeto foi parcialmente apoiado financeiramente pela Merck & Co.

Nós apresentamos aqui um método para avaliar o efeito da estimulação optogenética dos neurônios com as identidades químicas particulares em transições do estado do sono/vigília e deu um exemplo da manipulação de neurônios de GABABNST . Nossos dados mostraram que a excitação optogenética de neurônios de GABABNST conduz à transição imediata do sono de NREM ao wakefulness.
Os vários projetos experimentais estão disponíveis por causa do desenvolvimento de tipos numerosos de f...

O sono é essencial para a função cognitiva ideal. Achados recentes também sugerem que distúrbios no sono estão associados a uma ampla gama de doenças1,2,3. Embora as funções do sono sejam ainda largamente não resolvidas, o progresso substancial foi feito recentemente em compreender os circuitos e os mecanismos neural que controlam Estados do sono/vigília4. Nos mamíferos, há três Estados de vigilância: vigília, sono não-rápido do movimento de olho (NREM), e sono rápido do movimento de olho (REM). A vigília é caracterizada por oscilações rápidas de EEG (5-12 Hz) de baixa amplitude com atividade motora proposital e sustentada. O sono NREM é definido por oscilações lentas (1-4 Hz) de alta amplitude (ondas delta), com falta de consciência e atividade motora proposital. O sono REM é caracterizado por oscilações relativamente rápidas (6-12 Hz) de baixa amplitude e atonia muscular bilateral quase completa5.
Borbely propôs uma teoria da regulação do sono-vigília conhecida como o modelo de dois processos6,7. Um processo homeostático, também conhecido como processo S, representa a pressão do sono que se acumula durante A vigília e se dissipa durante o sono. Outro processo, referido como processo C, é um processo circadiano, o que explica por que os níveis de vigilância flutuam no ciclo de 24 h. Além desses dois processos, fatores alopáticos também são importantes para a regulação do sono/vigília8,9. Fatores alopáticos incluem Estados nutricionais e emoção. O medo e a ansiedade geralmente são acompanhados por um aumento da excitação junto com as respostas autonômicas e neuroendócrinas10,11,12. Acredita-se que o sistema límbico desempenhe um papel na regulação do medo e da ansiedade, e os mecanismos subjacentes às respostas autonômicas e neuroendócrinas têm sido estudados extensivamente, mas o caminho pelo qual o sistema límbico influencia os Estados de sono/vigília não tem ainda foi revelado. Um grande número de estudos recentes usando opto e farmacogenética sugeriram que os neurônios e os circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília são distribuídos por todo o cérebro, incluindo os córtices, o forebrain basal, o tálamo, o hipotálamo, e tronco cerebral. Em particular, os recentes avanços na optogenética nos permitiram estimular ou inibir circuitos neurais específicos in vivo com altas resoluções espaciais e temporais. Esta técnica permitirá o progresso em nosso entendimento dos substratos neurais do sono e vigília, e como os Estados de sono/vigília são regulados por processos circadianos, pressão do sono, e fatores alopáticos, incluindo a emoção. Este artigo tem como objetivo apresentar como usar a manipulação optogenética combinada com gravação de sono/vigília, o que poderia ter o potencial de atualizar nossa compreensão dos conectomes e mecanismos no cérebro que desempenham um papel na regulação do sono NREM, sono REM, e vigília. A compreensão deste mecanismo pelo qual o sistema límbico regula os Estados de sono/vigília é de suma importância para a saúde, porque a insônia é geralmente associada com ansiedade ou medo de ser incapaz de dormir (somniphobia).
O BNST é pensado para desempenhar um papel essencial na ansiedade e no medo. Gad 67-expressar os neurônios gabaérgicos são uma grande população do BNST12,13. Nós examinamos o efeito da manipulação optogenética destes neurônios (GABABNST) em Estados do sono/wakefulness. Um dos maiores avanços na neurociência nos últimos anos tem sido métodos que possibilitam a manipulação de neurônios com identidades químicas particulares in vivo, com altas resoluções espaciais e temporais. A optogenética é altamente útil para demonstrar vínculos causais entre a atividade neural e as respostas comportamentais específicas14. Nós descrevemos o optogenetics como um método para examinar a conectividade funcional de circuitos neural definidos na regulação de Estados do sono/vigília. Utilizando essa técnica, grandes avanços foram alcançados na compreensão dos circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília15,16,17,18,19 . Em muitos casos, os opsinas são introduzidos especificamente nos neurônios com as identidades químicas particulares em regiões seletivas do cérebro por uma combinação de ratos do CRE-excitador e transferência AAV-negociada CRE-inducible do gene. Mais, a expressão focal de opsinas foto-sensíveis tais como o channelrhodopsin 2 (ChR2)20 ou o archaerhodopsin (archt)21 combinados com um sistema de CRE-Loxp ou de FLP-FRT permitem-nos de manipular uma população neuronal seletiva e um específico via neural22.
Nós descrevemos aqui experiências em neurônios GABAergic no BNST como um exemplo. Para expressar opsinas em uma população neuronal designada, os ratos apropriados do excitador de CRE e os vetores CRE-dependentes do vírus são usados o mais freqüentemente. As linhas transgénicas ou de Knock-in em que os opsinas são expressos em populações neuronal particulares são igualmente úteis. Nos experimentos a seguir, utilizamos camundongos Knock-in GAD67-CRE 23 em que apenas os neurônios gabaérgicos expressam CRE recombinase com um fundo genético C57Bl/6J, e um vetor AAV que contém ChR2 (hChR2 H134R) fundido com eyfp ou eyfp como um controle com um "interruptor FLEx (Flip-excisão)"24. O procedimento descreve especificamente a excitação optogenética de neurônios gabaergic no BNST durante a monitoração de Estados do sono/vigília25.

<table><tbody><tr><td>1x1 Juntas Rotativas de Fibra Óptica</td><td>Doric</td><td>FRJ 1x1 FC-FC</td><td>para optogenética</td></tr><tr><td>Cabeçalho de 6 pinos</td><td>KEL corporation</td><td>DSP02-006-431G</td><td></td></tr><tr><td>Soquete de 6 pinos</td><td>Hirose</td><td>21602X3GSE</td><td></td></tr><tr><td>Conversor A/D</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>Conversor analógico para digital</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td><td></td><td></td><td>3,70 vezes; 1013(cópias genômicas/ml)</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td><td></td><td></td><td>5,82&vezes; 1013 (cópias genômicas/ml)</td></tr> <tr><td>Ampicilina</td><td>Fuji filme</td><td>014-23302</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Nippon koden</td><td>N / A</td><td>para gravação de EEG / EMG</td></tr><tr><td>Vaporizador anestésico</td><td>Muromachi</td><td>MK-AT-210D</td><td></td></tr><tr><td>Injetador automático</td><td>KD científico</td><td>780311</td><td></td></tr><tr><td>cortador de carboneto</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td>&phi; 0,7 mm. Referido como broca dental, usado com micromotor rotativo de alta velocidade&nbsp;</td></tr><tr><td>Adesão de cianoacrilato&nbsp; (Aron alfa A) e aceleração</td><td>Konishi</td> <td># 30533</td><td></td></tr><tr><td>Luz de polimerização dental</td><td>3M</td><td>Elipar S10</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo epóxi</td><td>Konishi</td> <td># 04888</td><td>isolamento ao redor da solda de 6 pinos e cabo blindado Cabo de</td></tr><tr><td>remendo de fibra óptica (ramificação)</td> <td>Doric</td><td>BFP (#) _50/125 / 900-0,22</td><td></td></tr> <tr><td> Gad67 -Cre</td><td>fornecido pelo Dr. Kenji Sakimura</td><td></td><td>O gene Cre recombinase é introduzido no alelo Gad67 Seringa</td></tr> Hamilton Kit <tr><td>de micromotor rotativo de alta velocidade</td><td>Hamilton</td> 65461-01 <td></td> FOREDOM K.1070 <td>Usado com cortador de carboneto</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Manga interconectada Thorlab ADAF1&phi;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Cerâmica de 2,5 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pfizer</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>Laser&nbsp; &nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>N/A</td><td>473 nm comprimento de onda</td></tr><tr><td>Verificador de intensidade a laser</td><td>COERENTE</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador a laser</td><td>Bio research center</td><td>STO2</td><td>referido como gerador de pulso em texto</td></tr><tr><td>Fibra óptica com ferrule&nbsp;</td><td>Thorlab</td><td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-rh10</td><td>fornecido por PennVector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>Addgene</td><td>plasimid # 20296</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>fornecido pelo Dr. Karl Deisseroth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabo de remendo</td><td>Doric</td><td>D202-9089-0.4</td><td>0.4m de comprimento, condutor de laser entre laser e junta rotativa</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cimento dentário fotocurável</td><td>3M</td><td>56846</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira Serafin</td><td>Stoelting</td><td>52120-43P</td><td></td></tr><tr><td>Cabo blindado</td><td>mogami</td><td>W2780</td><td>Solda a soquete de 6 pinos para gravação de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Câmara de gravação do sono</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Feito sob medida (21 cm&times; 29 cm &times; 19 cm) com suporte para tanque de água</td></tr><tr><td>Software de sinal de sono</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>para análise de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Anel deslizante</td><td>neuroscience,inc</td><td>N/A</td><td>para análise de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Parafuso de aço inoxidável</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi; 1.0 x 2.0</td></tr><tr><td>Fio inoxidável</td><td>Fio Cooner</td><td>AS633</td><td>&nbsp; 0,0130 polegadas de diâmetro</td></tr><tr><td>quadro estereotáxico com console digital</td><td>Koph</td><td>N / A</td><td>Modelo 940</td></tr><tr><td>Agulha de seringa</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Software gravador vital</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N / A</td><td>para gravação de EEG / EMG</td></tr></tbody></table>

manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/estados do wakefulness nos ratos

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Nos últimos anos, a optogenética tem sido amplamente utilizada em muitos campos da pesquisa neurocientífica. Em muitos casos, um opsin, tal como a canaleta rodopsina 2 (ChR2), é expressado por um vetor do vírus em um tipo particular de pilhas neuronal em vários ratos do CRE-excitador. A ativação desses opsinas é desencadeada pela aplicação de pulsos leves que são entregues por laser ou LED através de cabos ópticos, e o efeito da ativação é observado com resolução de tempo muito alta. Os experimentadores são capazes de estimular agudamente os neurônios enquanto monitoram o comportamento ou outro resultado fisiológico em camundongos. A optogenética pode permitir estratégias úteis para avaliar a função dos circuitos neuronais na regulação dos Estados de sono/vigília em camundongos. Aqui nós descrevemos uma técnica para examinar o efeito da manipulação optogenética dos neurônios com uma identidade química específica durante o eletroencefalograma (EEG) e a monitoração do electromyogram (EMG) para avaliar o estágio do sono dos ratos. Como um exemplo, nós descrevemos a manipulação de neurônios GABAergic no núcleo da cama do terminalis do stria (BNST). A excitação optogenética aguda desses neurônios desencadeia uma rápida transição para a vigília quando aplicada durante o sono NREM. A manipulação optogenetic junto com a gravação de EEG/EMG pode ser aplicada para decifrar os circuitos neuronal que regulam Estados do sono/wakefulness.

O estudo atual mostrou o efeito da excitação optogenética de neurônios de GABABNST na transição do estado de sono. ChR2-EYFP foi expressado focal em neurônios de GABA no BNST. Um estudo Histochemical in situ da hibridação mostrou que ChR2-EYFP estêve colocalizado nos neurônios que expressam o GAD 67 sinais do mRNA, indicando que estes são os neurônios GABAergic. As amostras da fatia de immunohistochemical confirmaram a posição da fibra ótica, cuja a ponta era apenas acima do BN...

Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Este procedimento pode nos ajudar a identificar a função de circuito neurológico específico que está envolvido na regulação da vigília do sono com manipulação menos invasiva e alta resolução temporal. Este método nos permite a superfície de monitoramento EEG em tempo real em conjunto com a manipulação de um circuito neurológico específico para examinar a relação causal entre circuitos e estados de vigília do sono. Shota Kodani vai demonstrar o procedimento.Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, aplique pomada nos olhos do animal e use as barras de ouvido e o pino do nariz para o aparelho estereotático para estabilizar a cabeça do rato anestesiado em uma almofada absorvente. Quando a cabeça estiver fixada na posição, faça uma incisão sagital no couro cabeludo para confirmar que a intersecção entre a sutura sagittalis e sutura coronalis ou sutura lambdoidea estão em uma linha horizontal no mesmo nível. Para evitar uma abertura de posicionamento, ajuste a beliscada do nariz e as barras de ouvido conforme necessário.Em seguida, usando grampos serafins para segurar a pele aberta desinfetar a superfície exposta do crânio para permitir que as suturas cranianas sejam visualizadas com mais clareza. Para injetar o vetor do vírus associado ao adeno, carregue uma seringa esterilizada de etanol de 10 mililitros com dois microliters de óleo mineral, seguido pelo volume experimental do vírus a ser injetado. Use a bomba de microinjeção para ajustar a ponta da agulha de microinjeção sobre o bregma e observar as coordenadas como o ponto de origem.Em seguida, mova a ponta para o local de injeção designado e coloque a ponta da agulha sobre a posição. Marque o crânio no local da injeção e use uma broca dentária equipada com um cortador de carboneto de 0,7 milímetros para perfurar um buraco de aproximadamente dois milímetros de diâmetro no crânio. Depois de remover sangue ao redor do orifício com um cotonete, mova lentamente a agulha para o núcleo do leito da estria terminalis ou BSNT e injete lentamente o volume designado da solução do vírus.Em seguida, deixe a agulha no lugar por cinco minutos para permitir que a solução se infiltre suficientemente no tecido BNST antes de retirar cuidadosamente a agulha. Para eletroencefalograma, ou EEG, e eletromyograma, ou EMG, implantação de eletrodos, primeiro solda dois fios de aço inoxidável dos quais um milímetro de isolamento foi retirado de ambas as extremidades para os eletrodos EMG e colocar o centro dos eletrodos sobre o bregma. Em seguida, marque a posição para cada eletrodo EEG.Para determinar a posição do implante de fibra óptica, conecte uma ferrule de fibra óptica ao manipulador e gire o braço manipulador para um ângulo de mais ou menos 30 graus contra uma linha horizontal. Coloque a ponta de fibra na bregma e grave as coordenadas. Mova a ponta para a linha de inserção direcionada e marque a posição no crânio e a posição para o parafuso de âncora ao lado do local de inserção.Use a broca dentária para perfurar o crânio em cada local e use o manipulador para inserir suavemente a fibra óptica até chegar acima do BNST. O ferrule deve repousar sobre o crânio restante. Fixar a fibra no crânio com um parafuso de âncora, tomando cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido.Em seguida, cubra a fibra e aparar com cimento dental foto-curável. Em seguida, faça furos para eletrodos EEG/EMG e insira a ponta do primeiro eletrodo em um orifício. Segurando o implante com uma mão, aplique o adesivo de cianoacrilato no espaço entre o crânio e o eletrodo e insira o eletrodo o resto do caminho, tomando cuidado para não danificar nenhum tecido.Quando todos os eletrodos tiverem sido colocados, cubra a circunferência dos eletrodos e das fibras ópticas com adesivos de cianoacrilato adicional e acelerador de cianoacrilato para evitar causar qualquer interrupção no ferrule para cabo óptico e eletrodo para as zonas de conexão do fio de chumbo. Agora exponha os músculos do pescoço e insira os fios para o eletrodo EMG sob o músculo. Ajuste o comprimento do eletrodo EMG para que ele se encaixe logo abaixo dos músculos nucal e encha os implantes com mais adesivo de cianoacrilato e acelerador.Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de calor com monitoramento até a recomposição completa. Para o monitoramento EEG/EMG durante a foto-excitação de neurônios direcionados, primeiro use um escalar para ajustar a intensidade do laser e use uma ferrule para amarrar a ponta do cabo laser a uma fibra óptica não usada. Confirme se não há espaço na junção entre a fibra e o cabo.Após 20 minutos, emita o laser aquecido ao verificador de intensidade e ajuste a intensidade para 10 miliwatts por milímetro ao quadrado. Defina a duração do pulso de luz para 10 milissegundos, o período de descanso para 40 milissegundos, o ciclo para 20 e a repetição para 20. Mude o modo laser para a lógica transistor e confirme que os pulsos de luz são emitidos a partir da fibra controlada pelo regulador de padrões.Conecte o eletrodo implantado e o adaptador de cabo, em seguida, cubra a junção com material leve impermeável para evitar vazamento de laser. E quando o laser estiver pronto, mova os ratos para a câmara experimental para gravação de EEG/EMG. Para avaliar a latência da vigília a partir do movimento dos olhos não rápido ou do sono de movimento rápido dos olhos, limitar o tempo de gravação e otimizar o tempo de ganho do local e deixar os ratos se moverem livremente na câmara experimental por pelo menos uma hora.Durante o período experimental, monitore os sinais EEG e EMG na mesma tela de gravação. Avalie o estado do camundongo como vigília, sono de movimento não rápido dos olhos ou sono de movimento rápido dos olhos usando o controle de ganho para cada onda para facilitar a distinção de cada estado. Para medir o sono de movimento ocular não rápido até a latência da vigília, observe o sono estável não rápido do movimento dos olhos por 40 segundos, em seguida, ligue o gerador padrão para estimulação fotográfica e confirme a emissão de laser para as fibras ópticas implantadas.Em seguida, registo os sinais EEG/EMG até que o estado de sono mude para a vigília. Aqui são mostrados traços de EEG/EMG antes e depois da estimulação da foto durante o sono de movimento não rápido dos olhos. Um EEG de alta tensão e frequência lenta sem sinais EMG, representa o sono de movimento não rápido dos olhos.A estimulação fotográfica desencadeou uma transição aguda para a vigília cerca de dois segundos após a estimulação em channelrhodopsin-2 expressando camundongos enquanto os ratos de controle não demonstravam essa transição, sugerindo que a excitação dos neurônios BNST GABA durante o sono de movimento não rápido dos olhos desencadeia uma rápida indução da vigília. Por outro lado, a estimulação fotográfica durante o sono de movimento rápido dos olhos não teve efeito, então um efeito de transição só surgiu no sono de movimento não rápido dos olhos. É importante ter cuidado com as coordenações precisas para as etapas de injeção do vírus e implantação de fibras ópticas.Os traços de EEG/EMG capturados durante a análise do sono podem ser usados para avaliar as consequências da manipulação de fotos nos diferentes estados vigilantes em camundongos. Essa técnica também nos ajudará a identificar outros componentes e circuitos envolvidos na regulação dos estados de vigília do sono. Use óculos de proteção para evitar danos a laser no olho e certifique-se de sempre autoclave esterilizar o recipiente vetorial de vírus associado ao adeno após o uso.

optogenetic-manipulation-neural-circuits-during-monitoring

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Fonte: Kodani, S., et.al. Manipulação optogenética de circuitos neurais durante o monitoramento de estados de sono/vigília em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a manipulação optogenética de circuitos neurais envolvidos na transição do sono para a vigília em camundongos. O procedimento envolve a implantação cirúrgica de uma fibra óptica e eletrodos no cérebro e nos músculos para permitir a estimulação da luz e o registro eletrofisiológico. Ao fornecer luz para ativar canais...

Manipulação optogenética de circuitos neurais para a transição do sono para a vigília em camundongos

Este vídeo demonstra um protocolo para modular as oscilações em um modelo de camundongo geneticamente modificado com canais iônicos sensíveis à luz em seus neurônios do septo medial GABAérgico. Ao fornecer pulsos de luz ao hipocampo, o protocolo visa sincronizar a atividade neuronal e gerar oscilações, que são registradas como potenciais de campo locais.

Manipulação seletiva de oscilações em um modelo de camundongo

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

O registro de eletroencefalograma (EEG) e eletromiograma (EMG) em camundongos com comportamento livre é um passo crítico para correlacionar o comportamento e a fisiologia com o sono e a vigília. O protocolo experimental aqui descrito fornece um sistema baseado em cabo para aquisição de gravações de EEG e EMG em camundongos.

Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

Aqui, apresentamos procedimentos experimentais e analíticos para descrever a dinâmica temporal das variáveis ​​neurais e cardíacas do sono não REM em camundongos, que modulam a capacidade de resposta do sono aos estímulos acústicos.

Quantificando a dinâmica infra-lenta do poder espectral e da freqüência cardíaca em ratos dormindo

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Nós descrevemos um método de alta produtividade de medição sono por meio de monitoramento de casa-gaiola baseado em atividade. Este método oferece vantagens sobre métodos tradicionais baseados em EEG. Ele é bem validado para a determinação da duração total de sono e pode ser uma ferramenta poderosa para monitorar o sono em roedores modelos de doenças humanas.

Determinação não-invasiva, elevado-throughput da duração do sono em roedores

Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.

Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

Este artigo descreve um protocolo para a manipulação de alvos moleculares no córtex cerebral usando vírus associados ao adeno e para monitorar os efeitos dessa manipulação durante a vigília e o sono usando gravações eletrocorticográficas.

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos

Aprenda a manipulação optogenética de circuitos neurais durante o monitoramento de sono e vigília em ratos. Este método combina EEG/EMG em tempo real para estudar a regulação do sono.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

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