Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do biopesticida, como como a expressão genética de impacto do RNA de vertente dupla e a fecundidade em dipteranos adultos. A principal vantagem desta técnica é que doses quantificáveis de RNA de dupla cadeia são entregues ao mosquito ou mosca, e os efeitos resultantes da letalidade multigeracional podem então ser avaliados. Embora este método seja apresentado para o mosquito, o Aedes aegypti, e a mosca da casa, musca domestica, também pode ser aplicado a outras espécies de mosquitos e moscas.

Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, porque dominar o procedimento de injeção em si é um investimento temporal. Injetar cada inseto com o tamanho ideal da ponta da agulha é fundamental para garantir o parto, minimizando a lesão e a mortalidade. Para começar, use fórceps para estágio cuidadoso de mosquitos para que eles sejam eventualmente expostos em um deslizamento de microscópio a aproximadamente meio centímetro de distância.

Para ajudar no manuseio do slide, deixe um espaço de um centímetro e meio na extremidade esquerda ou direita do slide. Em seguida, coloque o slide de insetos encenados a quatro graus Celsius em uma grande placa de petri. Configure um microscópio dissecando e microinjetor sobre uma mesa de frio.

Depois de puxar capilares de vidro para uma ponta fina, coloque a agulha capilar no microinjetor e quebre a ponta da agulha com fórceps. Em seguida, enxágue a agulha desenhando e expulsando a água livre nuclease três vezes. Note que os tamanhos de abertura da agulha de vidro variam entre mosquitos e moscas da casa.

Em seguida, prepare uma solução de injeção com uma concentração adequada para mosquitos. Adicione três microgramas por mililitro de Rhodamine B à solução para ajudar na visualização. Use uma pipeta para transferir de três a quatro microliters de solução para uma superfície limpa, e desenhe-a para dentro da agulha de vidro sem tomar ar.

Pressione o botão de injeção repetidamente até que o líquido comece a dispensar da agulha. Use um marcador de ponto ultra fino para desenhar marcas de hash a cerca de um milímetro de distância, desde o menisco líquido até a haste da agulha. Coloque o slide dos mosquitos sob a agulha e certifique-se de que o campo de visão é largo o suficiente para ver a solução menisco na agulha.

Alinhe a agulha com o meio de um terço do esterno mesocarape. Prepare o mosquito contra a agulha com fórceps colocados no lado oposto do mosquito, e perfure suavemente a cutícula com a ponta da agulha. Deslize suavemente a agulha para dentro do mosquito até que a ponta passe pela linha média.

Pressione o botão de injeção até que a quantidade desejada de líquido tenha sido injetada. Se o menisco não se mover, deslize lentamente o mosquito ou voe da agulha enquanto observa o movimento do menisco. Se uma parte da solução injetada sair da cutícula após a remoção da agulha, ou se o menisco não se mover, descarte o inseto, pois a injeção não foi bem sucedida.

Na mosca da casa, alinhe a agulha com o mesopleuron. Prepare a mosca contra a agulha com fórceps colocados no lado oposto da mosca, e perfure suavemente a cutícula com a ponta da agulha. Transfira os insetos injetados para limpar copos de 3,5 onças em grupos de 10 a 15.

Em seguida, cubra o copo com rede e deixe-os se recuperar em temperatura ambiente. Depois que os insetos se recuperarem, inverta o copo de retenção sobre uma bola de algodão encharcada em solução de 10% de sacarose. Primeiro, encha uma membrana artificial de 12 polegadas com sangue fresco, e aqueça-a a 60 graus Celsius em um banho de água quente.

Seque a membrana com uma toalha de papel e coloque-a sobre a tampa da rede do copo de retenção. Após a alimentação dos mosquitos, substitua a bola de algodão e deixe os mosquitos descansarem por 24 horas. Em seguida, construa copos de oviposição preenchendo copos de bio acetato claros de 3,5 onças com aproximadamente 30 milímetros de água deionizada.

Em seguida, coloque um pedaço de papel de germinação de sementes na parte inferior do copo. Cubra o copo com a rede e corte uma pequena fenda na tampa da rede. 24 horas após a alimentação, corte uma pequena fenda na tampa do copo de retenção e transfira as fêmeas que se alimentaram com sucesso de copos de oviposição.

Em seguida, sele a pequena fenda na tampa de oviposition com uma bola de algodão saturada de 10% de sacarose. Monitore os mosquitos e rastreie a mortalidade diária. Depois de permitir que os mosquitos oviposit por cinco a sete dias, conte os ovos sob um microscópio dissecando.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Christopher Geden, um entomologista de pesquisa da USDA ARS. Três dias após a injeção, anestesiar as moscas com dióxido de carbono. Em seguida, transfira as moscas para uma gaiola limpa com água e prepare a dieta de moscas.

Regissuir dados de mortalidade e remover moscas mortas diariamente. Em seguida, misture 75% de farelo de trigo com 25% de ração ao vivo pelleted em peso para preparar o meio de criação larval. Adicione água à mistura até que 62% de umidade seja alcançada.

Adicione a mistura de ração de farelo de trigo umedecida ao vivo a um quadrado de pano preto, e enrole-o em uma bola. Use um elástico para manter o pano no lugar e aperte suavemente até que o meio líquido se escoasse. Coloque a bola em um copo de 60 mililitros, e coloque-a na gaiola por cinco horas.

Depois disso, enxágue os ovos da bola, garantindo que os ovos sejam removidos sob as dobras do pano. Agite os ovos para interromper quaisquer aglomerados, e transfira-os para um tubo de centrífuga graduado de 20 mililitros. Deixe os ovos se acalmarem e observe o volume de ovos assentados no tubo.

Em seguida, adicione água suficiente para levar o volume a 20 vezes o volume dos ovos assentados. Em seguida, use uma barra de mexiça magnética para misturar a água e a suspensão do ovo. Por fim, use uma ponta de pipeta modificada para distribuir 0,5 mililitros da suspensão em um pedaço de pano preto pré-umedecido em uma série de linhas.

Neste protocolo, os mosquitos fêmeas foram micro-injetados para avaliar a expressão genética. A injeção de fêmeas com RNA de dois fios mostrou redução significativa na expressão relativa em vários ciclos de oviposição. Os tamanhos médios de embreagem em mosquitos no primeiro ciclo gonotrófico foram significativamente reduzidos para os grupos tratados dsRPS6 e dsRPL26.

Um efeito de dose óbvio foi observado em tamanhos de embreagem ao injetar dsRPS6 de um micrograma a 50 nanogramas em mosquitos fêmeas. Moscas da casa também foram injetadas com cinco microgramas de construções de RNA de dois fios. Semelhante às observações do mosquito, observou-se redução significativa tanto na expressão da transcrição específica quanto no tamanho da embreagem.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de descartar insetos que não foram injetados com sucesso. Usando este procedimento, qualquer construção de RNA de dois fios ou outras biorationais pode ser entregue a mosquitos ou moscas. Não se esqueça que trabalhar com agulhas de vidro pode ser perigoso, e eles devem ser sempre descartados em recipientes de resíduos afiados apropriados.