Name: Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprenda a isolar células de câncer de mama após reversão de apoptose usando citometria de fluxo e FACS. Este método avança o estudo da transição de células não-tronco para células-tronco semelhantes.

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Este trabalho foi financiado pela inovadora tecnologia fundo de inovação tecnologia Comissão: financiamento de apoio do estado chave laboratório de Agrobiotecnologia (CUHK), o fundo de investigação biomédica Lo Kwee-Seong e a Fundação de Hysan Lee. Y.X. foi apoiada pelo curso de pós-bolsa de estudo do CUHK.

1. preparação da mama -tronco as células cancerosas
<ol><li>Cultura MCF-7 e células MDA-MB-231 em 10 mL de vermelho de fenol-livre Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) em um prato de 100 mm. Cultura T47D em 10 mL de vermelho de fenol-livre RPMI 1640 suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% inactivadas pelo calor FBS e 1% v/v penicilina-estreptomicina (PS) em um prato de 100 mm. Células de cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de células de ar 5% CO295%. Nota: Vermelho de fenol afeta a detecção baseada em fluorescência, mas também tem uma potencial influência sobre o crescimento de células de câncer de mama devido a seus efeitos do estrogênio-tipo31. Por exemplo, vermelho de fenol poderia estimular receptores de progesterona e o crescimento de células MCF-731. Também poderia estimular o crescimento de células de T47D31.</li>
	<li>Células de lavagem com 2 mL de fosfato tampão salino (PBS) duas vezes. Adicione 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA a MCF-7 e MDA-MB-231 ou 2ml de 0,25% do trypsin-EDTA para células T47D. Nota: A concentração de tripsina-EDTA necessária para a separação de células entre tipos de células de câncer de mama diferentes variam enquanto uma concentração inadequada pode afetar o padrão de expressão de alguns marcadores de superfície celular como CD44 e CD2432.</li>
	<li>Cultura os pratos por 5 min a 37 ° C, sob uma atmosfera de ar de 95% 5% CO2. Verifique frequentemente o desprendimento das células sob o microscópio para impedir que as células da digestão excesso por tripsina-EDTA.</li>
	<li>Quando mais de 90% células desanexar, adicionar 5 mL de meio RPMI concluído ao prato e pipetá-lo sobre a superfície de camada celular várias vezes.</li>
	<li>Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 5 min. Nota: Geralmente, em torno de 6 x 106 células podem ser obtidas um prato 100 mm quando a confluência atinge 70%.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 106 células/100 μL de tampão de FACS (PBS contendo BSA de 0,5% e 0,1% de azida de sódio) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Divida as células em diversos tubos. Para as células MCF-7, dividir as células em 4 tubos: dois para o isotipo controles, um para CD24 única coloração como controle positivo CD24 e para dupla coloração.</li>
	<li>Para as células T47D, dividir as células em 3 tubos: dois para controles isotype e outro para dupla coloração.</li>
	<li>Para as células MDA-MB-231, dividir as células em 4 tubos: dois para o isotipo controles, um para CD44 única coloração como controle positivo CD44 e para dupla coloração.</li>
	<li>Centrifugar os tubos novamente a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante e em seguida, adicione o bloco Fc diluído 01:50 no buffer de FACS.</li>
	<li>Incubar as amostras no gelo por 20 min no escuro antes de centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar conjugados a fluorocromo anticorpos monoclonais contra CD44 humana (PerCP-Cy5.5) e CD24 (PE) em 01:40 e 01:10 diluições (no buffer de FACS) na dupla coloração grupos. Para controles positivos, adicionar CD44 (PerCP-Cy5.5) para MDA-MB-231 e adicionar CD24 (PE) para as células MCF-7 na mesma concentração, respectivamente. Nota: A combinação de CD44 e C24 tem sido comumente usado no peito CSC estudo26,,27,28,29,30.</li>
	<li>Para os grupos de controle do isotipo, adicionar PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ em um 01:40 diluição como o isotipo controle para anticorpos CD44 e PE Mouse IgG2a, κ em um 01:10 diluição como o isotipo controle para CD24 anticorpos em 106 células/100 μL. Nota: ISOTYPE controles para os anticorpos de interesse são recomendados como controles negativos33.</li>
	<li>Incubar as amostras (a partir de etapas 1.12 e 1.13) a 4 ° C, no escuro por 30 min. centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave o pellet duas vezes com 500 µ l de PBS e centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 0,5 mL de PBS e filtro através de uma malha de nylon de 40 µm antes de executar em um classificador fluorescência-ativado da pilha.</li>
	<li>Para fins de retenção e compensação, mancha de células MCF-7 com anticorpos anti-CD24 PE-conjugados e mancha MDA-MB-231 células com anticorpos anti-CD44 PerCP-Cy5.5-conjugados como controles positivos. Uso de células coradas com isotipo controles como controles negativos (Figura 1).</li>
	<li>Recolher pilhas com CD44–/CD24+ marcadores em tubos de fundo redondo poliestireno 12 x 75 mm, contendo 1 mL de meio de coleção (vermelho de fenol-livre RPMI 1640 suplementado com 20% inactivadas pelo calor FBS e 2% v/v PS). Centrifugar os tubos em 300 x g e RT por 5 min e descartar o sobrenadante. Nota: CSC, como células em células de câncer de mama são definidas como CD44+/CD24– células26,,27,28,29,30e -tronco células de câncer de mama são definidos como CD44–/CD24+ células18 (Figura 1).</li>
	<li>As células de câncer-tronco mama classificada a placa de cultura contendo meio de coleção fresca para mais cultura a 37 ° C 5% CO2 incubadora de cultura de células da placa.</li>
</ol>2. Apoptotic indução e deteção
<ol><li>Prepare-se 1 mM staurosporine12,34 em DMSO. Para o grupo tratado MCF-7, adicione 25 μL de 1 mM staurosporine para o médio concluído de células MCF-7 para fazer até 10 mL de volume final (2,5 μM staurosporine) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.</li>
	<li>Remover o meio de cultura de células, lave as células com 2 mL de PBS uma vez. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 2,5 μM staurosporine de células MCF-7 para 6 h de induzir apoptose quando a densidade celular atinge 70% de confluência.</li>
	<li>Prepare-se 1 mM paclitaxel35,36 em DMSO. Para o grupo tratado T47D, adicione 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM para o médio concluído de células T47D de inventar para um volume final de 10 mL (5 μM paclitaxel) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.</li>
	<li>Remover o meio de cultura de células e lave as células com 2 mL de PBS uma vez. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 5 μM de paclitaxel às células T47D para 10 h de induzir apoptose quando a densidade celular atinge 70% de confluência. Nota: O tempo de indução e a concentração de indutores que induzem a apoptose devem ser otimizados sempre que uma nova linha de celular é usada pela primeira vez.</li>
	<li>Para o grupo MCF-7 tratados com solvente, adicione 25 μL de estéril dimetilsulfóxido (DMSO) para o médio concluído de células MCF-7 de inventar para um volume final de 10 mL (ou seja, 0,25% v/v DMSO) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.</li>
	<li>Remover o meio de cultura de células MCF-7 tratadas solventes, lave uma vez com 2 mL de PBS. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 0,25% v/v DMSO para 6 h como o controle de solvente para o STS.</li>
	<li>Para o grupo T47D tratados com solvente, adicione 5 μL de DMSO estéril para o médio concluído de células T47D para completar o volume final de 10 mL (ou seja, 0,05% v/v DMSO) em um tubo cônico de 15 mL. Pipeta para misturar o conteúdo uniformemente.</li>
	<li>Remover o meio de cultura de solvente T47D células tratadas, lave uma vez com 2 mL de PBS. Em seguida, adicione a 10 mL de meio com 0,05% v/v DMSO para 10 h como o controle de solvente para paclitaxel.</li>
	<li>Para observar as alterações morfológicas das células tratadas, mancha de células com 50 nM Mitotracker vermelho CMXRos e 250 ng/mL Hoechst 33342 e incube por outro 20 min a 37 ° C, sob uma atmosfera de ar de 95% 5% CO2. Observe a morfologia de célula típica apoptotic sob um 60 x laser confocal microscópio (Figura 2). Nota: Morfologia da apoptose típico inclui encolhimento celular, blebbing membrana, fragmentação de mitocôndrias e condensação nuclear mas com membrana celular intacta12,13,14,15 ,18,37.</li>
</ol>3. isolamento de células apoptóticas e procedimento de inversão de apoptose
<ol><li>Manche tanto a apoptotic indutor e solvente-tratada MCF-7 ou T47D células com tintura de deteção de Caspase-3/7 verde 3 μM na concentração celular de 106/mL no escuro por 30 min a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO295% ar.</li>
	<li>Filtre as células através de uma malha de nylon de 40 µm antes de executar no classificador para classificação.</li>
	<li>Para fins de retenção, primeiro portão grande população (R1) e excluir os detritos através de plotagem do gráfico em pontos com dispersão para a frente e dispersão lateral (Figura 3).</li>
	<li>Use as células não tratadas sem adicionar o corante de deteção de Caspase-3/7 verde como um controle negativo para portão região negativa (R2) (Figura 3A).</li>
	<li>Use as células tratadas com staurosporine12,18,34 para 24h e corados com o corante como um controle positivo para portão região positiva (R3) (Figura 3B).</li>
	<li>Colete células positivas (R3) dos grupos tratados com indutor em tubos de fundo redondo poliestireno 12 x 75 mm, contendo 1 mL de meio de coleção (mesmo como meio de coleta na etapa 1.18) (figuras 3,C-3D). Centrifugar os tubos em 300 x g e RT por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Recolha pilhas negativas (R2) de grupos tratados com solvente em tubos de poliestireno de fundo redondo 12 × 75 mm com 1 mL de meio de coleção como na etapa 3.6 (figuras 3E-3F). Nota: Uma pequena porção de células (por exemplo, 10.000 células) pode ser recolhida e execute novamente o classificador para verificar o padrão de caspases ativo marcador. Se mais de 90% das células tratadas solvente classificadas são mostrados na região de caspase-negativo ou mais de 90% das células tratadas indutor classificadas são mostrados na região de caspase-positivo, estas células coletadas são acreditadas para ser relativamente puro (figuras 3C-3F). Caso contrário, a região de classificação e/ou o classificador deve ser reposto.</li>
	<li>Ressuspender as células classificadas no meio da coleção fresca e semente-los em placas de cultura de tecidos de 12 poços e cultura a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO295% ar durante 7 dias para a reversão de apoptose.</li>
</ol>4. a confirmação da apoptose nas caspases ativadas células
<ol><li>Mix 10 mM HEPES, 140 mM de NaCl e CaCl2 de 2,5 mM para preparar anexina-ligação tampão (pH 7,4). Armazenar o buffer a 4 ° C e evitar o buffer para expor à luz.</li>
	<li>Prepare uma solução de trabalho de 100 µ g/mL de iodeto de propidium (PI) por diluição 5 µ l da 1 mg/mL solução estoque de PI em 45 µ l de tampão de ligação anexina. Armazenar a solução a 4 ° C e evitar a solução para expor à luz. Nota: PI é um potencial mutagênico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
	<li>Prepare as células tratadas indutor como em passos 2.1 a 2.5.</li>
	<li>Recolha a MCF-7 tratados com indutor ou T47D células pipetando o médio sobre a camada de células x 3-5 para desprender as células. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g e RT 5 min. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células com médio concluído na concentração celular de 106/mL em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e manchar as células com 3 tintura de verde deteção de Caspase 3/7 μM no escuro por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g e RT por 5 min. descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Lavar as células com 1 mL de PBS gelada e de centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 5 min. descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Ressuspender as células em 100 μL de tampão, anexina-ligação com o Adicionar 5 μL do conjugado annexin V e 1 µ l de 100 µ g/mL solução de trabalho para cada 100 μL da suspensão de células de PI e incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente. Nota: Anexina V e PI são comumente usados para etiquetar pilhas apoptotic no fluxo cytometry38,39,40.</li>
	<li>Adicione 400 µ l de tampão anexina-vinculação, mistura delicadamente. Mantenha as amostras no gelo antes de executar em um citômetro de fluxo.</li>
</ol>5. medida da mama CSC células por citometria de fluxo
<ol><li>O MCF-7 invertida em ambos os grupos indutor ou solvente-tratada com tripsina-EDTA de 0,05% da colheita. Colheita de células T47D em ambos os grupos tratados indutor ou solvente ou com 0,25% do trypsin-EDTA como em passos de 1.2 a 1.5.</li>
	<li>Manchar as células com os anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromo contra CD44 humana (PerCP-Cy5.5) e CD24 (PE) como na etapa 1,12. Enquanto isso, prepare os isotipo controles como na etapa 1.13.</li>
	<li>Executar as células em um citômetro de fluxo e detectar a porcentagem de células com CD44+/CD24– marcadores.</li>
</ol>

<ol><li>McGuire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Cancer+Report+2014.+Geneva%2C+Switzerland%3A+World+Health+Organization%2C+International+Agency+for+Research+on+Cancer%2C+WHO+Press%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015.</a> Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).</li>
<li>Slamon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Geyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+plus+capecitabine+for+HER2-positive+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).</li>
<li>Cameron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+III+randomized+comparison+of+lapatinib+plus+capecitabine+versus+capecitabine+alone+in+women+with+advanced+breast+cancer+that+has+progressedon+trastuzumab%3A+updatedefficacy+andbiomarker+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).</li>
<li>Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+poisons+as+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).</li>
<li>Hertel, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antitumor+activity+of+gemcitabine+%282%27%2C2%27-difluoro-2%27-deoxycytidine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine).</a> Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NF-kappa+B%29+in+multiple+myeloma%3A+downregulation+of+NF-kappa+B+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis.</a> British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).</li>
<li>Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib%3A+proteasome+inhibition+as+an+effective+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy.</a> Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Pirozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+cancer+stem+cells%2C+epithelial-mesenchymal+transition+and+circulating+tumor+cells+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer.</a> Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).</li>
<li>Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reversibility of apoptosis in cancer cells.</a> British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Tang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+survival%2C+DNA+damage%2C+and+oncogenic+transformation+after+a+transient+and+reversible+apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).</li>
<li>Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+promotes+cell+death+of+ethanol-stressed+HeLa+cells+through+the+continuation+of+apoptosis+or+secondary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis.</a> Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).</li>
<li>Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepG2+cells+recovered+from+apoptosis+show+altered+drug+responses+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+%26+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness.</a> Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CaspaseTracker+biosensor+system+for+detecting+anastasis+and+non-apoptotic+caspase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity.</a> Scientific Reports. 5, 9015(2015).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tracking+anastasis%2C+a+cell+survival+phenomenon+that+reverses+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+reversal+promotes+cancer+stem+cell-like+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation.</a> Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).</li>
<li>Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+anastasis+in+vivo+by+CaspaseTracker+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Li, J., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+apoptosis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Caspases in apoptosis and beyond.</a> Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).</li>
<li>Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+point+of+no+return%3A+mitochondria%2C+caspases%2C+and+the+commitment+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Cioffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+distinct+population+of+CD133%28%2B%29+CXCR4%28%2B%29+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Scientific Reports. 5, 10357(2015).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+stem+cells+transition+between+epithelial+and+mesenchymal+states+reflective+of+their+normal+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).</li>
<li>Sheridan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+CD24%28-%2Flow%29%2FCD44%2B+breast+cancer-initiating+cells+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+induces+apoptosis+through+both+caspase-dependent+and+caspase-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms.</a> Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).</li>
<li>Saunders, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+in+MCF-7+breast-cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells.</a> International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).</li>
<li>Miller, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+is+BAK-dependent%2C+but+BAX+and+BIM-independent+in+breast+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor.</a> PLoS One. 8 (4), e60685(2013).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Ng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+voltage-gated+potassium+channels+in+the+fate+determination+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).</li>
<li>Lo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV3+channel+negatively+regulates+cell+cycle+progression+and+safeguards+the+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).</li>
<li>Talanian, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+caspase+family+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of caspase family proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Desiderio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fucosylation+has+a+pivotal+role+in+invasive+and+metastatic+properties+of+head+and+neck+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells.</a> Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).</li>
<li>Gupta, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+State+Transitions+Give+Rise+to+Phenotypic+Equilibrium+in+Populations+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells.</a> Cell. 146 (4), 633-644 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve uma maneira direta e clara para detectar a transição de células-tronco de câncer de mama em células da mama CSC como resultado da reversão de apoptose. Confirmação das propriedades dessas células invertida CSC poderia assistida usando eun vitro mammosphere formação do ensaio e na vivo transplante de enxerto em camundongos imunodeficientes18,24,26 ,,27<...

Câncer tem sido das principais causas de morte, causando um fardo pesado para países em todo o mundo1. Cancro da mama classifica altamente tanto em termos de incidência e mortalidade em pacientes do sexo feminino entre todos os tipos de câncer1. Devido a heterogeneidade do cancro, uma combinação de drogas é geralmente usada em quimioterapia para alcançar câncer célula morte2,3,4. No entanto, desde medicamentos quimioterápicos comuns muitas vezes alvo de5,de DNA6, dinâmica da proteína síntese7,8 e/ou microtubule9, crescendo rapidamente as células são afetadas mais enquanto células quiescentes, tais como câncer células-tronco (CSC) s são geralmente menos afetados10. CSCs são, portanto, mais chances de sobreviver após o tratamento, que leva mais tarde a resistência às drogas e câncer recaída10,11. Daí, eliminação de CSCs tornou-se um tema importante para o tratamento de câncer e estudo da origem do CSCs é necessário.
Foram realizados mais estudos sobre o fenômeno da reversão de apoptose na recente década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes do surgimento deste conceito, tem sido amplamente aceito que as células irreversivelmente passará por apoptose após a ativação de caspase. Caspases são uma família de enzimas de proteínas que desempenham um papel chave nos estágios de iniciação e execução da apoptose, incluindo a formação de complexos a apoptose e a clivagem de substratos a jusante20. Ativação de caspases carrasco como caspase 3 ou caspase 7 tem sido considerada como o "ponto sem retorno" para apoptose21. No entanto, os pesquisadores observaram recentemente que reversão de apoptose ocorre ambos in vitro e in vivo, , durante o qual células pode recuperar de apoptose, mesmo após a ativação de caspase12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Além disso, características agressivas tais como maior resistência ao indutor de apoptose original e maior capacidade de invasão são detectados no cancer inverteu as células15. Portanto, foi proposto que a percentagem de células CSC seria maior na população invertida quando comparado com as células não tratadas, eventualmente, contribuindo para as características mais malignas após reversão de apoptose18.
Anteriormente, muitos esforços foram feitos para controlar a reversão de apoptose in vitro e, mais importante, in vivo, que ajudar muito em confirmar a universalidade deste processo16,17,19. No entanto, um estudo sistemático sobre as consequências das células invertidas é insuficiente devido o isolamento insatisfatório de células que sofreram genuinamente reversão de apoptose. Há uma necessidade de adquirir pilhas apoptotic puro e recuperá-los para um estudo mais aprofundado. Assim, podemos usar o marcador tradicionalmente bem aceitado de ativação de caspase carrasco como o marcador do "ponto sem retorno"21 para apoptose e utilizar fluorescência-ativado da pilha (FACS) para discriminar caspase-ativado células manchadas de classificação com tintura de deteção de Caspase-3/7 verde. O corante é covalentemente ligado a uma sequência de aminoácidos curto, Cecilia, que pode ser reconhecida e clivada por ativas caspases 3/7. O decote ajuda a liberar a tintura, que vai translocar do citosol para o núcleo onde vincula-se ao DNA e emite forte fluorescência. Este procedimento evita o uso de uma população de células em massa em que algumas células não podem ter sofrido apoptose.
CSCs ou células de tumor-iniciando foram identificadas em muitos tumores sólidos usando um único ou uma combinação de vários marker(s) de superfície e muito poucos números destas células são suficientes para tumores de forma em camundongos imunodeficientes22,23, 24,25,26,27. Uma combinação de CD44 e CD24 tem sido comumente usada em estudos de mama CSC e CD44+/CD24– células foram definidas como o peito CSCs26,,27,28,29 , 30. recentemente, que temos realizado uma série de experimentos para confirmar a relação proposta entre apoptose reversão e CSCs e demonstrar que células de câncer de mama invertida ganharam maior capacidade de formação de tumor in vitro e in vivo com um elevada percentagem de células com CSC marcadores18. Embora nós não poderia excluir a possibilidade de que mama CSCs sobrevivem melhores e, assim, obter enriquecidas após a reversão de apoptose, importante, quando podemos isolar as células-tronco cancerosas e assunto para reversão de apoptose, CSC sairá no originalmente-tronco população de células de câncer, sugerindo que Stema câncer células podem contribuir para o aumento da percentagem de CSCs durante reversão de apoptose.
Este artigo tem como objetivo demonstrar a transição de células-tronco de câncer de mama para CSC células da mama após a reversão de apoptose e para detectar esta transição por citometria de fluxo. As células-tronco de câncer de mama são inicialmente preparadas isolando CD44–/CD24+ de mama células cancerosas por FACS. Em seguida, apoptose é induzida e confirmado por mudanças morfológicas sob o microscópio. Depois, pilhas apoptotic positivamente rotulados pelo corante verde deteção de Caspase 3/7 são isoladas por FACS e mais cultivadas na ausência de indutores de apoptose para reversão de apoptose. As células invertidas então estão manchadas com marcadores de CSC após 7 dias de recuperação para análise de fluxo cytometric. Células com CD44+/CD24 marcadores– re-aparecem na população invertida, sugerindo que transição de células-tronco cancerosas para CSC células ocorreu durante a reversão de apoptose.
Reversão de apoptose tem sido observada em câncer múltiplo linhas celulares, bem como as células primárias normais tratados com apoptotic diferentes estímulos em vitro12,13. Este processo também foi rastreado em Drosophila modelo in vivo de16,17,19. Muita informação sobre o mecanismo subjacente de recidiva de câncer em modelos de câncer de diferentes doenças e a origem do CSCs pode ser obtida através do uso da técnica, conforme descrito neste manuscrito.

<table><tbody><tr><td>MCF-7 Coleção de</td><td>Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td> <td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td> <td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td> <td>HTB-133</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > Reagente < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 anexina V conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 corante fluorescente verde</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc bloco</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td> HEPES <td>inativado por calor</td></tr><tr><td></td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td> Anticorpos monoclonais <td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>contra CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>humano 555428</td><td>PE Clone:ML5 Lote:5049759 RRID:AB_395822</td></tr><tr><td>anticorpos monoclonais contra CD44 BD Biosciences humano</td><td></td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lote:7230770 RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse IgG2a, &kappa; Controle de Isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Camundongo IgG2b, &kappa; Controle de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone: 27-35 RRID:</td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td> de AB_647257 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>iodeto de propídio</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 meio</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>fenol azida sódica sem vermelho</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Placa</td> de cultura de estaurosporina S2002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &mu; m malha de nylon</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite pacote de software v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X objetiva</td></tr><tr><td>FV10-ASW Software visualizador Ver.4.2b</td> Olympus-poliestireno <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de fundo redondo 12 &vezes; Tubos de 75 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>S3e classificador</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

fluxo cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Recorrência de câncer há muito tempo tem sido estudada por oncologistas, enquanto os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Recentemente, nós e os outros encontraram que um fenômeno chamado apoptose inversão leva a aumentada tumorigenicidade em vários modelos de célula sob diferentes estímulos. Estudos anteriores concentraram-se em localizar este processo in vitro e in vivo; no entanto, o isolamento de células real invertidas ainda tem de ser alcançado, que limita a nossa compreensão sobre as consequências da inversão de apoptose. Aqui, aproveitamos uma tintura de deteção de Caspase-3/7 verde para células de rótulo com caspases ativadas após a indução da apoptose. Células com sinais positivos são mais separadas por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação para a recuperação. Análise morfológica sob microscopia confocal ajuda a confirmar o status de apoptotic antes FACS. Um aumento de tumorigenicidade muitas vezes pode ser atribuído à elevação no percentual de câncer células-tronco (CSC)-como as células. Também, dada a heterogeneidade do cancro da mama, identificando a origem dessas células CSC-como seria fundamental para o tratamento do câncer. Assim, nos preparamos células-tronco de câncer de mama antes de desencadear a apoptose, isolando células caspase-ativado e executar o procedimento de reversão de apoptose. Análise de citometria de fluxo revela que células de mama CSC-como voltar a aparecer no grupo invertido, indicando células da mama-CSC são transitadas de células-tronco de câncer de mama durante a reversão de apoptose. Em resumo, este protocolo inclui o isolamento de células de câncer de mama apoptotic e detecção de mudanças na percentagem de CSC em células invertidas por citometria de fluxo.

Fim de observar a transição do peito-tronco células de câncer de mama CSC células, uma primeira classificação do CD44–/CD24+ células de câncer de mama eram necessários. Para a linhagem de células MCF-7, que tem cerca de 0,15% células com marcadores de CSC na população original (Figura 1), esta etapa ajudou exclui a possibilidade de enriquecimento do CSC durante reversão de apoptose. Pelo contrário, se não houvesse nenhuma célula com marc...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar células de câncer de mama apoptotic classificando fluorescência-ativado da pilha e detectar ainda mais a transição de células-tronco de câncer de mama para células de células-tronco, como câncer de mama após a reversão de apoptose por citometria de fluxo.

Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Os isolamentos de populações genuínas de células de reversão apoptótica tem sido um problema anteriormente, o que limita muito nossa compreensão sobre as consequências da reversão da apoptose. Este protocolo nos permite gerar populações mais puras de células de reversão apoptótica. A principal vantagem dessa técnica é que os materiais e equipamentos utilizados estão amplamente disponíveis em diferentes instituições.Esta técnica é prontamente aplicável para isolar uma população mais pura de células que sofreram reversão da apoptose. Como relatado anteriormente, as células normais também podem passar por reversão da apoptose, que além das células cancerígenas de mama, diferentes células de quimioterapia, bem como células normais, podem ser iniciadas e os vários estímulos apoptóticos podem ser usados. Como a célula de reversão passou por apoptose e triagem rápida, a taxa de recuperação geralmente é baixa.Um número de célula inicial maior é recombinante para aumentar o rendimento final. Para começar, cultura MCF-7, MDA-MB-231, Para começar, cultura MCF-7, MDA-MB-231 e células T47D, de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, lave as células com PBS duas vezes, depois adicione dois mililitros de 0,05% trypsin-EDTA de 0,05% trypsin-EDTA ao MCF-7, e células MDA-MB-231, para as células MCF-7 e MDA-MB-231, e dois mililitros de 0,25% trypsin-EDTA e dois mililitros de 0,25% trypsin-EDTA para as células T47D.para as células T47D. Cultue as células por cinco minutos a 37 graus Celsius, em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono de 5%. Enquanto as células incubam, verifique o desprendimento das células com um microscópio para evitar a super digestão por trippsina-EDTA.Quando mais de 90% das células se desprenderem, adicione cinco mililitros de meio RPMI completo ao prato, e pipeta-o sobre a superfície da camada celular várias vezes. Em seguida, transfira as células para tubos cônicos de 15 mililitros e centrífuga. Descarte o supernatante e suspenda as pelotas com tampão FACS em tubos microcentrífugas de 1,5 mililitro.Em seguida, divida as células em vários tubos. Centrifugar os tubos mais uma vez, e descartar o supernatante. Em seguida, adicione bloco fc diluído às amostras.Incubar as amostras no gelo no escuro por 20 minutos, antes de centrifugar as amostras novamente. Depois disso, descarte o supernaspe. Em seguida, adicione anticorpos monoclonais fluorocromáticos conjugados contra CD44 humanos, cd24, contra CD44 humano, e CD24, em um a 40, e de uma a 10 diluições, respectivamente, aos grupos de coloração dupla.Para os controles positivos, adicione anticorpos CD44 Para os controles positivos, adicione anticorpos CD44 às células MDA-MB-231, às células MDA-MB-231 e anticorpos CD24 às células MCF-7 e anticorpos CD24 às células MCF-7 em uma a 40, e de um a 10 diluições, respectivamente. Adicionar PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Adicionar PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, diluído a uma proporção de um a 40 para células como um controle de isótopos para anticorpos CD44. Em seguida, adicione PE Mouse IgG2a Kappa, Em seguida, adicione PE Mouse IgG2a Kappa, diluído em uma proporção de um a 10 para as células como um controle de isótopos para anticorpos CD24.Incubar as amostras a 4 graus Celsius no escuro por 30 minutos. Em seguida, centrifugar as amostras a 300 g's Then, centrifugar as amostras a 300 g's e quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e lave a pelota duas vezes em 500 micro litros de PBS.Em seguida, repita a centrifugação como descrito anteriormente. Suspenda a pelota em 0,5 mililitros de PBS e filtre a suspensão através de uma malha de nylon de 40 micrômetros. Em seguida, execute a suspensão através de um classificador celular ativado por fluorescência.Colete as células com marcadores negativos CD44 e CD24 positivos em tubos de fundo redondo contendo um mililitro de meio de coleta. Em seguida, centrifugar os tubos, e descartar o supernasal. Em seguida, emplaque as células cancerígenas de mama classificadas em um prato de cultura contendo meio de coleta fresco para mais cultura.Primeiro, use uma staurosporina milimila em DMSO, para preparar 2,5 micro-molares de staurosporina em médio, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, remova o meio de cultura das células. Lave as células com dois mililitros de PBS uma vez, depois disso, adicione 10 mililitros do meio de estaurosporina às células MSF-7 por seis horas, para induzir apoptose, quando as células são 70% confluentes.Em seguida, prepare um paclitaxel milimão no DMSO. Em seguida, adicione 12,5 micro litros Em seguida, adicione 12,5 micro litros do paclitaxel de 1 milimolar ao meio completo das células T47D para compor um volume final de 10 mililitros em um tubo cônico de 15 mililitros. Remova o meio de cultura das células e lave as células com 2 mililitros de PBS.Em seguida, adicione o meio paclitaxel às células por 10 horas para induzir apoptose por 10 horas para induzir apoptose quando as células atingirem 70% de confluência. Depois disso, remova o meio do grupo MCF-7 tratado com solventes e lave-os com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,25% de média DMSO Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,25% de média DMSO por seis horas como o controle de solvente para staurosporina.Remova o meio de cultura do grupo T47D tratado com solventes e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,05% de meio DMSO Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,05% de média DMSO por 10 horas como o controle de solvente para paclitaxel. Em seguida, manche a célula e incuba-as por 20 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%.Use um microscópio de varredura a laser confocal 60 vezes para observar as alterações morfológicas das células tratadas. Colora as células MCF-7 e T47D tratadas com solventes e as células MCF-7 e T47D tratadas com solventes no escuro por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Utilizando o classificador celular ativado pela fluorescência, colete as células positivas dos grupos tratados com indutores em tubos de fundo redondo contendo um mililitro de meio de coleta.Em seguida, centrifugar os tubos como descrito anteriormente, e descartar o supernatante. Colete as células negativas dos grupos tratados com solventes em tubos de fundo redondo com um mililitro de meio de coleta. Centrifugar os tubos, e descartar o supernaspeso.Depois disso, suspenda as células classificadas em meio de coleta fresca. Semear as células em placas de cultura tecidual de 12 poços, e cultuá-las por sete dias para reversão da apoptose. Colher o MCF-7 invertido em grupos indutores e tratados com solventes com 0,05% de trypsin-EDTA.com 0,05% de trypsin-EDTA. Em seguida, colher as células T47D em ambos os indutores, em seguida, colher as células T47D em grupos indutores e tratados com solventes com 0,25% de trypsin-EDTA. Manche as células com anticorpos monoclonais conjugados fluorocromáticos contra CD44 humanos e CD24.Enquanto as células mancham, prepare os controles do isótipo como demonstrado anteriormente. Finalmente, execute as células em um citômetro de fluxo e detecte a porcentagem de células com marcadores negativos CD44 e CD24 negativos. Neste protocolo, observou-se a transição de células cancerígenas não-tronco de mama para células semelhantes a CSC de mama.O isolamento de células cancerígenas não-tronco foi feito pela primeira vez em células MCF-7. Alterações morfológicas típicas foram observadas após a adição de indutores apoptóticos, e as células recuperadas da apoptose com morfologia semelhante após a retirada de medicamentos. As células ativadas pelo caspace foram rotuladas e classificadas com base em sua maior intensidade fluorescense do que as células sem ativação do caspace.Durante o processo de indução apoptótica, o solvente foi utilizado para excluir a possibilidade de que o procedimento dos fatos, ou o próprio solvente, fosse a causa da transição. Células ativadas pelo caspace nos grupos de tratamento apoptótico-indutor foram encontradas como sendo um nexin cinco positivo e pi negativo, sugerindo que eram células apoptóticas. As células apoptóticas foram coletadas e cultivadas para recuperação, em comparação com os grupos tratados com solventes, a análise citométrica do fluxo mostrou que havia células aparecendo no quadrante negativo CD44 e CD24 na população inversa originalmente de células cancerígenas não-tronco de mama.A mordaça é importante na análise de fluxo e na triagem celular, que o controle suficiente deve ser preparado nos laboratórios. Uma vez que esse procedimento de reversão in vitro da apoptose isola células cancerígenas puras apoptóticas, experimentos como ativos in vivo tumorigênese podem ser realizados para entender as consequências do real reverso das células. Essa técnica esclarece a causa da recaída do câncer, portanto, pode ser investigada para potencialmente prevenir a recorrência em pacientes com câncer.Por favor, lembre-se de se proteger adequadamente ao realizar experimentos de cultura celular de acordo com as regulamentações de nível biossegurança em sua instituição.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de uma subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço usando classificador de células ativadas por fluorescência ou FACS. A população lateral isolada de células pode ser usada para análises posteriores a jusante.

Ensaio de discriminação da população do lado do câncer: um método para isolar células-tronco cancerígenas usando o ensaio de efluxo de corante Hoechst

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Compreender o papel das células-tronco cancerígenas na recorrência tumoral e na resistência às terapias tornou-se um tópico de grande interesse na última década. Este artigo descreve o isolamento e a caracterização da subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (CECP).

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Métodos que permitem a caracterização e isolamento de populações de células estaminais a partir de amostras biológicas são fundamentais para o avanço de células-tronco-alvo tratamentos em câncer e além. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células estaminais do câncer usando o fenótipo de população lateral desencadeada por corante.

Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

O objetivo dessa metodologia é identificar células-tronco cancerígenas (CSC) em linhas de células cancerosas e amostras primárias de tumor humano com o protocolo de formação da esfera, de forma robusta, utilizando ensaios funcionais e caracterização phenotípica com citometria de fluxo e ocidental Borrão.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

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Usamos a coloração de proliferação celular para identificar células quiescentes no modelo de leucemia linfoblástica aguda T de peixe-zebra. A coloração é retida em células que não se dividem e reduzida durante a proliferação celular, permitindo a seleção de células dormentes para interrogação posterior. Este protocolo fornece uma ferramenta funcional para estudar a auto-renovação no contexto da quiescência celular.

Identificação de células quiescentes em um modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de peixe-zebra usando coloração de proliferação celular 

Este protocolo descreve o método para configurar o ensaio de formação da mamosfera para estudar a estano do câncer induzida pelo Inibidor da Apoptose 5 (Api5) em células epiteliais mamárias não tumorigênicas. Lisados coletados de mamosferas de geração primária são analisados para diferentes marcadores de caule para avaliar a indução de propriedades semelhantes às células-tronco.

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Aprenda a isolar células de câncer de mama após reversão de apoptose usando citometria de fluxo e FACS. Este método avança o estudo da transição de células não-tronco para células-tronco semelhantes.

Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

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