Name: Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a técnica E mais E para enriquecer e expandir células T antígeno-específicas raras usando nanopartículas magnéticas. Este método avança a imunoterapia personalizada e pesquisa em imunologia básica.

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J.W.H. obrigado NIH câncer nanotecnologia centro de treinamento no Instituto Johns Hopkins para nanobiotecnologia, a nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa (DGE-1232825) e a Fundação de arcos de apoio à comunhão. Este trabalho foi financiado pelo apoio do National Institutes of Health (R21 de P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de inovação TEDCO/Maryland e a Fundação de Coulter (JPS).

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<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572(2014).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: sob um acordo de licenciamento entre NexImmune e The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck tem direito a uma parte dos royalties recebidos pela Universidade sobre as vendas dos produtos descritos neste artigo. Ele também foi dos fundadores da NexImmune e é dono de capital na empresa. Ele serve como um membro do Conselho de administração e Conselho Consultivo Científico do NexImmune. Os termos destas disposições foram revistos e aprovados pela The Johns Hopkins University, em conformidade com suas políticas de conflito de interesses.

Nós criamos uma tecnologia de isolamento romance celular de T antígeno-específicos com base em nanopartículas artificial células apresentadoras (aAPCs). Nanopartículas aAPCs peptídeo-carregou MHC na superfície que permite a ligação de pilha de T antígeno-específicas e ativação ao lado de ativação co-estimulatória. aAPCs também são paramagnéticos e assim pode ser usados para enriquecer as células T antígeno-específicas raras usando um campo magnético. Nós temos otimizado e estudou Propriedades de chave de nanopartículas d...

Com a ascensão de muitos imunoterapias, há uma necessidade de ser capaz de caracterizar e controlar respostas imunes. Em particular, a resposta imune adaptativa é de interesse devido a especificidade e a durabilidade das pilhas. Recentemente, terapias de células T de receptor de antígeno quimérico foram aprovadas para a terapia do câncer; no entanto, os receptores de antígeno são baseados fora comum célula superfície antígeno CD19, em vez dos antígenos específicos para o câncer1. Além da especificidade, imunoterapias também podem sofrer com a falta de controle e limitada a compreensão da resposta imune dinâmica dentro de câncer ou auto-imunidade.
Um dos desafios de estudar respostas antígeno-específicas é sua extremamente baixa frequência, por exemplo., as células T antígeno-específicos são 1 de cada 104 106 T células2,3. Assim, para investigar qual T células estão presentes ou respondendo, as células precisam tanto ser enriquecido e ampliado, ou o sinal deles precisa ser amplificado. É caro e difícil de manter as células de alimentador usando técnicas atuais que incidem sobre a expansão de células antígeno-específicas. Células de técnicas atuais que enfocam amplificando o sinal de T antígeno-específicos, como a enzima-lig immunospot (ELISPOT) do ensaio, limitar a re-utilização dessas células T4. Finalmente, devido à baixa sensibilidade, muitas vezes estas duas técnicas precisam ser combinada para enumeração de antígeno-específicas.
Para solucionar esses problemas, nós desenvolvemos o antígeno de artificiais baseados em nanopartículas magnéticas apresentando célula (aAPC)5,6,7,8. A aAPC pode ser acrescida com um complexo antígeno-específicas-peptídeo sinal carregado histocompatibilidade (pMHC) - e moléculas coestimulatórias -ex., um anticorpo anti-CD28-para ambos enriquecer as células T antígeno-específicas e então posteriormente estimule sua expansão (Figura 1). As partículas, portanto, podem ser um produto de prateleira econômico que pode ser tanto personalizado para atender a estímulos de antígeno-específicas ainda padronizado através de experimentos e pacientes. Realizar o enriquecimento e a expansão processar resultados em centenas de milhares-dobra expansão de células T CD8 + de antígeno-específicas e pode resultar em frequências de até 60% após apenas uma semana, permitindo a caracterização ou uso terapêutico do grande número de células. Aqui, descrevemos como fazer nanopartículas aAPCs, algumas considerações de projeto crítico em escolher as propriedades de nanopartículas e demonstrar alguns resultados típicos de utilizar essas partículas no isolamento e na expansão raras células de CD8 + T antígeno-específicas.

<table><tbody><tr><td>DimerX I: Proteína de fusão humana dimérica solúvel recombinante HLA-A2: Ig</td><td>Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: Camundongo dimérico solúvel recombinante H-2D [b]: Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551323</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: Camundongo dimérico solúvel recombinante H-2K [b]: Proteína de fusão Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>550750</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932362</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932257</td><td></td></tr><tr><td>Microglobulina Humana Purificada Beta 2</td><td>Bio-Rad</td><td>PHP135</td><td></td></tr><tr><td>nanomag-D-spio, NH2, nanopartículas de 100 nm</td><td>Micromod</td><td>79-01-102</td><td></td></tr><tr><td>Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 &micro; m</td><td>Ocean Nanotech</td><td>SN0200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotina MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-637</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC Crosslinker&nbsp;</td>Cloridrato de 2-Iminotiopano <td>ProteoChem</td><td>c1109-100mg</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6256 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de Meia Área de 96 Poços, poliestireno preto</td><td>Corning</td><td>3875</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ig, &lambda; 1, &lambda; 2, & &lambda; 3 Correntes Leves&nbsp; Clonar &nbsp; R26-46 &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553434</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Armênio e Hamster Sírio IgG&nbsp; Clonar &nbsp; G192-1</td><td>BD Biociências</td><td>554026</td><td></td></tr><tr><td>B6. Camundongos Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (PMEL transgênico)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005023</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (B6 wildtype) Jackson</td><td>Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de células T CD8a+, camundongo</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>MS Colunas</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td></td></tr><tr><td>N52 ímãs de disco de 0,75 polegadas&nbsp;</td><td>K & J Magnetics</td><td>DX8C-N52</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a Anticorpo, clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Verdes Fixáveis, para excitação de 488 nm&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L-34969</td><td></td></tr></tbody></table>

enriquecer e expandir células raras t antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Nós desenvolvemos uma ferramenta para enriquecer e expandir as células T antígeno-específicas. Isto pode ser útil em casos como de A) detectar a existência de pilhas de T antígeno-específicas, B) sondar a dinâmica das respostas antígeno-específicas, C) compreender como antígeno-específicos respostas afetam o estado de doença, tais como a auto-imunidade, D) desmistificar heterogêneos respostas de células T antígeno-específicas, ou E) utilizam células antígeno-específicas para a terapia. A ferramenta baseia-se em uma partícula magnética que nós conjugado antígeno-específicas e sinais co-estimulatória de célula T, e que nós chamamos como apresentadoras artificial de células (aAPCs). Consequentemente, uma vez que a tecnologia é simples de produzir, ele pode facilmente ser adotado por outros laboratórios; assim, nosso objetivo aqui é descrever detalhadamente a fabricação e o uso subsequente da aAPCs. Nós explicamos como anexar antígeno-específicas e co-estimulatória sinais para a aAPCs, como utilizá-los para enriquecer para as células T antígeno-específicas e como expandir as células T antígeno-específicas. Além disso, destacaremos considerações com base em informações experimentais e biológicas de nossa experiência com caracterizando as células T antígeno-específicas de projeto de engenharia.

Para completar um enriquecimento sucesso e expansão das células T antígeno-específicos, o peptídeo-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias devem ser anexadas com sucesso para a partícula aAPC. Baseado nos 3 métodos de fixação de partícula, nós fornecemos alguns dados representativos para um resultado do processo de conjugação bem sucedida (Figura 5a). Com efeito, se a densidade de ligante é muito baixa, então não haverá estimulação eficaz de células T C...

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Assim, a principal vantagem da nossa nova técnica, chamamos de E plus E, que significa enriquecimento mais expansão, é que podemos enriquecer e expandir essas células, células raras específicas de antígeno, simultaneamente. Isso nos permite desenvolver um número suficiente de células que poderemos usar para investigar seu papel em diferentes cenários e em diferentes ambientes clínicos ou mesmo nos permite desenvolver agora um grande número de células que podemos utilizar para a imunoterapia de uma forma que não poderíamos antes. O método que desenvolvemos, este E plus E, pode ajudar a responder perguntas-chave na imunologia básica sobre a presença de neoepitopes.O que são neoepitopes? Esses são os epítopos personalizados que sabemos que são agora muito importantes em termos de imunoterapia contra o câncer e também dinâmicas específicas de antígenos e como esses fatores afetam os estados da doença e para uma terapia celular eficaz. As implicações dessa técnica se estendem para a imunoterapia, já que a célula de apresentação de antígeno artificial nanopartícula pode ser um produto fora da prateleira que é facilmente adaptado para respostas imunes individuais do paciente.Para gerar cé

enrich-expand-rare-antigen-specific-t-cells-with-magnetic

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Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Este vídeo descreve o enriquecimento de células T do baço de um camundongo por seleção negativa usando um separador magnético. A técnica envolve direcionar as outras células da amostra para depleção usando anticorpos ou ligantes direcionados contra antígenos específicos da superfície celular.

Enriquecimento de células T: uma técnica para isolar células T da população de células mistas por separação magnética

Este vídeo descreve um protocolo para isolar células T CD8+ específicas de antígenos raros usando células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) baseadas em nanopartículas magnéticas funcionalizadas com MHC-Igs carregados de peptídeos antigênicos e anticorpos anti-CD28. A interação dos aAPCs com células T CD8+ que expressam especificamente os receptores de células T direcionados a peptídeos antigênicos, seguida de sua expansão in vitro, resulta no enriquecimento e expansão dessa...

Enriquecimento baseado em nanopartículas e expansão de células T CD8+ específicas para antígenos

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas de magneto-plasmônica com um forte momento magnético e um (NIR) absorção forte de infravermelho próximo. O protocolo também inclui a conjugação de anticorpos para as nanopartículas, através da unidade Fc para diversas aplicações biomédicas que requerem direccionamento específico molecular.

Síntese de Immunotargeted magneto-plasmónico Nanoclusters

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Um protocolo para a síntese e catiação de magnetoferritina dopada com cobalto é apresentado, bem como um método para magnetizar rapidamente células-tronco com magnetoferritina catiônica.

Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.

Purificação e Expansão de Células T Assassinos Naturais Invariantes para Estudos In vitro e In vivo

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Aprenda a técnica E mais E para enriquecer e expandir células T antígeno-específicas raras usando nanopartículas magnéticas. Este método avança a imunoterapia personalizada e pesquisa em imunologia básica.

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

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