Name: Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda a medir o metabolismo energético em tecido de retina explantado de camundongo usando análise de fluxo extracelular. Este método permite avaliar glicólise e fosforilação oxidativa em tempo real para estudos de biologia retiniana.

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Agradecemos o Dr. Alexander Kolesnikov e Dr. Vladimir Kefalov para fornecer Gnat1- / -ratos, para comentários úteis e conselhos e para ler o manuscrito.
Este trabalho foi financiado pelo NIH EY025269 (RR), o Diabetes Research Center na Universidade de Washington - NIH DK020579 (JRM e RR), um prêmio de desenvolvimento de carreira de investigação para evitar cegueira (RR), a Fundação Horncrest (RR), um prêmio de desenvolvimento de carreira de (JDRF JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) e DK114233 (JRM).

Protocolos seguiram a associação para pesquisa em visão e oftalmologia declaração sobre a utilização dos animais e foram aprovados pela Universidade de Washington.
1. preparação animal
<ol><li>Manter animais em habitação padrão com um 12 horas escuro para ciclo de luz de 12 horas. Begin experimentos no padronizado para evitar efeitos circadianos, geralmente pela manhã, logo que as luzes estão ativadas.</li>
</ol>2. preparação da solução
<ol><li>Preparar a mídia base dissolvendo 8,4 mg de mídia em pó em bidestilada H2O (ddH2O) e ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH, até um volume final de 1 L. Filter esterilizar esta solução com um filtro de cultura de tecidos de 0,22 µm.<ol>
<li>Adicione 1 M glicose e piruvato de sódio de 100 mM para os meios de comunicação para atingir concentrações finais de glicose de 5 mM e 1 mM piruvato.</li>
		<li>Lugar uma alíquota de 50 mL da mídia base em banho maria a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de Lise, para quantificação de tecido no final da análise de fluxo, adicionando a base tris 10 mM, polietileno glicol éter de tert-octilfenil a 0,2% (v/v) e EDTA 1 mm, todos em ddH2Mix O. até que todos os componentes completamente dissolvido e ajustar pH para 8,0.</li>
	<li>Para o protocolo de estresse mitocondrial, prepare um estoque de 11 µM de oligomicina, um inibidor da ATP sintase, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM no poço. Preparar um estoque de 11 µM de cianeto de carbonila - 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), um agente de desacoplamento, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM no poço. Preparar um coquetel de inibidores da cadeia de transporte de elétrons, rotenona e antimycin A (RAA), adicionando a rotenona a 11 µM e antimycin A para 22 µM, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM rotenona e 2 µM antimycin A no bem.</li>
	<li>Para o protocolo da glicólise, prepare um estoque de 220 mM de glicose dissolvido em base meios de comunicação, para atingir uma concentração final de 20 mM no poço. Também prepare um estoque de 1,1 M de 2-deoxyglucose (2-DG), um inibidor competitivo da glicose e antagonista glicolítico, dissolvendo-a em base meios de comunicação. Isso será alvo de uma concentração final de 100 mM 2-DG no poço.</li>
</ol>3. calibragem
<ol><li>Para calibrar a instrumentação para um ensaio de fluxo extracelular, adicionar 1 mL de solução de calibração para cada poço do refil do sensor (total de 24 poços) e incubar a 37 ° C em uma CO2-livre incubadora durante a noite (ou pelo menos 8 h).</li>
	<li>Carregar os aditivos para o protocolo de estresse mitocondrial ou o protocolo de glicólise em cada porta-injector, À D, no cartucho de sensor, ajuste para variações de volume no poço. Nota: Por exemplo, um ensaio típico incluiria 45 µ l de aditivo para a primeira porta-injector, 49,5 µ l para o segundo, 54,5 µ l para o terceiro e 60 µ l para o último, assumindo um volume bem inicial de 450 µ l.</li>
	<li>Durante as primeiras experiências diversas, carrega mídia base no Porto A medir quanto movimento/artefato de tecido ocorre depois de uma injecção.</li>
	<li>Deixe a placa de sensor carregado incubar a 37 ° C numa incubadora de CO não2 pelo menos 60 min.</li>
</ol>4. isolamento do tecido Retinal Mouse fresco
Nota: Esta etapa é adaptada à técnica da Dr. Barry Winkler15.
<ol><li>Após administrar anestesia profunda, usando um padrão cocktail de xilazina/cetamina, eutanásia em ratos por deslocamento cervical.</li>
	<li>Use um par de pinças curvas médias para agarrar o globo posterior no nervo óptico e aplicar suavemente a pressão para a frente de proptose do olho (figura 1A).<ol>
<li>Com uma lâmina de barbear limpa, crie uma incisão do limbo ao limbo entre a córnea usando um passe único, preciso da lâmina.</li>
		<li>Usando bem, fórceps de estilo McPherson angulado, beliscar o globo posterior para expressar a lente e membranas hialoide anteriores fora da incisão da córnea. Descarte desses tecidos.</li>
		<li>Repita a manobra beliscar com fórceps para expressar a retina neural.</li>
		<li>Para levantar a retina, ao invés de agarrar o tecido, usando a pinça como uma colher, transfira a retina longe da incisão da córnea e diretamente em uma mídia quente em um prato de 3cm ou uma placa de aglomerado de cultura de tecidos de 6-poços.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use dois pares de pinças de McPherson-estilo fina, angulares para dissecar cuidadosamente restante vítreo da retina. Este é o melhor feito segurando o vítreo na periferia da Copa da retina e puxando em direção ao centro, com um final desinserção do corpo vítreo do centro como um todo. Usando a pinça, remova qualquer residual epithelium retinal do pigment da superfície fotorreceptoras da retina.<ol>
<li>Corte a ponta da pipeta P1000 com uma lâmina de barbear para criar uma abertura de ~ 4 mm para evitar trauma indevida para o delicado tecido da retina durante manobras de transferência.</li>
		<li>Transferi o tecido da retina isolado em fresca mídia usando uma corte ponta da pipeta P1000.</li>
		<li>Corte socos de 1 mm da retina ao redor do nervo óptico com uma biópsia de 1mm soco equipado com um êmbolo para desalojar o tecido, no caso de ele fica alojado na perfuração (figura 1B). Defina os socos da retina lado na mídia limpa mantido em um bloco de 37 ° C ou almofada de aquecimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. protocolo do ensaio
<ol><li>Transferência individuais socos para microplacas de captura um ilhéu 24-bem usando uma corte ponta P1000, aspirando a 450 µ l de mídia juntamente com o tecido.</li>
	<li>Use bem, pinça reta para manipular suavemente socos no centro do microplate. Mantenha socos orientados na mesma direção (por exemplo, gânglio célula lado para cima).<ol>
<li>Descanse a placa de captura em uma almofada de aquecimento ou aquecimento bloco conjunto a 37 ° C, como essas etapas são repetidas para as restantes amostras. Nota: Para cada experimento, Reserve 3-4 poços em branco com 450 µ l de mídia base para servir como controles negativos. Nos restantes 20-21 poços, teste cada biológico replicar em triplicado. Portanto, cada placa de 24 permitirá gravação de 6-7 diferentes animais ou condições de tratamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evitando as bolhas de ar, delicadamente posição o ilhéu capturar malha inserções em cada poço usando fórceps e fixe as inserções com uma haste de metal, ou com uma ponta da pipeta P1000 corte (Figura 1 C). Nota: Evite o movimento excessivo tecido durante esta etapa para manter a posição da retina soco dentro do centro de microchamber a amostra. Bolhas de ar severamente distorcem leituras de OCR. Embora o microchamber tem profundidade suficiente para acomodar a retina típico do mouse (Figura 1), ocasionalmente, usinagem-defeitos nas inserções malha podem causar tecidos tornar-se excessivamente compactados durante a inserção de tela. Se isso acontecer, basta fazer uma nota do tecido esmagado e excluir essa amostra de análise final.</li>
	<li>Incubar a placa de tecido em um de 37 ° C CO2-incubadora livre pelo menos 60 min.</li>
	<li>O analisador de fluxo extracelular usando Mix, espera, medida do programa e repita os comandos. Por exemplo, um experimento típico com tecido da retina pode incluir o seguinte: Misture 2 minutos, esperar 2 minutos e 5 minutos de medir. Repetir o experimento com estes três passos entre 5 - 8 vezes (ciclos) para uma gravação de base e após a injeção de cada composto sendo testado durante a execução.</li>
	<li>Pressione o botão de arranque do programa sobre o analisador de fluxo extracelular e siga as instruções na tela para inserir o cartucho de sensor para calibração.</li>
	<li>No final da calibração, siga as instruções na tela para substituir a placa de calibrant com a placa contendo as amostras da retina.</li>
	<li>Permitir que o programa seja executado, conforme programado. Após a conclusão da execução, siga as instruções na tela para ejetar a placa de tecido. Exibir os resultados da execução e armazenar o arquivo de dados.</li>
	<li>Com uma agulha de calibre 20 torta e fórceps, remova todas as inserções de malha dos poços, deixando o soco da retina.</li>
	<li>Cuidadosamente Aspire a mídia no tecido e lave o tecido duas vezes com 0,5 mL de frio fosfato salino (PBS). Aspire a PBS após a lavagem.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de tampão de lise de cada poço e pipetar acima e para baixo para homogeneizar o tecido.</li>
	<li>Dose os níveis de entrada com base no total DNA de cadeia dupla (dsDNA) ou conteúdo de proteína total. Nota: A seguir é baseada em um ensaio de dsDNA comercialmente disponível.</li>
	<li>Diluir as amostras lisadas 1:1 adicionando-se 100 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) e transferir 100 µ l da amostra diluída para um prato bem 96.<ol>
<li>Adicione 100 µ l de tampão de deteção para cada poço. Após a mistura para 2-5 minutos, dosar fluorescência após excitação a 480 nm e emissão em 520 nm, comparando com uma curva padrão.</li>
		<li>Normalize o rastreamento de fluxo extracelular cru para conteúdo de DNA dentro do poço. Nota: Os resultados aqui apresentados, as amostras são normalizadas para 50 ng dsDNA - uma quantidade típica em um soco de 1 mm da retina. Portanto, valores absolutos apresentados aqui podem ser comparados aos estudos apresentando dados "por soco da retina". Normalize os traçados de um padrão interno, tais como a linha de base executar em uma concentração de glicose de 5 mM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
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<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
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<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
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<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

OCR e ECAR prontamente são medidos em explantados tecido retinal usando um bioanalyzer usando as técnicas descritas. Este método parte das de outros grupos em várias etapas críticas. Tecidos da retina são isolados por meio de uma grande incisão da córnea sem enucleating do globo, como foi originalmente descrito por Winkler15. Este método de isolamento da retina permite uma rápida transferência do olho vivo para a placa de captura de tecido (muitas vezes dentro de 5 minutos). Os tecidos são mantido...

A retina é entre os tecidos mais exigentes de energia no sistema nervoso central1. Como a maioria dos tecidos, gera triphosphate de adenosina (ATP) via glicólise no citosol ou via fosforilação oxidativa em mitocôndrias. A vantagem energética da fosforilação oxidativa sobre glicólise para produzir ATP a partir de uma molécula de glicose é clara: 36 moléculas de ATP gerado a partir do antigo vs 2 moléculas de ATP gerado deste último. Por conseguinte, os neurônios da retina dependem principalmente de respiração mitocondrial para fornecimento de energia e isto é refletido por sua alta densidade de mitocôndrias2. Ainda, a retina também confia pesadamente na maquinaria glicolítico mesmo quando o oxigênio é abundante. Este processo de glicólise aeróbica foi originalmente descrito em células cancerosas por Otto Warburg3, que uma vez observou que a retina foi o tecido apenas pós mitótico capaz desta forma de metabolismo4. Desde essas observações iniciais, muitos tecidos pós mitóticos têm sido descritos para se envolver em vários graus de glicólise além de fosforilação oxidativa para atender suas demandas de ATP.
Fototransdução, pigmentos visuais, reciclagem, biossíntese de segmentos exteriores fotoreceptor e atividade sináptica são todos os processos exigentes de energia nos fotorreceptores, a subclasse neuronal predominante na retina. Mas a necessidade de transportar ativamente íons contra seus eléctricos e gradientes de concentração é de longe o processo que consumia muito mais energicamente em neurônios1. Fotorreceptores são neurônios peculiares no sentido de que eles são despolarizados na ausência de estimulação (ou seja, no escuro), Considerando que um estímulo de luz aciona o fechamento do canal e hiperpolarização subsequente. Portanto, no escuro, a retina consome grandes quantidades de ATP para manter sua despolarização ou "corrente escura", como é comumente chamado. Do ponto de vista adaptativa, um grande desafio no fornecimento destes grandes quantidades de ATP é a necessidade dos organismos manter a clareza visual através do eixo óptico. A arquitetura da retina invertida vista em modernas criaturas é a solução dominante, como mantém a densa rede capilar fornecendo fotorreceptores longe o caminho da luz. Mas esta maravilha de bioengenharia natural coloca a retina em um precipício em termos de reserva metabólica. Mesmo pequenos insultos à retina potencialmente podem perturbar o delicado equilíbrio da oferta e a procura de energia, e disfunção visual ou cegueira franca possam decorrer rapidamente.
Dada a demanda energética única da retina neural, juntamente com sua restrição apertada de suprimento vascular, medição precisa do consumo de ATP, a retina e suas mudanças durante a doença pode ter profundas implicações na compreensão e tratamento cegando condições tais como a retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Tradicionalmente, estas medidas exigem equipamentos caros, personalizados com a maioria dos estudos emergentes de um punhado de laboratórios inteiramente dedicado às medições da atividade metabólica2,5,6, 7,8. As técnicas incluem ensaios individuais para metabolitos específicos, estudos de rastreamento usando precursores rotulado de rádio, gravação usando eletrodos de Clark e metabolómica9de criação de perfil de consumo de oxigênio.
Com os avanços na tecnologia de alta produtividade e aumento da disponibilidade de dispositivos comerciais, técnicas de registro metabolismo da retina são cada vez mais acessível e disponível. O método descrito aqui mede ambos fosforilação oxidativa e glicólise na retina usando explantados tecido e um analisador do fluxo extracelular comercialmente disponíveis9,10,11,12. Este analisador separadamente registra taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação do extracelular (ECAR), servindo como indicadores indirectos de fosforilação oxidativa e glicólise, respectivamente13. Essas medições são feitas por uma sonda submergida dentro de um microchamber criado sobre o tecido de interesse. Esta adaptação dos métodos publicados anteriormente usa uma placa de captura, projetada originalmente para pâncreas ilhotas de Langerhans para gravar a atividade metabólica em seções pequenas, circulares da retina do rato. Várias exposições farmacológicas podem ser entregues para o tecido no decurso de uma única gravação, porque o sistema contém 4 portas de injeção para cada amostra bem. Usando este sistema com protocolos separados, otimizados para gravações ECAR e OCR, respostas do selvagem-tipo retina podem ser comparadas com as retinas falta transducina (Gnat1- / -), uma causa de cegueira congênita de noite estacionária em os seres humanos14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 Analisador de Fluxo Extracelular</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (inclui: Microplaca de Captura de Ilhotas, Cartucho de Sensor e Solução Calibrante)</td> <td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Inclui microplaca de captura de ilhotas, cartucho de sensor e solução calibrante</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Mídia (Meio em pó)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 Meio com L-Glutamina e sem glicose ou bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glucose filtrado, para preparação de meios</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Antimicina-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Componente de protocolo de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Componente do protocolo de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Componente do protocolo de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>2-desoxiglicose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Componente do protocolo de glicólise</td></tr><tr><td>punções de biópsia de pele de 1 mm com êmbolo</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25 Ferramenta de</td><td>tecido retiniano explantante</td></tr><tr><td>Dumont Mini-Fórceps Ferramentas Retas</td><td>de Ciências Finas</td><td>11200-10 Ferramenta de</td><td>explante de tecido retiniano</td></tr><tr><td>Dumont Medical # 5/45 Fórceps - Angular 45 graus</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11253-25 Ferramenta de</td><td>explante de tecido retiniano</td></tr><tr><td>Dumont # 7 Fórceps - Ferramentas de</td><td>Ciências Finas</td> Curvas <td>11271-30</td><td>Ferramenta de explantação de tecido retiniano</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Kit de ensaio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>Ensaio de normalização</td></tr> <tr><td>de carregamentoBase Trizma (Base Tris)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Componente do tampão de lise</td></tr><tr><td>Triton X-100 (éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Componente do tampão de lise</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Componente do tampão de lise</td></tr><tr><td>C57BL/6J camundongos&nbsp;</td><td>Laboratórios Jackson</td><td>&nbsp; Linhagem 000664</td><td>animais</td></tr><tr><td>Gnat1-/- e Gnat1+/+&nbsp;</td><td>Vladimir Kefalov, PhD; Escola de Medicina da Universidade de Washington</td><td>Animais</td><td></td></tr></tbody></table>

medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Visão de alta acuidade é um processo altamente consumidores de energia, e a retina desenvolveu várias adaptações exclusivas para atender precisamente tais demandas, mantendo a transparência do eixo visual. Perturbações para este delicado equilíbrio causam doenças cegantes, como retinopatia diabética. Portanto, a compreensão das mudanças do metabolismo de energia na retina durante a doença é fundamental para o desenvolvimento de terapias racionais para várias causas de perda de visão. O recente advento dos analisadores de fluxo extracelular comercialmente disponíveis tornou mais acessível o estudo do metabolismo energético da retina. Este protocolo descreve o uso de um analisador de medir as contribuições para o fornecimento de energia da retina através de seus braços dois princípio - fosforilação oxidativa e glicólise - através da quantificação de alterações em taxas de consumo de oxigênio (OCR) e extracelular taxas de acidificação (ECAR) como proxies para essas vias. Esta técnica é executada prontamente no tecido da retina explantado, facilitando a avaliação das respostas a vários agentes farmacológicos em uma única experiência. Assinaturas metabólicas em retinas de animais sem haste fotorreceptoras sinalização são comparadas aos controles do selvagem-tipo usando esse método. Uma limitação importante nesta técnica é a falta de capacidade de discernir entre a utilização de energia de luz-adaptado e vez, uma importante consideração fisiológica no tecido da retina.

Usando as técnicas descritas (resumidas na Figura 1), retinais explantes de 8 semanas de idade selvagem tipo (WT) de ratos foram comparados a idade - e fundo-combinada transducina nula ratos (Gnat1- / -). Porque Gnat1- / - animais não possuem a maquinaria para fechar nucleotídeo cíclico condomínio fechado de canais iônicos em resposta a estímulos de luz, os fotorreceptores haste permanecem despolarizadas mesmo ...

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave, como como o metabolismo energético no tecido retiniano difere entre amostras biológicas ou após a exposição a agentes farmacológicos. A principal vantagem dessa técnica é que utiliza tecido retiniano organotípico explantado para medir taxas tanto de glicólise, quanto de fosforilação oxidada e permite avaliações de intervenções em tempo real in vitro. Para calibrar a instrumentação para um ensaio de fluxo extracelular adicione primeiro um mililitro de solução de calibração a cada poço do cartucho de 24 poços, e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de Co2 durante a noite.Carregar aditivos para o protocolo de estresse mitocondrial, ou o protocolo de glicolise em cada porta injetora no cartucho do sensor, ajustando para mudanças de volume no poço. Assumindo um volume inicial de poços de 450 microliters, um ensaio típico incluiria 45 microlitres de um aditivo na primeira porta injetora, 49,5 microliters no segundo, 54,5 microlitrais no terceiro e 60 microliters no último. Durante os primeiros experimentos, a base de carga é meio na porta A para medir a quantidade de artefato de movimento tecidual após uma injeção de porta.Deixe a placa do sensor carregada incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora não Co2 por pelo menos 60 minutos. Comece o isolamento do tecido de retina de rato fresco com um rato recém-eutanizado. Use um par de fórceps curvados de tamanho médio para agarrar o globo posterior no nervo óptico, e aplique suavemente pressão para a frente para proptose o olho.Com uma lâmina de barbear limpa, crie um limbus para limbus incision através da córnea usando um único e deliberado passe da lâmina. Usando fórceps estilo McPherson em ângulo fino, aperte o globo posterior para expressar a lente e as membranas hiloides anteriores da incisão da córnea. Repita a manobra de beliscar com fórceps para expressar a retina neural.Em seguida, use os fórceps como uma colher para levantar a retina para longe da incisão córnea. Coloque a retina diretamente no meio quente em um prato de três centímetros, ou uma placa de aglomerado de cultura de seis poços. Em seguida, use dois pares de fórceps de estilo mcpherson de ângulo fino para dissecar suavemente vítreos restantes da retina.Isso é melhor feito agarrando o vítreo na periferia da xícara de retina, e puxando para o centro, com uma desinserção final do corpo vítreo do centro como um todo. Em seguida, remova qualquer epitélio de pigmento de retina residual da superfície do receptor fotográfico da retina. Corte uma ponta de pipeta P1000 com uma lâmina de barbear para criar uma abertura aproximada de quatro milímetros para evitar traumas indevidos no delicado tecido da retina durante as manobras de transferência.Em seguida, use a ponta de pipeta cortada para transferir o tecido de retina isolado para um meio fresco. Finalmente, use um soco de biópsia de um milímetro equipado com um êmbolo, para cortar socos de retina ao redor do nervo óptico. Coloque os socos de retina de lado em meio limpo, mantido em um bloco Celsius de 37 graus ou almofada de aquecimento.Uma vez que o número desejado de socos tenha sido coletado, use uma bela ponta P1000 para aspirar um soco individual em 450 microliters de médio, e transferi-lo para uma micro placa de captura de ilhós de 24 poços em uma almofada de calor de 37 graus Celsius ou bloco de calor. Use fórceps finos e retos para manipular suavemente socos no centro da micro placa. Mantenha os socos orientados na mesma direção.Por exemplo, com o lado da célula de gânglio para cima. Para cada experimento, reserve de três a quatro poços em branco com 450 microliters de meio base para servir como controles negativos. Evitando bolhas de ar ou movimento excessivo, posicione suavemente as pastilhas de captura de ilhós em cada poço e fixe as pastilhas com um êmbolo metálico ou com uma ponta de pipeta P1000 cortada.Embora a micro câmara tenha profundidade adequada para acomodar a retina típica do rato, ocasionalmente os defeitos da máquina nas pastilhas de malha fazem com que os tecidos fiquem excessivamente comprimidos durante a inserção da tela. Se isso acontecer, basta anotar este tecido esmagado, e excluir essa amostra da análise final. Incubar a placa de tecido em uma incubadora sem dióxido de carbono de 37 graus Celsius por pelo menos 60 minutos.Programe o analisador de fluxo celular extra usando comandos de mistura, peso, medida e repetição. Como exemplo, um experimento típico com tecido retiniano pode incluir o seguinte. Misture dois minutos, espere dois minutos e meça cinco minutos.Repita o experimento com estes três passos entre cinco a oito vezes para a gravação da linha de base e após a injeção de cada composto sendo testado. Pressione o botão de partida do programa no analisador de fluxo extracelular e siga as instruções na tela para inserir o cartucho do sensor para calibração. No final da calibração, siga as instruções na tela para substituir a placa calibrante pela placa contendo as amostras de retina e, em seguida, permitir que o programa seja executado conforme programado.Na conclusão da corrida, siga instruções na tela para ejetar a placa de tecido. Veja os resultados da execução e armazene o arquivo de dados. Com uma agulha de calibre 20 dobrada e fórceps, remova todas as pastilhas de malha dos poços, deixando o soco de retina para trás.Aspire cuidadosamente o meio do tecido e lave o tecido duas vezes com 0,5 mililitros de soro fisiológico tamponado de fosfato frio. Depois de aspirar a segunda lavagem pbs, adicione 100 microliters de tampão de lise a cada lavagem, e pipeta para cima e para baixo para homogeneizar o tecido. Finalmente, quantita os níveis de entrada com base no teor total de DNA duplo encalhado, diluindo amostras de lise de um para um, com 100 microliters de tampão Tris-EDTA, e transferindo 100 microliters da amostra diluída para uma placa de poço de 96.Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de detecção a cada poço e misture por dois a cinco minutos. Por fim, quantita a florescence após excitação a 480 nanômetros e emissão a 520 nanômetros, comparando-se a uma curva padrão. Normalize o rastreamento de fluxo extracelular bruto para o conteúdo de DNA dentro do poço.Na linha de base, na presença de 5 mili muller de glicose e na presença de piruvato de 10 mil muller, não há diferença significativa nas taxas de eflux ácido, medida pela taxa de acidificação extracelular. Entre tecidos de retina de animais do tipo wile, ou derrubar camundongos que não têm o maquinário para fechar canais de íons nucleotídeos cíclicos em resposta a estímulos leves. Padrões semelhantes são vistos após a adição de 20 milildáxicos de glicose e o inibidor glicóltico 2DG.Esses dados podem ser matematicamente transformados para representar mudanças fracionadas a partir da linha de base, um formato que pode permitir uma melhor comparação entre diferentes intervenções experimentais. A taxa de consumo absoluto de oxigênio na linha de base também é equivalente entre controle e tecido de retina mutante. A adição de 20 mili muller de glicose aumenta a respiração mitocondrial, mas nenhuma mudança observada entre os grupos em termos de quantificação absoluta ou em termos de mudança da linha de base.A adição de uma milli muller FCCP, um agente de desacoplamento, para demonstrar taxas respiratórias mitocondriais máximas não aumenta significativamente o OCR acima do nível visto com alta glicose no controle e tecido retiniano mutante. No entanto, os sinais de ambos os ratos caem drasticamente após a adição do coquetel RAA. Em conclusão, demonstramos uma técnica para quantitação de fosforilação oxidada e glicólise em explanações organotípicas da retina do camundongo.Com o isolamento eficiente do tecido retiniano, a técnica produz medidas confiáveis e reroucíveis. Os efeitos em tempo real das exposições, como agentes de desacoplamento, podem ser avaliados. Além desse procedimento, outros métodos, como o RTPCR quantitativo e a mancha ocidental, podem ser realizados no tecido excedente isolado na etapa de dissecção para obter informações paralelas relevantes aos estudos do metabolismo da retina.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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