Name: Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais linfáticas do fígado murino usando digestão enzimática com collagenase IV e citometria de fluxo. Este método permite análise fenotípica e funcional em nível celular individual.

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Os autores gostaria de agradecer a GI e programas imune inata do fígado para apoio monetário deste projeto. B.A.J.T. também é financiado pelo R01 AI121209.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus.
1. preparação dos materiais
<ol><li>Fazer uma solução de 5 mg/mL de DNase I em tampão fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Fazer uma mistura de digestão adicionando 5.000 U/mL de colagenase IV para mídia EHAA do clique.</li>
	<li>Aquecer a mistura de digestão a 37 ° C por 30 min antes de usar.</li>
	<li>Fazer um buffer de isolamento adicionando 4,8% albumina de soro bovino (BSA) e ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para Hanks equilibrada solução salina (HBSS).</li>
	<li>Fazer um tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) , adicionando cloreto de amônio 100 mM, 10 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA para destilada H2O.</li>
</ol>2. preparação de uma suspensão de célula única de um fígado de rato
<ol><li>Eutanásia o mouse com o CO2 e deslocamento cervical.</li>
	<li>O mouse com etanol a 70% para molhar seu pelo uma mangueirada. Pino do rato pés para um tabuleiro de dissecação.</li>
	<li>Usando uma tesoura de dissecação para cortar a pele, cerca de 1 cm acima do ânus, tendo o cuidado de cortar apenas através da pele (cerca de 1 mm). Puxe a pele longe do corpo com pinça dentada e inserir a tesoura entre a pele e o peritônio. Abra a tesoura para separar a pele do peritônio e, em seguida, cortar a pele da incisão no pescoço.</li>
	<li>Pino da pele para o tabuleiro de dissecação usando um pino sob cada braço e acima de cada perna. Puxe o saco peritoneal e cortar para cima em direção ao pescoço. Pegue os lóbulos do fígado e cortar logo abaixo do esterno. Nota: Tenha cuidado se qualquer um do fígado será usado para imuno-histoquímica (IHC).</li>
	<li>Cortar em torno do fígado e remover o fígado de rato e coloque-o em 4 mL de mídia EHAA do clique.</li>
	<li>Usando um bisturi, corte o fígado em ~ 1 mm diâmetro pedaços.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l da mistura de digestão e 500 µ l do DNase I (2 mg/mL) para o fígado.</li>
	<li>Incubar o fígado por 30 min a 37 ° C. Depois de 15 min, misture o líquido usando uma pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Após 30 min de incubação, transferi a amostra digerida através de um filtro de 100 µm para um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Empurre suavemente as peças restantes através do filtro com o êmbolo de uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Lavar o filtro com 5 mL de tampão de isolamento e empurre suavemente o tecido através do filtro com as costas de um êmbolo de uma seringa de 1 mL. Repita isto até que o filtro é lavado com 25 mL de tampão de isolamento.</li>
	<li>Centrifugar as células a 400 x g por 5 min. Aspire cuidadosamente com folga o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet com 4 mL de tampão de lise de RBC. Incube as celulas em temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Lave as células com 10 mL de tampão de isolamento e centrifugar 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Conte as células em um hemocytometer para determinar a contagem total de fígado.</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de iodixanol 20% e os de camada com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Centrifugar as células em 300 x g durante 15 min sem travão.</li>
	<li>Remover a camada entre a PBS e o iodixanol e colocá-los, através de um filtro de 100 µm, em um novo tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Lave as células com 10 mL de tampão de isolamento e centrifugar 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de PBS com 2% de soro fetal bovino (FBS).</li>
</ol>3. fluxo Cytometric análise de células únicas do fígado
<ol><li>Conte as células usando um hemocytometer e microscópio, usando trypan azul exclusão para medir células viáveis. Adicionar 10 µ l de células de 10 µ l de trypan azul e imediatamente colocá-los em um hemocytometer e contar as células vivas (não azuis) sob um microscópio. Em seguida, calcule o número de células por microlitro.</li>
	<li>Alíquota de aproximadamente 5 milhões das restantes células parênquimas num único poço de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Centrifugar as células a 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 90 µ l de PBS com 2% FBS.</li>
	<li>Adicione anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) e PDPN (1: 200) diluído em 10 µ l de 10 x 2.4G2 ou anti-CD16/32 (1: 200). Nota: Nenhum bloco de Fc (2.4G2) foi usado quando o anticorpo anti-CD16/32-etiquetado foi usado.</li>
	<li>Para determinar onde gates positivos e negativos devem ser definidos, inclua uma fluorescência menos uma mancha (FMO) para cada cor e anticorpos do isotipo controle.</li>
	<li>Para determinar ao vivo contra células mortas, mancha com um marcador de viabilidade (por exemplo, fantasma vermelho 780). Incube as células a 4 ° C por 30 min.</li>
	<li>Lavar as células com 100 µ l de PBS com 2% FBS.</li>
	<li>Use uma pequena alíquota de células para ajustar as configurações de laser e compensação sobre o citômetro de fluxo. Manche as células com um anticorpo para cada individual fluoróforo e outra sem qualquer anticorpo. Nota: Dependendo o citômetro de fluxo sendo usado, uma matriz de compensação deve ser estabelecido para remover a sobreposição espectral.</li>
	<li>Coloque o tubo de amostra para a sonda do citômetro e coletar e registrar todos os eventos.</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Olhando para a área de lado-scatter vs área para diante-scatter, portão em células "ao vivo" com base em corante marcador de tamanho e granulosidade e viabilidade.</li>
	<li>Em seguida, usando CD45 brilhante violeta 510 e CD31 PerCp Cy5.5, portão nas células CD45 - CD31 + usando o isotipo controles e FMO para determinar populações positivas e negativas.</li>
	<li>Por último, usando CD146 v450 ou CD16/32 FITC e PDPN APC, tomar o CD146 - PDPN + ou CD16/32-PDPN + células, novamente usando controles isotype e FMO, para determinar as populações positivas e negativas. Estas células são os LECs.</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li>
<li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740(2014).</li>
<li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771(2015).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
<li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li>
<li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+antigen+scavenging%2C+cross-presentation%2C+and+CD8%2B+T+cell+priming%3A+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li>
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<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li>
<li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li>
<li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lymphatic+vessels%2C+not+blood+vessels%2C+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li>
<li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034(2017).</li>
<li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma%3A+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li>
<li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989(2014).</li>
<li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+marker+podoplanin%2FD2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).</li>
<li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li>
<li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospero-related+homeobox+1+%28Prox1%29+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development%2C+injury+and+regeneration%2C+and+is+absent+from+%22oval+cells%22%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li>
<li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li>
<li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li>
<li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li>
<li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphatic+System%3A+Integral+Roles+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li>
<li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphatic+system+in+body+homeostasis%3A+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A importância da LECs na homeostase imune e Regulamento veio recentemente a luz25. Muita literatura publicada linfática centra-se na pele e gânglios linfáticos; no entanto, vasos linfáticos são encontrados em todo o corpo26 e, assim, a nossa compreensão da sua importância em diferentes órgãos é necessária. Aqui nós mostramos um método no qual LECs no fígado podem ser estudados em uma base de célula por célula para entender melhor a sua expressão simultânea de marcadores de ...

O papel dos vasos linfáticos e LECs no fígado não é bem compreendido. Enquanto os vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal do fígado1 e expandem durante a doença2, muito pouco é compreendido em relação à função e fenótipo de LECs dentro do fígado. Com a descoberta de marcadores que são encontrados principalmente no LECs3, a importância destas células dentro de nichos diferentes tecidos na homeostase e na doença preencherá uma lacuna significativa na nossa compreensão. LECs têm um papel importante na manutenção da tolerância periférica no nó de linfa e em tumores metastáticos interagindo diretamente com T células4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs no nó de linfa podem promover imunidade protetora através de suas interações com células dendríticas migratórias14,15,16. Portanto, existem várias funções para LECs, que podem ser específicas para os tecidos e as interações em que estão presentes. No entanto, muito pouco é compreendido sobre como LECs interagem com células do sistema imunológico no tecido ou como LECs funcionam em diferentes órgãos; assim, avaliar LECs em uma base por célula dentro do fígado ou outros órgãos pode levar a avanços na como LECs program a imunidade do tecido-específica. Enquanto grande parte da literatura que enfoca LECs no fígado usa microscopia Visualizar LECs usando um ou dois marcadores e morfologia17, muito pouco tem sido feito para avaliar especificamente LECs em uma base de célula por célula usando citometria de fluxo, embora um estudo avaliar as diferenças entre células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) e LECs18. Ser capaz de analisar as populações do LEC no fígado por citometria de fluxo permite o estudo aprofundado de fenótipo LEC durante homeostase normal ou doença.
Para avaliar os LECs por citometria de fluxo, são necessários vários marcadores de superfície. Normalmente, LECs são visualizados pela expressão de prospero relacionados homeobox 1 (Prox-1), receptor de ácido hialurônico endoteliais de vasos linfáticos 1 (LYVE1) ou do receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR3) usando microscopia. No entanto, no fígado, a expressão destes marcadores não está restrita a LECs. Prox-1 é amplamente expresso pelos hepatócitos durante o desenvolvimento do fígado, regeneração e lesão19e LYVE1 e VEGFR3 são expressos por células endoteliais sinusoidais fígado18. No nó de linfa, LECs são identificados usando citometria de fluxo como aglomerados de diferenciação (CD) CD45, CD31 + e podoplanin + (PDPN)16. No entanto, esta abordagem é também mínima para isolar LECs no fígado, desde células CD45 - CD31 + irão capturar as células endoteliais, e a população predominante de pilhas endothelial vasculares no fígado é LSECs. Assim, outros marcadores são necessários para distinguir a população LEC rara da população abundante de LSEC. Tanto CD16/32 (expressado por maduro LSECs18) e CD146 (um célula endotelial vascular marcador comum que é predominantemente expressado dentro os sinusoides do fígado por células endoteliais sinusoidais fígado20 com pouca ou nenhuma expressão por linfático células endoteliais21) foram os marcadores de candidato.
Portanto, nós aperfeiçoamos um método para isolar e visualizando LECs no fígado usando o acima marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e PDPN por citometria de fluxo. Nós descrevemos o uso de colagenase IV, 1 DNase e separação mecânica para a digestão do tecido do fígado em uma suspensão de célula única. Também descrevemos a utilização de gradiente de densidade iodixanol para o isolamento de células não-parenquimatosas (NPC) e eliminar restos celulares. Finalmente, usando vários marcadores, determinamos a estratégia associada citometria de fluxo ideal para identificar LECs do fígado com PDPN como o marcador predominante.

<table><tbody><tr><td>Cliques/EHAA media</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS002145</td><td>Desoxirribonuclease 1</td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>Gradiente de Densidade Médio</td></tr><tr><td>V450 anti-mouse CD146(clone ME-9F1)</td><td>BD biosciences</td><td>562232</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti camundongo CD146 (clone ME-9F1)</td><td>Biolegend</td><td>134706</td><td>isotiocianato de fluoresceína (FITC)</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti camundongo CD31 (clone 390)</td><td>Biolegend</td><td>102422</td><td></td></tr><tr><td>PerCp / Cy5.5 anti camundongo CD31 (clone 390)</td><td>Biolegend</td><td>102420</td><td>Proteínas de peridinina-clorofila-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr><tr><td>APC anti camundongo PDPN (clone 8.1.1)</td><td>Biolegend</td><td>127410</td><td>Aloficocianina (APC), podoplanina (PDPN)</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti camundongo CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti camundongo CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti camundongo CD16/32 (clone 93)</td><td>Biolegend</td><td>101306</td><td>isotiocianato de fluoresceína (FITC)</td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 anti camundongo CD16/32 (clone 93)</td><td>Biolegend</td><td>101324</td><td>Proteínas de peridinina-clorofila-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr><tr><td>corante de viabilidade vermelho fantasma 780</td><td>TONBO biosceinces</td><td>3-0865-T100</td><td></td></tr><tr><td>APC hamster sírio IgG (clone SHG-1)</td><td>Biolegened</td><td>402102</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 rato IgG2a (clone RTK2758)</td><td>Biolegend</td><td>400531</td><td></td></tr><tr><td>rato FITC IgG2 (clone eBR2a)</td><td>ebioscience</td><td>1-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td><td>R& Sistemas D</td><td>FAB2125A</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato Citoqueratina (clone EPR17078)</td> <td>abcam</td><td>ab181598</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato F4 / 80 (clone Cl: A3-1)</td> <td>Bio-rad</td><td>MCA497</td><td></td></tr><tr><td>BSA (fração V)</td> <td>Fischer</td><td>BP1600-100</td><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td></tr> <tr><td>Soro de cabra</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>E177</td><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) - para tampão de lise de hemácias</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Fischer</td><td>A687-500</td><td>para tampão de lise de hemácias</td></tr><tr><td>Bicarbonato de potássio</td><td>Fischer</td><td>P184-500</td><td>para tampão de lise de hemácias</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Pena</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; filtro de células m</td><td>Fischer</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2</td><td>em casa/ATCC</td><td>ATCC HB-197</td><td>FC bloquear para inibir a ligação não específica a células Fc gamma + - feito de hibridoma</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>50 mL cônico</td><td>Truline</td><td>TR2004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL cônico</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Ponta de pipeta</td><td>EUA científico</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Ponta de pipeta L</td><td>USA scientific</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L ponta de pipeta</td><td>EUA científico</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>seriológico 10 mL pipete</td><td>greiner bio-one</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>seriológico 5 mL pipete</td><td>greiner bio-one</td><td>606107</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Fischer</td><td></td><td>Heracell 160i</td></tr><tr><td>BD FacsCanto II citômetro de fluxo</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Clínica</td><td>Beckman relha</td><td></td><td>modelo X-14R</td></tr></tbody></table>

digestão do fígado murino para um fluxo cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Dentro do fígado, vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal, e sua função descrita é para remover o líquido intersticial do fígado para os nódulos linfáticos onde restos celulares e antígenos podem ser pesquisados. Estamos muito interessados em compreender como o sistema vascular linfático pode estar envolvido na inflamação e função de células imunes dentro do fígado. No entanto, muito pouco tem sido publicado estabelecer protocolos de digestão para o isolamento de células endoteliais linfáticas (LECs) do fígado ou marcadores específicos que podem ser usados para avaliar o fígado LECs em uma base por célula. Portanto, nós aperfeiçoamos um método para a digestão e manchas do fígado, a fim de avaliar a população de LEC no fígado. Estamos confiantes de que o método descrito aqui será útil para a identificação e isolamento de LECs do fígado e reforçará a nossa compreensão de como LECs respondem para o microambiente do fígado.

Estudos analisando fígados vasos linfáticos têm usado principalmente imuno-histoquímica para dosar a frequência e o diâmetro dos vasos linfáticos, no fígado. No entanto, esse método não permite para a avaliação da LECs numa base de célula por célula ou para a expressão de vários marcadores, citocinas, quimiocinas ou fatores de transcrição. Portanto, perguntamos se fígado LECs pode ser isolados do fígado e avaliadas utilizando citometria de fluxo. Trabalhos anteriores, isolando o linfonodo...

O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos linfático e hepático, como como as células endoteliais linfáticas, ou LECs, respondem a estímulos específicos e como isso contribui para a patogênese da doença. A principal vantagem desta técnica é que podemos avaliar o fenótipo de células linfáticas hepáticas e funcionar em uma base por célula, e pode ser usado para aplicações de fluxo baixo após a classificação celular. Embora este método possa fornecer uma visão da biologia linfática hepática, ele também pode ser usado para avaliar células endoteliais linfáticas de diferentes tecidos, como pele e glândula mamária.Demonstrando o procedimento estará Jeffrey Finlon, um assistente profissional de pesquisa do meu laboratório. Para preparar uma suspensão unicelular de células hepáticas isoladas, comece pulverizando o rato com 70% de etanol, e protegendo as patas em uma placa de dissecção. Use uma tesoura de dissecção para cortar a pele cerca de um centímetro acima do ânus e use fórceps dentados para levantar a pele para longe do corpo.Insira as pontas da tesoura entre a pele e o peritônio e abra a tesoura para separar os tecidos antes de continuar a incisão da pele até o pescoço. Fixar a pele na placa de dissecção sob cada membro dianteiro e acima de cada linha traseira, e puxe o saco peritoneal para cima para estender a incisão em direção ao pescoço. Segure os lóbulos do fígado e corte logo abaixo do esterno para permitir dissecção ao redor do fígado.Em seguida, transfira o órgão para quatro mililitros do meio EHAA do Click. Use o bisturi para cortar o fígado em pedaços de aproximadamente um milímetro de diâmetro e digerir os pedaços em quinhentos microliters de solução de digestão recém-preparada e quinhentos microliters de DNase 1. Depois de quinze minutos a trinta e sete graus Celsius, use uma tubulação de quinhentos mililitros para misturar os tecidos completamente e retornar o recipiente à incubadora por mais quinze minutos.No final da incubação, transfira a amostra digerida através de um coador de cem mícrons em um tubo cônico de cinquenta mililitros e use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para pressionar suavemente os pedaços restantes de tecido através da malha. Lave o filtro com cinco mililitros de tampão de isolamento e pressione suavemente qualquer tecido restante através do coador. Colete as células hepáticas isoladas por centrifugação e suspenda a pelota em quatro mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.Após cinco minutos em temperatura ambiente, lave as células em dez mililitros de tampão de isolamento e conte as células no hemótmetro para determinar a contagem completa do fígado. Suspenda a pelota em cinco mililitros de 20% de iodixanol e sobreponha a suspensão celular com um mililitro de PBS. Separe as células por separação gradiente de densidade e colmeia a camada entre o PBS e o iodixanol.Em seguida, filtrar as células através de um coador de cem micrômetros em um novo tubo cônico de cinquenta milímetros. Lave as células em dez mililitros de tampão de isolamento fresco e suspenda a pelota resultante em quinhentos microliters de PBS, complementados com soro bovino fetal de dois por cento, ou FBS. Após a contagem, alíquotar aproximadamente cinco vezes dez vezes para as sextas células não-parenchímicas em cada controle e poço experimental de uma placa de 96 poços para centrifugação e re-suspender as pelotas em noventa microlitrais de PBS mais FBS por poço.Adicione os coquetéis de anticorpos experimentais e de controle adequados a cada poço e manche todos os poços com um marcador de viabilidade adequado. O passo mais importante neste procedimento é a titulação adequada dos anticorpos e o uso de controles do tipo gelo e controles de fluorescência-1 para validar a coloração. Após trinta minutos a quatro graus Celsius, a centrífuga lava as células com cem microlitadores de PBS mais FBS por poço e transfere as células de cada poço para tubos individuais de citometria de fluxo redondo de cinco mililitros para um volume final de 400 microlitres de PBS mais FBS por tubo.Em seguida, use um pequeno volume de células para ajustar as configurações de laser e compensação no cítmetro de fluxo e ler todos os eventos para cada tubo. Quando todos os tubos tiverem sido lidos, importe os dados para um programa de análise de citometria de fluxo apropriado. Portão em células vivas com base no corante marcador de viabilidade onde a expressão negativa é considerada viva.Portão nas células vivas com base no tamanho e granularidade das células, bem como sua expressão de corante marcador de viabilidade, seguido por gating na população celular CD31 negativa CD31 usando o controle adequado do isótipo e dados de fluorescência-1 para determinar as populações positivas e negativas. Em seguida, portão as células cd31 positivas cd45 negativas de acordo com sua expressão CD16/32 e podoplanina para permitir a identificação do CD31 negativo CD31 positivo, CD16/32 podoplanina negativa endotelial positiva, e CD45 negativo CD31 positivo, CD16/32 positivo podoplanin negativo sinusoidal endotelial populações de células endoteliais. Células endoteliais enfáticas expressam vaso linfático e hialuronan endotelial, mas não CD146.As células positivas cd16/32 positivas do fígado isoladas como demonstrado também são CD146 positivas e podoplanina positiva, enquanto as células cd16/32 negativas cd31 positivo são principalmente CD146 negativo e podoplanina positiva ou negativa. A positividade foi determinada com base na coloração da fluorescência-1. As células endoteliais linfáticas hepáticas são CD146 negativo e PDPN positivo.Nem o endotélio vascular nem os macrófagos hepáticos murinas expressam podoplanina. A coloração de podoplanina também pode ser usada para distinguir os colangiocitos de vasos linfáticos baseados nas distintas estruturas nucleares dos dutos biliares, bem como pela coloração de citokeratina 7. Como apenas as células endoteliais linfáticas co-expressam receptor de fator de crescimento endotelial vascular 3 e proteína de homeobox Prospero 1 no fígado, esses marcadores podem ser usados ainda mais para confirmar a pureza da população de células endoteliais hepáticas classificadas.Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e manter as células no gelo. Após esse procedimento, outros métodos como a triagem de fluxo de populações de LEC podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como o perfil transcricional de LECs. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia linfática específica do fígado explorarem como os linfáticos impactam a doença hepática em camundongos e humanos.Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque as células endoteliais linfáticas são uma população pouco frequente e gradual em um fígado e o método precisa ser realizado rapidamente.

digestion-murine-liver-for-flow-cytometric-analysis-lymphatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Um modelo animal da dieta-induzido simples e de confiança do roedor para o esteatohepatite não alcoólico (Nash) é descrito, conseguido com a carcaça non-SPF dos animais e a administração de uma dieta high-fat específica. Nós descrevemos a identificação de subconjuntos hepatic e adiposos da pilha imune para recapitular condições imunológicas humanas expondo ratos aos germes ambientais.

Um modelo murino avançado para esteatohepatite não alcoólica em associação com diabetes tipo 2

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

O presente protocolo descreve um protocolo cirúrgico detalhado para o isolamento de linfa intestinal corrente em resposta a infusões intraduodenais de nutrientes em camundongos. Isso permite a determinação fisiológica da absorção de lipídios intestinais totais e da síntese e secreção de quilomícrons em resposta a vários nutrientes experimentais.

O Isolamento da Linfa Mesentérica Corrente em Camundongos para Quantificar a Cinética In Vivo de Absorção de Lipídios da Dieta e Secreção de Quilomícrons

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar células endoteliais linfáticas do fígado murino usando digestão enzimática com collagenase IV e citometria de fluxo. Este método permite análise fenotípica e funcional em nível celular individual.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

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