Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave, como como o metabolismo energético no tecido retiniano difere entre amostras biológicas ou após a exposição a agentes farmacológicos. A principal vantagem dessa técnica é que utiliza tecido retiniano organotípico explantado para medir taxas tanto de glicólise, quanto de fosforilação oxidada e permite avaliações de intervenções em tempo real in vitro. Para calibrar a instrumentação para um ensaio de fluxo extracelular adicione primeiro um mililitro de solução de calibração a cada poço do cartucho de 24 poços, e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de Co2 durante a noite.

Carregar aditivos para o protocolo de estresse mitocondrial, ou o protocolo de glicolise em cada porta injetora no cartucho do sensor, ajustando para mudanças de volume no poço. Assumindo um volume inicial de poços de 450 microliters, um ensaio típico incluiria 45 microlitres de um aditivo na primeira porta injetora, 49,5 microliters no segundo, 54,5 microlitrais no terceiro e 60 microliters no último. Durante os primeiros experimentos, a base de carga é meio na porta A para medir a quantidade de artefato de movimento tecidual após uma injeção de porta.

Deixe a placa do sensor carregada incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora não Co2 por pelo menos 60 minutos. Comece o isolamento do tecido de retina de rato fresco com um rato recém-eutanizado. Use um par de fórceps curvados de tamanho médio para agarrar o globo posterior no nervo óptico, e aplique suavemente pressão para a frente para proptose o olho.

Com uma lâmina de barbear limpa, crie um limbus para limbus incision através da córnea usando um único e deliberado passe da lâmina. Usando fórceps estilo McPherson em ângulo fino, aperte o globo posterior para expressar a lente e as membranas hiloides anteriores da incisão da córnea. Repita a manobra de beliscar com fórceps para expressar a retina neural.

Em seguida, use os fórceps como uma colher para levantar a retina para longe da incisão córnea. Coloque a retina diretamente no meio quente em um prato de três centímetros, ou uma placa de aglomerado de cultura de seis poços. Em seguida, use dois pares de fórceps de estilo mcpherson de ângulo fino para dissecar suavemente vítreos restantes da retina.

Isso é melhor feito agarrando o vítreo na periferia da xícara de retina, e puxando para o centro, com uma desinserção final do corpo vítreo do centro como um todo. Em seguida, remova qualquer epitélio de pigmento de retina residual da superfície do receptor fotográfico da retina. Corte uma ponta de pipeta P1000 com uma lâmina de barbear para criar uma abertura aproximada de quatro milímetros para evitar traumas indevidos no delicado tecido da retina durante as manobras de transferência.

Em seguida, use a ponta de pipeta cortada para transferir o tecido de retina isolado para um meio fresco. Finalmente, use um soco de biópsia de um milímetro equipado com um êmbolo, para cortar socos de retina ao redor do nervo óptico. Coloque os socos de retina de lado em meio limpo, mantido em um bloco Celsius de 37 graus ou almofada de aquecimento.

Uma vez que o número desejado de socos tenha sido coletado, use uma bela ponta P1000 para aspirar um soco individual em 450 microliters de médio, e transferi-lo para uma micro placa de captura de ilhós de 24 poços em uma almofada de calor de 37 graus Celsius ou bloco de calor. Use fórceps finos e retos para manipular suavemente socos no centro da micro placa. Mantenha os socos orientados na mesma direção.

Por exemplo, com o lado da célula de gânglio para cima. Para cada experimento, reserve de três a quatro poços em branco com 450 microliters de meio base para servir como controles negativos. Evitando bolhas de ar ou movimento excessivo, posicione suavemente as pastilhas de captura de ilhós em cada poço e fixe as pastilhas com um êmbolo metálico ou com uma ponta de pipeta P1000 cortada.

Embora a micro câmara tenha profundidade adequada para acomodar a retina típica do rato, ocasionalmente os defeitos da máquina nas pastilhas de malha fazem com que os tecidos fiquem excessivamente comprimidos durante a inserção da tela. Se isso acontecer, basta anotar este tecido esmagado, e excluir essa amostra da análise final. Incubar a placa de tecido em uma incubadora sem dióxido de carbono de 37 graus Celsius por pelo menos 60 minutos.

Programe o analisador de fluxo celular extra usando comandos de mistura, peso, medida e repetição. Como exemplo, um experimento típico com tecido retiniano pode incluir o seguinte. Misture dois minutos, espere dois minutos e meça cinco minutos.

Repita o experimento com estes três passos entre cinco a oito vezes para a gravação da linha de base e após a injeção de cada composto sendo testado. Pressione o botão de partida do programa no analisador de fluxo extracelular e siga as instruções na tela para inserir o cartucho do sensor para calibração. No final da calibração, siga as instruções na tela para substituir a placa calibrante pela placa contendo as amostras de retina e, em seguida, permitir que o programa seja executado conforme programado.

Na conclusão da corrida, siga instruções na tela para ejetar a placa de tecido. Veja os resultados da execução e armazene o arquivo de dados. Com uma agulha de calibre 20 dobrada e fórceps, remova todas as pastilhas de malha dos poços, deixando o soco de retina para trás.

Aspire cuidadosamente o meio do tecido e lave o tecido duas vezes com 0,5 mililitros de soro fisiológico tamponado de fosfato frio. Depois de aspirar a segunda lavagem pbs, adicione 100 microliters de tampão de lise a cada lavagem, e pipeta para cima e para baixo para homogeneizar o tecido. Finalmente, quantita os níveis de entrada com base no teor total de DNA duplo encalhado, diluindo amostras de lise de um para um, com 100 microliters de tampão Tris-EDTA, e transferindo 100 microliters da amostra diluída para uma placa de poço de 96.

Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de detecção a cada poço e misture por dois a cinco minutos. Por fim, quantita a florescence após excitação a 480 nanômetros e emissão a 520 nanômetros, comparando-se a uma curva padrão. Normalize o rastreamento de fluxo extracelular bruto para o conteúdo de DNA dentro do poço.

Na linha de base, na presença de 5 mili muller de glicose e na presença de piruvato de 10 mil muller, não há diferença significativa nas taxas de eflux ácido, medida pela taxa de acidificação extracelular. Entre tecidos de retina de animais do tipo wile, ou derrubar camundongos que não têm o maquinário para fechar canais de íons nucleotídeos cíclicos em resposta a estímulos leves. Padrões semelhantes são vistos após a adição de 20 milildáxicos de glicose e o inibidor glicóltico 2DG.

Esses dados podem ser matematicamente transformados para representar mudanças fracionadas a partir da linha de base, um formato que pode permitir uma melhor comparação entre diferentes intervenções experimentais. A taxa de consumo absoluto de oxigênio na linha de base também é equivalente entre controle e tecido de retina mutante. A adição de 20 mili muller de glicose aumenta a respiração mitocondrial, mas nenhuma mudança observada entre os grupos em termos de quantificação absoluta ou em termos de mudança da linha de base.

A adição de uma milli muller FCCP, um agente de desacoplamento, para demonstrar taxas respiratórias mitocondriais máximas não aumenta significativamente o OCR acima do nível visto com alta glicose no controle e tecido retiniano mutante. No entanto, os sinais de ambos os ratos caem drasticamente após a adição do coquetel RAA. Em conclusão, demonstramos uma técnica para quantitação de fosforilação oxidada e glicólise em explanações organotípicas da retina do camundongo.

Com o isolamento eficiente do tecido retiniano, a técnica produz medidas confiáveis e reroucíveis. Os efeitos em tempo real das exposições, como agentes de desacoplamento, podem ser avaliados. Além desse procedimento, outros métodos, como o RTPCR quantitativo e a mancha ocidental, podem ser realizados no tecido excedente isolado na etapa de dissecção para obter informações paralelas relevantes aos estudos do metabolismo da retina.