Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes
2 de novembro de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.
Esse método pode responder a perguntas-chave no campo da mecanobiologia, como como as forças são transmitidas e sentidas dentro das células, bem como entre as células e seu ambiente. A principal vantagem dessa técnica é que permite o acesso às informações em escala molecular sobre como as proteínas respondem às forças mecânicas dentro do contexto nativo da célula viva. Embora este método tenha sido aplicado especificamente ao estudo da proteína de adesão focal vinculina, ele também pode ser aplicado a outras proteínas mecanicamente sensíveis, como talina, cadherinas ou nesprina.
A demonstração visual deste método é crítica, pois a configuração adequada de imagens é difícil, mas necessária para o sucesso da análise. Inicie este procedimento com expressão estável do sensor de tensão construído no tipo celular desejado, conforme detalhado no protocolo de texto. Para preparar substratos para semeadura celular, adquira quatro pratos com fundo de vidro de 35 milímetros.
Trabalhando em uma capa de cultura celular, em um tubo cônico de 15 mililitros, fazem quatro mililitros de 10 microgramas por mililitro fibronectina em solução salina tamponada com fosfato estéril, ou PBS. Inverta suavemente o tubo uma vez para misturar e deixe a solução ficar por cinco minutos na capa de cultura celular. Em seguida, pipeta um mililitro de solução de fibronectina em cada prato com fundo de vidro.
Deixe a solução de fibronectina nos pratos por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire a solução de fibronectina e enxágue uma vez com PBS. Deixe um mililitro de PBS nos pratos até que as células estejam prontas para semeadura.
Depois de contar as células, sementes 30.000 células em cada prato de vidro revestido de fibronectina com a mídia completa apropriada para um volume final de 1,5 mililitros. Deixe as células se espalharem por quatro horas após a semeadura. Com duas horas de divulgação, aspire a mídia de crescimento e enxágue uma vez com mídia de imagem.
Deixe 1,5 mililitros da mídia de imagem. Aqueça o microscópio conforme descrito no protocolo de texto antes de iniciar a calibração. Para calibrar o laser FRAP, primeiro abra a janela de configuração a laser.
Ajuste a configuração de iluminação nas configurações de iluminação FRAP apropriadas para exposição a laser à amostra. Em seguida, defina a configuração de iluminação para as configurações de iluminação apropriadas para a imagem apenas do fluoróforo aceitor. Selecione o objetivo de calibrar na configuração do sistema coordenada.
Desmarcar clique manualmente nos pontos de calibração e verifique exibir imagens durante a calibração. Defina o tempo de Dwell para 10.000 microsegundos e o número de pulsos para 100. Agora coloque o slide de calibração, feito de brometo de ethidium selado entre um escorregador de vidro e um deslizamento de tampa, no adaptador de palco com o lado de deslizamento da tampa para baixo.
Use as configurações de iluminação aceitadora para se concentrar na superfície do slide, identificável como o plano focal com o sinal mais brilhante. Pequenos defeitos no revestimento serão visíveis para ajudar no foco. Mova o slide para uma área com fluorescência uniforme através do plano de imagem.
Clique em Criar Configuração para a primeira calibração ou configuração de atualização para calibrações subsequentes. O software inicializará o processo de calibração, branqueando automaticamente e detectando a posição do ponto branqueado. Garanta uma calibração bem sucedida avaliando a imagem final, que será uma grade de três por três pontos branqueados que devem ser distribuídos uniformemente e em foco.
Salve a imagem de calibração para referência futura. Remova o slide de calibração e armazene com segurança. A calibração deve ser realizada antes de iniciar cada experimento, mas não precisa ser realizada entre as amostras.
Prepare a configuração da microscopia para imagens de células vivas, de preferência com um estágio aquecido e objetivo, bem como um controle de dióxido de carbono. Deixe equilibrar por 20 minutos. Agora coloque uma das amostras geradas de células expressando o sensor de tensão no suporte do microscópio para imagem.
Deixe as células se equilibrarem por 10 minutos. Para garantir a saúde das células imagens, mantenha a temperatura a 37 graus Celsius na câmara de imagem. Use uma bomba peristáltica para passar dióxido de carbono umidificado de 5% sobre as amostras a 15 mililitros por minuto para manter o pH.
Abra a ferramenta Aquisição Multidimensional, ou MDA, e configure-a com parâmetros de imagem FRET, incluindo os diferentes conjuntos de filtros. Salve este MDA na Pasta Experimental com o nome de MDA_FRET_date. Configure outro MDA com os parâmetros de imagem FRAP, incluindo os diferentes conjuntos de filtros, as configurações timelapse e o Journal para pulsar o laser após a aquisição pré-alvejante.
Salve este MDA na Pasta Experimental com o nome de MDA_FRAP_date. Na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Diário, Comece a gravar. Abra a janela MDA, carregue o MDA_FRET_date e pressione a Acquire.
Em seguida, carregue o MDA_FRAP_date estado e pressione Acquire. No final da aquisição, na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Diário, Stop Recording. Salve este Diário na Pasta Experimental com o nome de FRETFRAP_date e adicione-o a uma barra de ferramentas para fácil acesso.
Feche a janela do MDA. Navegue pela amostra usando a aquisição de imagem em Acquire, Adquira com tempo mínimo de exposição e filtro de densidade neutra para identificar as células de interesse. Defina foco automático contínuo navegando para Dispositivos, Focus.
Concentre-se manualmente na amostra até chegar ao plano de imagem correto. Clique em Definir foco contínuo e aguarde que o sistema se ajuste. Uma vez que o sistema se ajuste, clique em Iniciar o Foco Contínuo.
Em seguida, encontre uma célula expressando o sensor de tensão com localização clara para uma estrutura de interesse e snap uma imagem. Desenhe uma região retangular de interesse, ou ROI, para destacar onde alvejar. Armazene essa localização do ROI.
Agora inicialize o FRETFRAP_date revista, que iniciará a aquisição de imagens FRET, seguida pela inicialização do timelapse FRAP. Repita estas etapas até que 10 a 15 conjuntos de imagens sejam adquiridos. Em seguida, analise os dados do FRET-FRAP conforme detalhado no protocolo de texto.
Aqui estão os resultados representativos para a imagem FRET do sensor de tensão vinculina, seguindo segmentação e mascaramento para isolar aderências focais. A variação espacial da carga de vinculina pode ser vista em toda a célula. A imagem e a análise frap podem ser afetadas pela estabilidade da adesão focal.
Uma adesão focal que está se translocando rapidamente durante o período de imagem pode ser difícil de rastrear com precisão. Muitas vezes isso é indicado por uma curva FRAP que contém descontinuidades e ininterpretáveis. Para uma vinculação do tipo selvagem, há uma correlação inversa entre carga proteica e taxa de rotatividade, indicando que a vinculina é estabilizada pela força.
A introdução de uma mutação na vinculação para efetuar sua vinculação à talina resulta em uma reversão da correlação, indicando que a vinculação que é incapaz de ligar talin é desestabilizada pela força. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar as amostras corretamente, garantir que as células estejam expressando o sensor em níveis endógenos e escolher parâmetros de imagem cuidadosamente. Após esse procedimento, outros métodos como a imunofluorescência, a medição da dinâmica da escala celular ou as células desafiadoras com vários inibidores podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como como a proteína de interesse interage com outros componentes subcelulares para coordenar a resposta à força.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o uso simultâneo de sensores de tensão baseados na transferência de energia por ressonância de Förster e na recuperação de fluorescência após fotobranqueamento para estudar a dinâmica e a carga de proteínas em células vivas. Este método fornece informações sobre a mecanobiologia, particularmente sobre como as proteínas respondem a forças mecânicas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Mecanobiologia
- Biologia Celular
- Dinâmica de Proteínas
Antecedentes
- Essa técnica permite a medição da dinâmica de proteínas sensíveis à força dentro de células vivas.
- Foi aplicada especificamente à proteína de adesão focal vinculina.
- Outras proteínas sensíveis à mecânica, como talina, cadherinas e nesprina, também podem ser estudadas utilizando este método.
- Um correto ajuste do sistema de imagem é essencial para o sucesso da análise.
Objetivo do Estudo
- Compreender como as forças são transmitidas e percebidas dentro e entre células.
- Obter informações em escala molecular sobre as respostas de proteínas a forças mecânicas.
- Fornecer uma demonstração visual do método para melhor compreensão.
Métodos Utilizados
- Expressão estável de construtos sensores de tensão em tipos celulares desejados.
- Preparação de substratos para semeadura celular utilizando placas com fundo de vidro.
- Medição simultânea de carga proteica e dinâmica.
- Configuração de imagem para análise adequada.
Resultados Principais
- Acesso a informações em escala molecular sobre a dinâmica de proteínas.
- Compreensão do comportamento de proteínas sensíveis à mecânica.
- Demonstração da aplicabilidade do método a diversas proteínas.
- Estabelecimento de um protocolo confiável de imagem para análise.
Conclusões
- Este método é uma ferramenta valiosa para o estudo da mecanobiologia.
- Ele aprimora a compreensão da dinâmica de proteínas em células vivas.
- Aplicações futuras poderiam estender-se a diversas proteínas sensíveis à mecânica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da dinâmica de proteínas sensíveis à força em células vivas permite a desmistificação mecanicista de alvos envolvidos em vias de mecanotransdução. Essa abordagem fornece confiança preditiva na validação de alvos ao associar respostas mecânicas em escala molecular a fenótipos celulares. Ela auxilia decisões precoces de descoberta para proteínas nas quais a modulação pela força influencia resultados de sinalização relevantes para fibrose, metástase do câncer e doenças cardiovasculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investigar como a carga mecânica altera a estabilidade das interações proteína-proteína para esclarecer o mecanismo alvo em contexto celular nativo.
- Valor Operacional: Permitir a medição direta da renovação proteica dependente de força sem extrair as proteínas de seu microambiente nativo.
- Valor Preditivo: Estabelecer correlações entre resposta à força que indiquem se um alvo é estabilizado ou desestabilizado pelo estresse mecânico, orientando estratégias de modulação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Preparar células expressando sensores de tensão validados para avaliação quantitativa, em tempo real, dos efeitos de compostos sobre a sinalização por forças mecânicas.
- Valor Operacional: Padronizar leituras de FRET-FRAP entre diferentes condições para permitir comparação reprodutível da dinâmica proteica.
- Escalabilidade: Aplicar o método a diversas estruturas subcelulares (adesões focais, junções celulares) e tipos celulares para apoiar triagens baseadas em painéis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Avaliar ambientes mecânicos relevantes para doenças (por exemplo, rigidez fibrotica) sobre a dinâmica de proteínas-alvo para alinhar com condições fisiopatológicas.
- Valor Operacional: Manter a continuidade desde a descoberta do mecanismo molecular até a validação pré-clínica utilizando leituras consistentes de sensores de força.
- Mitigação de Riscos: Identificar alvos cuja função é comprometida sob carga mecânica, reduzindo falhas em estágios avançados devido a contextos mecanobiológicos inesperados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na sequência de descobertas que vai desde a verificação da hipótese sobre o alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo insights mecanicistas que orientam a triagem e a otimização de compostos.
- Biologia de Descoberta: Teste como a força modula o engajamento do alvo e a atividade da via em células vivas, reduzindo a ambiguidade mecanicista.
- Triagem: Gere métricas quantitativas de FRET e recuperação para comparar os efeitos de compostos sobre a dinâmica de proteínas sensíveis à força.
- Análises: Extraia correlações entre carga-força e taxa de renovação para estratificar compostos conforme seu impacto mecanicista sobre alvos mecanossensíveis.
- Pesquisa Translacional: Relacione respostas à força in vitro às propriedades mecânicas em nível tecidual para maior relevância em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Implante o fluxo de trabalho FRET-FRAP como uma plataforma reutilizável em múltiplos alvos mecanossensíveis (vinculina, talina, cadherinas, nesprina).
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da observação direta do comportamento proteico dependente de força em sistemas vivos.
- Valor Operacional: Medidas padronizadas e reprodutíveis da dinâmica proteica que reduzem a variabilidade na avaliação de alvos.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar aprimoradas ao identificar alvos cuja função é mecanicamente comprometida sob forças fisiológicas.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos com base em perfis de resposta à força, reduzindo investimentos em alvos mecanicamente frágeis.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise em clonagem molecular para expressar construtos de sensores de tensão em níveis endógenos.
- Acesso a microscopia confocal com calibração a laser para FRAP e controle ambiental (37°C, 5% CO2).
- Padronização dos parâmetros de aquisição e seleção de ROI entre diferentes usuários e linhagens celulares.
- Considerações sobre adaptação para diferentes desenhos de sensores de tensão e padrões de localização subcelular.
- Limitação prática: a precisão do FRAP depende de estruturas subcelulares estáveis; focos com rápida translocação podem gerar curvas de recuperação não interpretáveis.
