Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos linfático e hepático, como como as células endoteliais linfáticas, ou LECs, respondem a estímulos específicos e como isso contribui para a patogênese da doença. A principal vantagem desta técnica é que podemos avaliar o fenótipo de células linfáticas hepáticas e funcionar em uma base por célula, e pode ser usado para aplicações de fluxo baixo após a classificação celular. Embora este método possa fornecer uma visão da biologia linfática hepática, ele também pode ser usado para avaliar células endoteliais linfáticas de diferentes tecidos, como pele e glândula mamária.

Demonstrando o procedimento estará Jeffrey Finlon, um assistente profissional de pesquisa do meu laboratório. Para preparar uma suspensão unicelular de células hepáticas isoladas, comece pulverizando o rato com 70% de etanol, e protegendo as patas em uma placa de dissecção. Use uma tesoura de dissecção para cortar a pele cerca de um centímetro acima do ânus e use fórceps dentados para levantar a pele para longe do corpo.

Insira as pontas da tesoura entre a pele e o peritônio e abra a tesoura para separar os tecidos antes de continuar a incisão da pele até o pescoço. Fixar a pele na placa de dissecção sob cada membro dianteiro e acima de cada linha traseira, e puxe o saco peritoneal para cima para estender a incisão em direção ao pescoço. Segure os lóbulos do fígado e corte logo abaixo do esterno para permitir dissecção ao redor do fígado.

Em seguida, transfira o órgão para quatro mililitros do meio EHAA do Click. Use o bisturi para cortar o fígado em pedaços de aproximadamente um milímetro de diâmetro e digerir os pedaços em quinhentos microliters de solução de digestão recém-preparada e quinhentos microliters de DNase 1. Depois de quinze minutos a trinta e sete graus Celsius, use uma tubulação de quinhentos mililitros para misturar os tecidos completamente e retornar o recipiente à incubadora por mais quinze minutos.

No final da incubação, transfira a amostra digerida através de um coador de cem mícrons em um tubo cônico de cinquenta mililitros e use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para pressionar suavemente os pedaços restantes de tecido através da malha. Lave o filtro com cinco mililitros de tampão de isolamento e pressione suavemente qualquer tecido restante através do coador. Colete as células hepáticas isoladas por centrifugação e suspenda a pelota em quatro mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.

Após cinco minutos em temperatura ambiente, lave as células em dez mililitros de tampão de isolamento e conte as células no hemótmetro para determinar a contagem completa do fígado. Suspenda a pelota em cinco mililitros de 20% de iodixanol e sobreponha a suspensão celular com um mililitro de PBS. Separe as células por separação gradiente de densidade e colmeia a camada entre o PBS e o iodixanol.

Em seguida, filtrar as células através de um coador de cem micrômetros em um novo tubo cônico de cinquenta milímetros. Lave as células em dez mililitros de tampão de isolamento fresco e suspenda a pelota resultante em quinhentos microliters de PBS, complementados com soro bovino fetal de dois por cento, ou FBS. Após a contagem, alíquotar aproximadamente cinco vezes dez vezes para as sextas células não-parenchímicas em cada controle e poço experimental de uma placa de 96 poços para centrifugação e re-suspender as pelotas em noventa microlitrais de PBS mais FBS por poço.

Adicione os coquetéis de anticorpos experimentais e de controle adequados a cada poço e manche todos os poços com um marcador de viabilidade adequado. O passo mais importante neste procedimento é a titulação adequada dos anticorpos e o uso de controles do tipo gelo e controles de fluorescência-1 para validar a coloração. Após trinta minutos a quatro graus Celsius, a centrífuga lava as células com cem microlitadores de PBS mais FBS por poço e transfere as células de cada poço para tubos individuais de citometria de fluxo redondo de cinco mililitros para um volume final de 400 microlitres de PBS mais FBS por tubo.

Em seguida, use um pequeno volume de células para ajustar as configurações de laser e compensação no cítmetro de fluxo e ler todos os eventos para cada tubo. Quando todos os tubos tiverem sido lidos, importe os dados para um programa de análise de citometria de fluxo apropriado. Portão em células vivas com base no corante marcador de viabilidade onde a expressão negativa é considerada viva.

Portão nas células vivas com base no tamanho e granularidade das células, bem como sua expressão de corante marcador de viabilidade, seguido por gating na população celular CD31 negativa CD31 usando o controle adequado do isótipo e dados de fluorescência-1 para determinar as populações positivas e negativas. Em seguida, portão as células cd31 positivas cd45 negativas de acordo com sua expressão CD16/32 e podoplanina para permitir a identificação do CD31 negativo CD31 positivo, CD16/32 podoplanina negativa endotelial positiva, e CD45 negativo CD31 positivo, CD16/32 positivo podoplanin negativo sinusoidal endotelial populações de células endoteliais. Células endoteliais enfáticas expressam vaso linfático e hialuronan endotelial, mas não CD146.

As células positivas cd16/32 positivas do fígado isoladas como demonstrado também são CD146 positivas e podoplanina positiva, enquanto as células cd16/32 negativas cd31 positivo são principalmente CD146 negativo e podoplanina positiva ou negativa. A positividade foi determinada com base na coloração da fluorescência-1. As células endoteliais linfáticas hepáticas são CD146 negativo e PDPN positivo.

Nem o endotélio vascular nem os macrófagos hepáticos murinas expressam podoplanina. A coloração de podoplanina também pode ser usada para distinguir os colangiocitos de vasos linfáticos baseados nas distintas estruturas nucleares dos dutos biliares, bem como pela coloração de citokeratina 7. Como apenas as células endoteliais linfáticas co-expressam receptor de fator de crescimento endotelial vascular 3 e proteína de homeobox Prospero 1 no fígado, esses marcadores podem ser usados ainda mais para confirmar a pureza da população de células endoteliais hepáticas classificadas.

Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e manter as células no gelo. Após esse procedimento, outros métodos como a triagem de fluxo de populações de LEC podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como o perfil transcricional de LECs. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia linfática específica do fígado explorarem como os linfáticos impactam a doença hepática em camundongos e humanos.

Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque as células endoteliais linfáticas são uma população pouco frequente e gradual em um fígado e o método precisa ser realizado rapidamente.