Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Este método pode ajudar a melhorar a caracterização em larga escala e de alta resolução de isoformas proteicos e modificações pós-translacionais de proteínas nas células. A principal vantagem desta técnica é que a espectrometria de massa da zona capilar oferece separação altamente eficiente e detecção altamente sensível de proteínas intactas. Para pré-tratar o capilar, seque-o com gás nitrogênio a 10 psi por pelo menos 12 horas.

Em seguida, encha o capilar com 50% de volume por volume 3-propyl methacrilato em metanol usando uma bomba de seringa. Sele as duas extremidades do capilar com borracha de sílica. Depois de incubar à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas, continue com um revestimento linear de poliacrilamida na parede interna do capilar de separação, conforme descrito no protocolo de texto.

Queime uma parte do capilar usando uma chama suave para remover o revestimento externo da poliamida em torno de quatro centímetros de distância de uma extremidade do capilar. Limpe suavemente a porção queimada do capilar limpando para remover completamente o revestimento de poliamida. Faça um pequeno furo no final de um tubo de 200 microliter em torno do mesmo tamanho do diâmetro externo capilar para segurar suficientemente o capilar no lugar uma vez que ele é roscado através deste buraco.

Rosqueie a extremidade do capilar que está perto da porção queimada através do orifício até que a porção queimada esteja no tubo. Em seguida, adicione aproximadamente 150 microliters de HF ao tubo de 200 microliteres de modo que a solução HF esteja cerca de metade da porção queimada no capilar. Incubar o capilar na solução HF à temperatura ambiente por 90 a 100 minutos.

Prepare a mistura de proteína padrão e a amostra de E.coli, conforme descrito no protocolo de texto. Para configurar a eletroforese da zona capilar, ou sistema CZE, carregue a amostra, o eletrólito de fundo e o capilar de separação no amostrador automático CZE. Selecione a carga de amostra na página de controle manual do amostrador automático CZE.

Carregue o frasco de eletrólito de fundo na bandeja tampão do amostrador automático, observando sua posição na bandeja de buffer. Em seguida, carregue o frasco de amostra na bandeja de amostra do amostrador automático, observando sua posição na bandeja de amostra. Coloque o amostrador automático na posição de alinhamento usando o controle manual.

Agora, carregue o capilar de separação no amostrador automático CZE usando a extremidade não gravada do capilar. Ajuste a altura da extremidade de injeção do capilar se o volume amostral for inferior a 50 microliters. Troque o amostrador automático para ficar em espera usando o controle manual.

Digite a posição da amostra no sistema e mova o capilar para a amostra. Empurre a extremidade da injeção do capilar mais para baixo para chegar ao fundo do frasco amostral. Continuando a usar o controle manual, lave o capilar com o eletrólito de fundo por 20 minutos usando uma pressão de 20 psi.

Agora, monte uma interface comercial de fluxo de baia eletrokinetticamente bombeada para a frente do espectrômetro de massa. Encha o reservatório tampão da baia com um tampão contendo metanol de volume de 10% e ácido fórmico de volume de volume de 0,2% na água de grau LCMS. Lave o T na interface com o tampão da baia através da aplicação manual da pressão com uma seringa.

Rosqueie a extremidade de um milímetro de diâmetro externo de um emissor de eletrospray através de uma tubulação de manga e conecte o emissor com uma porta do T através de um encaixe. Basta lavar o T manualmente novamente com uma seringa para encher o emissor com o tampão de bainha. Ajuste a distância entre o orifício do emissor e a entrada do espectrômetro de massa para aproximadamente dois milímetros com a ajuda da câmera que veio com a interface.

Aplique uma tensão de dois a 2,2 quilovolt no frasco tampão da baia para eletrospray. Em seguida, ajuste a tensão do spray para alcançar um eletrospray estável. Aplique uma baixa pressão na extremidade da injeção do capilar durante este processo para garantir que não haja bolhas no capilar.

Desligue a tensão do spray e rosque suavemente a extremidade gravada do capilar de separação através do T no emissor até que não possa ser empurrado ainda mais. Depois de parar a baixa pressão na extremidade da injeção do capilar, lave o emissor um pouco com tampão de bainha. Novamente, aplique dois a 2,2 quilovolts de tensão de pulverização para testar o spray.

Selecione novo método no menu suspenso do arquivo na tela principal do instrumento. Lá, selecione a entrada como frasco de amostra inicial, frasco de amostra final, bandeja como amostra, pressão como cinco psi, kilovolts como zero e duração como 95 segundos para uma injeção de amostra. Em seguida, coloque a entrada como frasco de entrada, bandeja como tampão, pressão como zero psi, kilovolts como 30, e duração como 4.200 segundos para a separação da amostra padrão da mistura de proteínas.

Para a separação da amostra proteome E.coli, coloque a entrada como frasco de entrada, bandeja como tampão, pressão como zero psi, kilovolts como 20, e duração como 6.600 segundos. Por fim, selecione a entrada como frasco de entrada, bandeja como tampão, pressão como 10 psi, kilovolts como 30 e duração de 600 segundos para descarga capilar. Agora, configure os parâmetros de MS e MS/MS para análise de proteínas intactas usando um espectrômetro de máscara de trap de íons quádruplos.

Para ajustar as configurações do arquivo de sintonia, ligue o modo de proteína intacta e use uma pressão de trapping de 0.2. Defina a temperatura capilar de transferência de íons para 320 graus Celsius e o nível RF da lente S para 55. Para realizar o experimento CZE MS/MS, inicie o método de aquisição de dados no computador espectrômetro de massa, primeiro selecionando a sequência de execução.

Em seguida, inicie a sequência de eletroforese capilar no computador de eletrofose capilar. Realize uma pesquisa de banco de dados com TopPIC no conjunto TopPIC e na interface gráfica TopPIC. Clique no arquivo do banco de dados e selecione um banco de dados apropriado para pesquisa.

Clique no arquivo de espectro e selecione o ms2 gerado. msalign arquivo gerado como a entrada. Selecione o arquivo de recurso MS1 e escolha o arquivo de recurso gerado.

Defina cisteína carbamidomeethyl C57 como uma modificação fixa devido ao tratamento da iodoacetamida. Selecione o recurso de banco de dados chamariz e, em configurações de corte, selecione taxa de detecção falsa no menu suspenso próximo ao nível de espectro. Defina a taxa de detecção falsa para 0,01 no nível de espectro.

Deixar a função de geração não eleita e definir a tolerância ao erro para 15 partes por milhão. Defina a taxa de detecção falsa para 0,05 no nível proteoforme. Em parâmetros avançados, selecione dois para o número máximo de mudanças de massa no menu suspenso.

Defina a mudança de massa máxima de modificações desconhecidas para 500 daltons. Deixe todos os outros parâmetros em seus valores padrão e clique no botão iniciar no canto inferior direito da interface gráfica do usuário. O eletroferograma representativo para a mistura de proteína padrão é mostrado.

A mistura de proteína padrão é normalmente executada pelo menos em duplicata para avaliar a eficiência de separação e a reprodutibilidade do sistema. A eficiência da separação pode ser avaliada com o número de placas teóricas de algumas proteínas. A reprodutibilidade pode ser avaliada pelos desvios padrão relativos da intensidade proteica e do tempo de migração.

A plataforma CZE MS/MS pode ser usada para caracterização em larga escala de proteoforms em vários proteomes complexos, identificando mais de 500 proteoformes e 190 proteínas de um proteome E.coli em uma única corrida com alta confiança. Aqui, um zoom em vista do eletroferograma pode ser usado para avaliar a janela de separação do sistema. O muito baixo valor E e espectral FDR sugere a alta confiança do ID proteoform.O alto número de íons de fragmentos combinados indica ainda a alta confiança do ID.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de enfiar o capilar de separação gravado no emissor de eletropray lentamente e suavemente.

A rotulagem estável de isótopos ou métodos sem rótulos podem ser incorporados ao procedimento CZE MS para determinar como a abundância de proteoformes muda nas células em várias condições. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da proteômica de cima para baixo explorarem os papéis dos proteoformes na regulação de diversos processos biológicos nas células. Não se esqueça que trabalhar com ácido fluorídrico pode ser extremamente perigoso e precauções como equipamentos de proteção individual adequados e ter procedimentos de emergência em vigor devem ser sempre tomadas na realização deste procedimento.