Name: Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda técnicas fluorimétricas para avaliar a integridade das membranas de espermatozoides usando sondas fluorescentes, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Esses métodos permitem prever o potencial de fertilização e diagnosticar a qualidade do ejaculado com precisão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostaria de agradecer sua ajuda e cooperação e MS. Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, França) para obter assistência com a instalação do instrumento e formação empresa israelense "SION" para inseminação artificial e reprodução (Hafetz-Haim, Israel).

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações de 1994 israelense para o bem-estar animal. Esperma de bovina foi fornecida pela empresa israelense comercial para inseminação artificial e reprodução. Ejacula de 11 touros foram avaliadas neste estudo.
1. preparação da amostra esperma
Nota: O procedimento baseia-se protocolo1,3 no laboratório Roth.
<ol><li>Obter cerca de 1 – 6 mL de sêmen de touro em um tubo de 15 mL à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para cada 1 mL de sémen, adicionar 6 mL de tampão NKM escaldada (a 37 ° C) (110 mM de NaCl, 5 mM KCl, MOPS 20 mM [ácido 3-N-morphilino; pH 7,4]) e centrifugar para 8 min a 600 x g, 1-2 vezes até que o sobrenadante é claro. Nota: Se a concentração de espermatozoides ou o volume inicial é muito elevado, dividida em dois tubos na lavagem de primeira.</li>
	<li>Imediatamente remover e descartar o sobrenadante claro e deixar cerca de 1 cm do líquido sobrenadante acima a pelota.</li>
	<li>Inclinar-se cuidadosamente os tubos em um ângulo de 30° para aumentar a área de superfície para que o esperma nadar e esperar 20 a 30 min para permitir que os espermatozoides a nadar até a 37 ° C. Nota: Turbidez pode ser vista.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta cuidadosamente, remova o superior 1 mL do sobrenadante contendo os espermatozoides móveis para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Manter o esperma a 37 ° C até o uso.</li>
	<li>Estime a contagem de esperma, usando um hemocytometer de Neubauer. Nota: Uma câmara de contagem diferente pode ser usada em vez disso, mas a contagem é diferente.<ol>
<li>Para evitar o movimento do espermatozoide, diluir 100 µ l dos espermatozoides móveis com 10 mL de água bidestilada (DDW) (diluição de 1: 100) em um tubo de 15 mL e misture delicadamente.</li>
		<li>Carrega 10 µ l da amostra em cada lado da hemocytometer e da lamela. Certifique-se de evitar formação de bolhas no interior da câmara, pois isto pode resultar em uma contagem de esperma imprecisas.</li>
		<li>Observe ao microscópio composto com um objetivo X 20. Nota: A grade completa em um hemocytometer contém 9 quadrados grandes, cada 1mm2, e a lamela repousa 0,1 mm acima do piso da câmara. Assim, o volume sobre a área central de contagem é de 0,1 mm3 ou 0,1 µ l. A área central do hemocytometer contém 25 quadrados médios e cada quadrado médio possui 16 quadrados menores com linhas simples.</li>
		<li>Conte o número total de células encontradas em 4 quadrados de canto médio e da praça central. Para maior precisão, contar duas câmaras (ambos os lados do hemocytometer de Neubauer) e usar a média para calcular a concentração de células.</li>
		<li>Calcule a contagem de esperma, multiplicando o número médio obtido por 5 (para obter o número de células por área de contagem), por 10.000 (para obter o número de células por 1 mL da amostra diluída). Então, multiplique a contagem obtida pelo factor de diluição (1: 100). Nota: Por exemplo, um número médio de espermatozoides contados em 5 dos 25 quadrados médios dentro da área central de contagem de duas câmaras é 150 ([152 + 148] / 2). Assim, o número médio de espermatozoides por câmara (ou 0,1 µ l) é 150 x 5 = 750. Multiplica 750 por 10.000 para obter o número de células por 1 mL da amostra diluída (7.500.000) e então multiplicar por 100 (fator de diluição), para obter 75 x 107 células por mL de amostra de sêmen original.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. técnica #1: Avaliação simultânea das membranas de esperma usando vários fluorescente sondas
Nota: Membranas de esperma (plasma, acrossomal e mitocondrial) foram avaliadas conforme descrito por Celeghini et al.10, com algumas modificações. Utilizou-se microscopia epifluorescente, combinado com uma câmera digital com excitação em 450-490 nm e emissão a 515-565 nm, usando um filtro triplo.
<ol><li>
Prepare soluções estoque.
	<ol>
<li>Prepare a 0,1 mg/mL solução stock de DAPI dissolvendo-se 5 mg de DAPI em 50 mL de soro de tampão fosfato (PBS). Preparar 50 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Antes de usar, dilua a solução estoque com PBS em 01:10 (solução de trabalho; 10 µ g/mL).</li>
		<li>Prepare-se 1 mg/mL solução FITC-PSA dissolvendo-se 1 mg de FITC-PSA em 1 mL de PBS. Preparar 50 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Antes de usar, dilua a solução estoque com PBS em 01:10 (solução de trabalho; 100 µ g/mL).</li>
		<li>Prepare o JC-1 de 1 mg/mL de solução dissolvendo-se 1 mg de JC-1 em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Prepare-se 10 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Antes de usar, dilua a solução estoque com DMSO às 01:10 (solução de trabalho; 0,1 mg/mL).</li>
		<li>Prepare a solução-mãe PI dissolvendo-se 10 mg de PI em 400 µ l de PBS (dando 2,5 mg/mL). Loja em + 4 ° C. Dilua 1 de estoque com PBS em 01:20 (solução de trabalho; 0,125 mg/mL). Armazenar a + 4 ° C como uma solução. Atenção: O PI é um potencial mutagênico e deve ser manuseado com cuidado. O corante deve ser feito de forma segura e em conformidade com os regulamentos locais aplicáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferi µ l 133 dos espermatozoides móveis (passo 1.5) para um novo tubo de 1,5 mL (25 x 106 espermatozoides/mL). Nota: Se a concentração da amostra é maior, diluí-lo no buffer NKM para obter a concentração necessária; se a concentração da amostra de natação da amostra é menor, centrifugar o sobrenadante obtido após nadar até a 1.000 x g por 5 min, retire a 0,5 mL do sobrenadante e contar o esperma novamente.</li>
	<li>Adicionar 17 µ l de DAPI (solução de trabalho) e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ao pellet, adicione 100 µ l de tampão NKM.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de FITC-PSA, 2 µ l de JC-1 e 3 µ l de PI (soluções de trabalho) e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
	<li>Ao pellet, adicionar 40 µ l de tampão NKM e ressuspender pipetando.</li>
	<li>Transferi 10 µ l da amostra para uma lâmina de vidro, esfregaço e lamela.</li>
	<li>
Visualizar imediatamente por microscopia de epifluorescência (uso 40 x objetivo) com um filtro triplo, equipado com uma câmera digital e capturar uma imagem separada para cada filtro. Nota: Não há nenhum significado na ordem dos filtros visualizado.<ol>
<li>Visualizar sob canal DAPI com excitação em 358 nm e emissão na 461 nm.</li>
		<li>Visualize sob canal FITC para monômeros verdes com excitação em 450-490 nm e emissão a 515 – 565 nm.</li>
		<li>Visualizar sob canal de PI para agregados vermelhos com excitação em 488 nm e emissão a 590 nm.</li>
		<li>Visualizar com JC-1 vermelhos agregados com excitação em 559 nm e emissão na faixa de 574-627 nm; JC-1 verdes monômeros com excitação em 488 nm e emissão na faixa de 500-535 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mescle as três imagens que recebeu os filtros em formato JPG/JPEG, usando a opção "Mesclar" do software da câmera.</li>
	<li>Abra a imagem mesclada com a ferramenta "Paint" e usar a opção de escova para marcar a contagem de espermatozoides.</li>
	<li>
Classifica o espermatozoide baseada a fluorescência emitida por cada sonda:
	<ol>
<li>Em geral, avaliar pelo menos 200 espermatozoides por slide — todas as células aparecem azuis (DAPI).</li>
		<li>Avaliar a viabilidade pela contagem de células mortas, que aparecem roxo (PI [vermelho] + [azul] DAPI) e calcular a percentagem de células mortas (células morta/total contado células x 100).</li>
		<li>Avalie o status de acrossoma usando os padrões de coloração fluorescente (FITC-PSA). Calcule as porcentagens dos diferentes padrões (acrossoma intacto, danificados ou reagiram células/total contado células x 100). Nota: Membrana acrossomal danificada aparece como um tampão de acrossoma totalmente manchadas, verde; membrana acrossomal reagiram mostra residual verde equatorial ou superior mancha; células contendo membrana acrossomal intacta não exibirá qualquer coloração verde da região acrossomal.</li>
		<li>Avalie ΔΨm distinguindo espermatozoides com alta ΔΨm, que exibem uma peça intermediária manchados de vermelho e espermatozoides com baixa ΔΨm, que exibem uma peça intermediária manchado de verde. Conta vermelha e verde midpieces separadamente e calcular sua relação (vermelho/verde).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. técnica #2: Avaliação das membranas de esperma com Kits prontos para uso e citometria de fluxo
Nota: Avaliação de integridade de membrana plasmática, integridade de membrana acrossomal e potencial de membrana mitocondrial foi feita com kits de citometria de fluxo de ready-to-use contendo liofilizados fluorochromes em cada poço. O procedimento foi realizado de acordo com os fabricantes, com algumas modificações.
<ol><li>
Avaliação de integridade de membrana plasmática
	<ol>
<li>Pegue o número desejado de poços da embalagem do kit de viabilidade e concentração (PI e SYbr14), transferi-los para a base de trabalho e cubra com uma tampa flexível (proteger da luz).</li>
		<li>Adicione 199 µ l de solução tamponada para citometria por bem.</li>
		<li>Adicionar 1 µ l de sêmen homogênea em 57 x 106/mL (57.000 células por poço) e homogeneizar por pipetagem.</li>
		<li>Cubra o prato com a tampa preta.</li>
		<li>Incube durante 10 minutos a 37 ° C, protegido da luz.</li>
		<li>Execute a amostra através do citômetro de fluxo com a viabilidade' configuração'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Potencial de membrana mitocondrial
	<ol>
<li>Pegue o número desejado de poços da embalagem do kit atividade mitocondrial (JC-1), transferi-los para a base de trabalho e cubra com uma tampa flexível (proteger da luz).</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de etanol absoluto por alvéolo e pipetar para Ressuspender o pó presente dentro do poço.</li>
		<li>Adicione 190 µ l de PBS por alvéolo e homogeneizar por pipetagem.</li>
		<li>Adicione 0,75 µ l de sêmen homogênea em 57 x 106/mL (50.000 células por poço) e homogeneizar por pipetagem.</li>
		<li>Cubra o prato com a tampa preta.</li>
		<li>Incube durante 30 min a 37 ° C, protegido da luz.</li>
		<li>Executar a amostra através do citômetro de fluxo com a atividade de ʽmitochondrial de configuração '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Integridade da membrana acrossomal Nota: FITC-PSA coloração (veja técnica #1) permite a avaliação de 3 categorias de acrossoma (acrossoma intacta, acrossoma reagiram e acrossoma danificada). Usando o citômetro de fluxo e kit de integridade do acrossoma (PI e FITC-PNA) e viabilidade, os espermatozoides são separados nestas 3 categorias.<ol>
<li>Pegue o número desejado de poços da embalagem do kit de integridade de viabilidade & acrossoma, transferi-los para a base de trabalho e cubra com uma tampa flexível (proteger da luz).</li>
		<li>Adicione 200 µ l de solução tamponada para citometria por bem.</li>
		<li>Adicionar 0,7 µ l de sêmen homogênea em 57 x 106/mL (40.000 células por poço) e homogeneizar por pipetagem.</li>
		<li>Cubra o prato com a tampa preta.</li>
		<li>Incube durante 45 min a 37 ° C, protegido da luz.</li>
		<li>Executar a amostra através do citômetro de fluxo com o ʽInCyte de configuração '.</li>
		<li>Analisar o histograma resultante por retenção de três áreas de marcador de acordo com a intensidade da fluorescência, que representa células insignificantes, baixo fluoresce com acrossoma intacta, Imaculada (R1), baixa fluoresce células com residual manchado parte do acrossoma (R2) e células altamente fluorescentes com acrossoma interrompida (R3). Nota: Use a seção "Analisando arquivos adquiridos usando outros módulos" no guia do usuário do instrumento a fim de criar as três regiões (R1, R2, R3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. técnica #3: Avaliação das membranas do espermatozoide utilizando sondas fluorescentes e citometria de fluxo
Nota: Uso da anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico).
<ol><li>Prepare 1 x anexina tampão de ligação V de 20 x solução estoque (diluir 500 µ l de tampão de ligação V 20 x solução estoque com 9,5 mL de água destilada estéril de anexina).</li>
	<li>Estime a contagem de esperma, usando um hemocytometer Neubauer, conforme descrito na seção 1.7.</li>
	<li>Lave 106 espermatozoides em 1 mL de 1x anexina V ligação buffer e centrifugar 300 x g por 10 min.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante completamente.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 100 µ l de 1x anexina tampão de ligação V.</li>
	<li>Adicione 10 µ l da anexina V, conjugado com FITC.</li>
	<li>Misture bem e incube por 15 min no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os espermatozoides, adicionando 1 mL de 1 x anexina V ligação buffer por 106 células e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante completamente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 500 µ l de 1 x anexina V ligação buffer por 106 células total.</li>
	<li>Adicione 1 µ g/mL PI imediatamente antes da análise com um citômetro de fluxo.</li>
	<li>Executar a amostra através do citômetro de fluxo definido na ʽInCyte'.</li>
</ol>

<ol><li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li>
<li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li>
<li>Beltrán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li>
<li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li>
<li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li>
<li>Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Hung%22%5BJournal%5D)">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
<li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li>
<li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma%2C+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li>
<li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+in+reproduction%3A+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li>
<li>Eddy, E. M., O’Brien, A. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=6j-mOAcNnPUC&pgis=1">The spermatozoon</a>. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).</li>
<li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li>
<li>Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li>
<li>Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oxidative+phosphorylation%2C+the+mitochondrial+membrane+potential%2C+and+their+role+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li>
<li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li>
<li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li>
<li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen%2C+including+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.

Fecundação do esperma potencial depende de múltiplos fatores, refletindo sua qualidade. Uma alta concentração de espermatozoides e uma elevada proporção de espermatozoides móveis altamente progressivamente podem ser considerados o sêmen de alta qualidade. No entanto, essa avaliação não leva em conta outros parâmetros celulares e funcionais. O uso de 'bancada' conta citômetro de fluxo pode ser facilmente adaptado para avaliação de várias estruturas de esperma utilizando sondas fluorescentes, como mostrado anteriormente po...

Integridade e funcionalidade de membranas de esperma são alguns dos fatores indicando a viabilidade do esperma e fertilização potencial. A membrana plasmática funciona como uma barreira entre os compartimentos intracelulares e extracelulares, mantendo assim o equilíbrio osmótico celular1. Qualquer estresse que induz os danos para a integridade da membrana plasmática pode prejudicar a homeostase, reduzir a capacidade de viabilidade e fertilização e aumentar a morte celular. Por exemplo, criopreservação reduz viabilidade de esperma devido a danos a sua membrana plasmática, como resultado de mudanças de temperatura e estresse osmótico2. Informamos anteriormente que expondo o esperma de touro a baixas concentrações de contaminantes de origem alimentar como o pesticida atrazine, diaminochlorotriazine seu metabolito principal ou a aflatoxina micotoxina B1, reduz a viabilidade de esperma1,3 . Isso foi determinado pela rotulagem o DNA de cadeia dupla com DAPI em combinação com PI, que se liga ao DNA de células com uma membrana plasmática danificada.
Reacção acrossómica (AR) envolve a fusão da membrana externa do acrossoma e membrana plasmática sobrejacente, resultando na liberação de enzimas acrossomal4,5. Estes são eventos essenciais para a penetração da zona pelúcida e ainda mais a fusão do espermatozoide com o oócito6. Portanto, a avaliação da integridade da membrana acrossomal constitui um parâmetro útil para avaliar a qualidade do sêmen e a fertilidade masculina7,8,9. Várias técnicas fluorescentes são adequadas para a verificação de integridade do acrossoma, FITC-PNA ou FITC-PSA8,10. Em nossos estudos anteriores, usando os padrões de FITC-PSA coloração1,3, desde as definições precisas para (i) acrossoma intacta, (ii) danificado da membrana do acrossoma e (iii) reagiu acrossoma. No relatório atual, podemos avaliar o status de acrossoma usando citometria de fluxo de esperma-dedicado e comparar os resultados com aqueles usando microscopia de fluorescência.
As mitocôndrias são organelas multifuncionais envolvido em, entre outras coisas, ATP síntese, produção de espécies reactivas de oxigénio, sinalização de cálcio e apoptose. Disfunções fisiológicas, incluindo a infertilidade masculina e feminina, estão associadas com alteração da função mitocondrial11. Mitocôndrias de esperma são arranjadas na peça intermediária e desempenham um papel crucial no esperma motilidade12. É bem aceite que o elevado potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) está associado a motilidade normal e alta fertilização capacidade13. Em contraste, ΔΨm baixo está associado um nível elevado de espécies reativas de oxigênio e reduzida taxa de fertilização14. Não obstante, vários compostos ambientais, por exemplo, desreguladores endócrinos, podem induzir estresse celular e levar a um aumento transiente da hiperpolarização1,3, ΔΨm, aumento da produção de radicais livres e, eventualmente, apoptose,15. A sonda fluorescente 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1) permite por exemplo, examinando os efeitos de toxinas de origem alimentar no esperma ΔΨm1,3.
Spermiograms padrão, com base nos parâmetros fisiológicos e morfológicos, não são bons o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Métodos mais precisos são necessários para assegurar a qualidade do esperma. Aqui, nós fornecemos dois métodos viáveis para determinar a qualidade do esperma com base em avaliações de membranas de esperma: coloração quádruplo simultânea com sondas fluorescentes específicas e microscopia de fluorescência, descrito em nossos estudos1,3 e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma, recentemente utilizado em nosso laboratório e já está sendo usado por outros16,17,18.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [ácido propanossulfônico 3-N-morfilino]</td> <td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Neubauer Alemanha</td><td></td><td>hemocitômetro</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo)</td> <td>Sonda fluorescente</td> <td>Sigma</td><td>D9542</td></tr><tr><td>PI (iodeto de propídio)</td> <td>Sonda fluorescente</td> <td>Sigma</td><td>P4170</td></tr><tr><td>FITC-PSA (aglutinina Pisum sativum conjugada com isotiocianato de fluoresceína)</td> <td>Sonda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fluorescente Sigma L0770JC-1 (iodeto de 5,5',6,6'-tetra-cloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil carbocianina)</td><td>ENZOBiochem, Nova York, NY, EUA</td><td>sonda fluorescente</td><td>ENZ52304</td></tr><tr><td>Anexina V conjugada a FITC</td> MACS, <td>Sonda fluorescente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td></tr><tr><td>Tampão de ligação de anexina V 20x solução estoque</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td>tampão</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td></td><td>microscópio de fluorescência invertida</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tóquio, Japão</td><td></td><td>câmera digital</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, França</td><td></td><td>citômetro de fluxo de esperma microcapilar</td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, EUA; distribuído pelo software IMV Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução tamponada para citometria</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, França</td><td>Tampão 023862</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade e concentração</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, França</td> Kit <td>024708</td><td>para avaliação de viabilidade</td></tr><tr><td>Kit de atividade mitocondrial</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, França</td><td></td><td>Kit 024864 para atividade mitocondrial avaliação</td></tr><tr><td>Kit de viabilidade e integridade acrossômica</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, França</td> Kit <td>de 025293</td><td>para avaliação da integridade acrossômica</td></tr><tr><td>JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, EUA</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Esperma bovino</td><td>"SION", empresa israelense para inseminação artificial e drenagem, Hafetz-Haim, Israel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Spermiograms padrão, descrevendo a qualidade do esperma baseiam-se principalmente os parâmetros fisiológicos e visuais, tais como o volume de ejaculação e concentração, motilidade e motilidade progressiva e morfologia do esperma e viabilidade. No entanto, nenhuma destas avaliações é bom o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Dado que a manutenção da viabilidade do esperma e fertilização potencial depende da integridade de membrana e funcionalidade intracelular, avaliação desses parâmetros poderá permitir uma melhor previsão de competência de fertilização do espermatozoide. Aqui, descrevemos três métodos viáveis para avaliar a qualidade do esperma utilizando sondas fluorescentes específicas, combinadas com análises de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Análises avaliaram integridade de membrana plasmática usando 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e iodeto de propidium (PI), integridade da membrana acrossomal usando conjugada com isotiocianato de fluoresceína aglutininas Pisum sativum (FITC-PSA) e integridade de membrana mitocondrial usando 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1). Combinações destes métodos também são apresentadas. Por exemplo, uso de anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico). Acreditamos que essas metodologias, que são baseadas em examinar as membranas do espermatozoide, são muito úteis para a avaliação da qualidade do esperma.

A Figura 1 mostra simultânea fluorimétrica avaliação das membranas de esperma (plasma, acrossomal e mitocondrial) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Avaliação das membranas de esperma usando coloração simultânea com quatro sondas fluorescentes, por exemplo, permite avaliar a proporção de espermatozoides em cada categoria — live vs mortos; alta vs baixa ΔΨm; intacta vs. danificado o acrossoma — simultaneamente para cada espermatozoide...

Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.

Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

O objetivo desses procedimentos é avaliar a integridade das membranas espermatozoides utilizando sondas fluorescentes específicas combinadas com microscopia de fluorescência ou análise de citometria de fluxo. Essas técnicas podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo da reprodução, como a previsão do potencial de fertilização e a qualidade da amostra de espermatozoides. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem uma avaliação precisa de múltiplas membranas espermatozoides que são conhecidas por associar-se ao potencial de fertilização do esperma.As implicações dessas técnicas se estendem para o diagnóstico da qualidade da ejaculação, pois permite uma avaliação mais precisa do plasma de espermatozoides e da integridade da membrana acrosana, bem como do potencial da membrana mitocondrial. Para iniciar este procedimento, obtenha aproximadamente um a seis mililitros de sêmen de touro em um tubo de 15 mililitros à temperatura ambiente. Adicione seis mililitros de tampão NKM pré-aquecido a 37 graus Celsius a cada um mililitro de sêmen.Centrifugar a 600 vezes g por oito minutos. Repita a centrifugação uma ou duas vezes até que o sobrenatante esteja limpo. Depois disso, descarte imediatamente a maior parte do supernante, deixando aproximadamente um centímetro de sobrenante acima da pelota.Incline cuidadosamente os tubos em um ângulo de 30 graus na incubadora e espere de 20 a 30 minutos para permitir que os espermatozoides nadem para cima. Usando uma micropipette, remova cuidadosamente o mililitro restante de supernadário que agora contém o espermatozoide motile e transfira-o para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Mantenha o esperma a 37 graus Celsius até estar pronto para usar.Primeiro, prepare todas as soluções de estoque necessárias, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira 133 microliters do espermatozoide motile a uma concentração de 25 milhões de espermatozoides por mililitro para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 17 microliters da solução de trabalho DAPI e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Centrifugar a 1.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione 100 microliters de tampão NKM à pelota. Em seguida, adicione 50 microliters de FITC-PSA, dois microliters de JC-1, e três microliters de PI. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Centrifugar a 1.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 40 microliters de tampão NKM. Em seguida, transfira 10 microliters da amostra para um slide de vidro.Esfregue a amostra e adicione uma mancha de cobertura. Depois disso, imediatamente comece a visualizar a amostra por microscopia de epifluorescência com um objetivo de 40X e um filtro triplo conforme descrito no protocolo de texto, usando uma câmera digital para capturar uma imagem separada para cada filtro. Use a opção mesclar no software da câmera para mesclar as três imagens recebidas dos filtros, salvando o novo arquivo no formato JPEG.Abra a imagem mesclada com a ferramenta de pintura e use a opção pincel para marcar o espermatozoide contado. Em seguida, classifique o espermatozoário com base na fluorescência emitida de cada sonda, certificando-se de avaliar pelo menos 200 espermatozoides por slide. Todas as células devem parecer azuis do DAPI.Conte as células mortas, que parecem roxas, para avaliar a viabilidade. Em seguida, use os padrões de coloração de fluorescência para avaliar o estado acrosto. Por fim, avalie o potencial da membrana mitocondrial distinguindo os espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial que exibem uma peça média manchada de vermelho do espermatozoário com baixo potencial de membrana mitocondrial que exibem uma peça média manchada de verde.Conte as peças vermelhas e verdes separadamente e calcule sua razão. Para iniciar a avaliação da integridade da membrana plasmática, pegue o número desejado de poços a partir do kit de viabilidade e concentração. Transfira os poços para a base de trabalho e cubra-os com uma tampa flexível para protegê-los da luz.Adicione 199 microliters de solução tamponada para citometria a cada poço. Em seguida, adicione um microliter de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação. Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Depois disso, execute a amostra através do citômetro de fluxo usando o ajuste de viabilidade. Para começar a avaliar o potencial da membrana mitocondrial, retire o número desejado de poços do kit de atividade mitocondrial. Transfira-os para a base de trabalho.Adicione 10 microliters de etanol absoluto a cada poço e use uma pipeta para resuspensar o pó presente dentro do poço. Adicione 190 microliters de PBS por poço e homogeneize por pipetação. Adicione 0,75 microliters de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação.Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, execute a amostra através do citómetro de fluxo usando a configuração de atividade mitocondrial. Para começar a avaliar a integridade da membrana acrosomal, retire o número desejado de poços a partir do kit de viabilidade e integridade acrosma.Transfira os poços para a base de trabalho e cubra-os com uma tampa flexível para protegê-los da luz. Adicione 200 microliters de solução tamponada para citometria a cada poço. Em seguida, adicione 0,7 microliters de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação.Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Depois disso, execute a amostra através do citômetro de fluxo usando a configuração de insight. Neste estudo, a qualidade do sêmen é avaliada utilizando-se diferentes técnicas, uma das quais avaliou as membranas espermatozoides utilizando sondas fluorométricas.É possível avaliar as diferenças na qualidade da amostra de esperma em termos de integridade da membrana. Por exemplo, a ejaculação do touro número sete tinha uma porcentagem relativamente baixa de células mortas, uma baixa proporção de espermatozoides com acrossomo pseudo-reagido, e maior potencial de membrana mitocondrial quando comparado com a ejaculação do touro número um. As amostras são então avaliadas para viabilidade e atividade mitocondrial.Os histogramas para esses exemplos representativos representam os espermatozoides untados e os detritos e os espermatozoides fechados. Esses histogramas também representam as células viáveis e mortas e a distribuição de espermatozoides à membrana mitocondrial polarizada e des polarizada. A integridade acrosma é então avaliada com um kit pronto para uso e lida com citometria de fluxo, dividindo a área em três áreas de marcador que representam células de baixa fluorescing insignificantes com acrosmos intactas não manchadas, células fluorescentes baixas com parte manchada residual do acrosomo, e células altamente fluorescentes com acrooso interrompido.Ao tentar esses procedimentos, é importante ter certeza de preparar adequadamente a amostra inicial de espermatozoides. Essas técnicas podem fornecer insights sobre a avaliação da qualidade do esperma e podem ser aplicadas a vários organismos, como bovinos, aves e humanos. A comparação entre as duas técnicas, a coloração quádrupla e a citometria de fluxo não indicaram diferenças significativas para a viabilidade, o potencial da membrana mitocondrial e a integridade acrosma revelando que as duas técnicas produziram resultados correspondentes.

fluorimetric-techniques-for-the-assessment-of-sperm-membranes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de...

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Ovos e os revestimentos extracelular em torno de ovos com freqüência liberação de peptídeos, proteínas e pequenas moléculas que se comunicam com o esperma para guiá-los até o óvulo, promovendo assim a fecundação. Usando o esperma de rã que descrever e comparar duas classes de testes usados ​​para detectar quimiotaxia esperma - ensaios de esperma acumulação e ensaios de monitoramento de esperma.

Dois tipos de ensaios para detecção de quimiotaxia Sapo Sperm

Neste vídeo, demonstramos uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho de detecção de fluorescência para rastrear a estabilidade da proteína de membrana fundida com proteína fluorescente verde (GFP) em Escherichia coli após a solubilização do detergente. Proteínas que exibem um pico simétrico no perfil de exclusão de tamanho com pouca ou nenhuma GFP livre indicam proteínas purificadas com degradação e agregação mínimas, que podem ser posteriormente selecionadas para análise...

Cromatografia de exclusão de tamanho por detecção de fluorescência: uma técnica para identificar a integridade de proteínas de membrana fluorescente após solubilização de detergente

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca2 +de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

O presente protocolo fornece uma solução prática que permite a medição de apoptose, potencial de membrana mitocondrial e danos ao DNA em espermatozoides humanos com um único citômetro.

Análise por Citometria de Fluxo de Biomarcadores para Detecção de Defeitos Funcionais do Espermatozoide Humano

Descrevemos as etapas detalhadas de um ensaio químico de alto rendimento no nematóide Caenorhabditis elegans usado para avaliar a toxicidade da linha germinativa. Neste ensaio, a interrupção da função germinativa após a exposição química é monitorada usando um repórter fluorescente específico para embriões aneuploides.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Aprenda técnicas fluorimétricas para avaliar a integridade das membranas de espermatozoides usando sondas fluorescentes, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Esses métodos permitem prever o potencial de fertilização e diagnosticar a qualidade do ejaculado com precisão.

Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Explorar mais vídeos