Name: Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a localizar o locus coeruleus em cortes de cérebro de rato usando imunohistoquímica e marcadores anatômicos. Este método permite analisar proteínas e níveis de cobre para estudar distúrbios neurológicos.

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Agradecemos a Abigael Muchenditsi para a manutenção da colônia do mouse. Uso da fonte de fótons avançada no Argonne National Laboratory foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de base energia Ciências, sob o número do contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt para assistência na fonte de fótons avançada e suporte ao usuário. Este trabalho foi financiado pelo 2R01GM101502 de concessão Instituto Nacional de saúde para SL.

Estudos dos animais foi aprovado pela Johns Hopkins University Cuidado Animal e uso (ACUC) protocolo número M017M385.
1. o cérebro de corte
<ol><li>Para imobilizar, anestesia os ratos através da aplicação de 3% de isoflurano.<ol>
<li>Embeber uma bola de algodão com gotas de isoflurano e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora de 15 mL. Coloque o nariz do animal no tubo e permitir que inalar o isoflurano. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao dedo do pé-pitada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o animal em suas costas e imobilizá-lo fixando suas extremidades para baixo com um pino de T, tendo acesso ao seu abdômen.</li>
	<li>Cortar o animal com uma tesoura cirúrgica, fazendo um recorte da pele abdominal e cortar a pele na região do tórax. Segure a pele usando pinos T. Em seguida, quebre a membrana peritoneal até o tórax. Expor o coração de rachamento da cavidade torácica e o diafragma de corte.</li>
	<li>Corte a aurícula direita para permitir que o sangue flua para fora do animal. Introduza uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 25 no ventrículo esquerdo e perfundir com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS). Nota: Isto permite que a solução a fluir através da circulação sistêmica e saída através do átrio direito.</li>
	<li>Remova a seringa de 10 mL e inserir uma agulha de calibre 25 anexada para a seringa de 60 mL. Perfundir através do ventrículo esquerdo com 50 mL de paraformaldeído de 4% frio gelo (PFA).<ol>
<li>Preparar solução PFA 4% fria gelo diluir 10% solução PFA em H2O e refrigeração da solução final de PFA de 4% a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolar a cabeça do rato e remover o cérebro do crânio.<ol>
<li>Cortar a pele do pescoço e em seguida, corte em direção aos olhos para expor o crânio. Rachar o crânio do pescoço ao nariz e depois de um olho para o outro. Descasque o crânio para fora e excisar o cérebro todo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar o cérebro em 4% PFA por 24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi o cérebro com pinças em um tubo cônico de 50 mL, preenchido com 25 mL de solução de sacarose de 30%. Manter a 4 ° C, durante 48-72 h até que o cérebro afunda até o fundo do tubo.</li>
	<li>Corte o cérebro com um cortador de cérebro de rato adulto coronal de matriz através do mesencéfalo (~ 3 mm posterior de bregma). Manter a seção do cérebro que contém o tronco cerebral. Nota: Isto irá resultar em duas seções do cérebro – contendo mais de córtex (anterior do corte) e contenha o tronco cerebral/cerebelo (posterior do corte). Use a seção de tronco cerebral para as etapas seguintes.</li>
	<li>Incorporar a secção do tronco encefálico com superfície de corte colocada no fundo de um molde de encastre, rodeado pela temperatura ideal corte composta (OCT); mover o cérebro incorporado para um freezer-80 ° C e congele pelo menos 12 h – até utilização posterior.</li>
	<li>Corte no criostato: lugar da incorporação do molde que contém o cérebro na OCT em criostato; -incube em criostato por várias horas ajustar a temperatura do bloco de cérebro do criostato.</li>
	<li>Descasca o molde incorporação para expor o OCT bloco que contém o cérebro.</li>
	<li>Use lâminas de barbear para remover o excesso de PTU da superfície do bloco sem tocar o cérebro.</li>
	<li>Monte o bloco OCT na bucha do criostato, expondo a superfície de corte do cérebro para a frente.</li>
	<li>Ajuste a superfície de corte do cérebro para que ele é orientado em paralelo com as lâminas do criostato.</li>
	<li>Apare o cérebro começando a medula, 100 µm de seções de corte rostral.</li>
	<li>Corte rostral até o cerebelo e tronco encefálico cortada como uma fatia contínua. Começa a colecionar fatias de 50 µm de espessura. Nota: Como um apara rostral da medula, do tronco encefálico e cerebelo cortará como duas seções separadas. Nas seções rostrais, o tronco cerebral e cerebelo irão eventualmente fundir-se ao nível do ventrículo 4th . Uma vez que as bordas laterais do ventrículo 4th são bem-formados, depois o cerebelo e o tronco encefálico vão sair como uma fatia contínua.<ol>
<li>Coletar o cérebro OCT-cercado fatia com fórceps e colocá-lo em um poço de uma placa de 24 preenchido com PBS (Figura 2a). A LC será mais proeminente quando o cerebelo e o colículo inferior encontrar um ao outro no ~-5.52 mm posterior de bregma (Figura 1b). Nota: A parte mais anterior da LC desaparecerão assim que o cerebelo tem sido totalmente seccionado e já não envolve o colículo inferior no ~-5.34 mm posterior de bregma (Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. imuno-histoquímica para dopamina β-hidroxilase ou Tirosina Hidroxilase (Figura 2)
<ol><li>Dia 1<ol>
<li>Lave as fatias selecionadas três vezes por 5 min em PBS.</li>
		<li>Permeabilize para 24h em solução salina tamponada fosfato de 0,5% com detergente (PBSD) a 4 ° C.<ol>
<li>Dilua 125 µ l de detergente em 25 mL de PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 2<ol>
<li>Lave as fatias três vezes por 5 min em 0,5% PBSD.</li>
		<li>Adicione o anticorpo primário, anti-DAP ou anti-TH para 18 h, a uma diluição de 1: 500 em 0,5% PBSD a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 3<ol>
<li>Lave as fatias três vezes por 10 min em 0,5% PBSD.</li>
		<li>Adicione o anticorpo secundário desejado (488 burro anticoelho para fluorescência verde) a uma diluição de 1: 1000 em 0,5% PBSD para 16 h.</li>
		<li>Embrulhe o prato bem 24 em alumínio e lugar a 4 ° C.</li>
		<li>Lave as fatias três vezes por 5 min em 0,5% PBSD.</li>
		<li>Lavagem por 5 min em PBS.</li>
		<li>Transfira as fatias com um pincel lápis em um recipiente de água.</li>
		<li>Monte fatias flutuando na água em slides carregados.</li>
		<li>Seções da lamela com mídia de montagem hard-set (sem DAPI).</li>
		<li>Seque as seções do cérebro montado por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Fatias de cérebro de imagem em um microscópio confocal ou fluorescente com configurações para detectar o sinal de comprimento de onda do anticorpo secundário apropriado fluoróforo.</li>
		<li>Ajustar o microscópio para o plano focal da fatia cerebral e levar uma única imagem com ampliação de 10x.</li>
		<li>Para localizar uma possível região de LC na fatia do cérebro, use 4th ventrículo para orientação; o cerebelo situa-se acima do ventrículo, pons e tronco encefálico encontram-se abaixo de30.</li>
		<li>Para localizar o LC, concentre-se nas bordas laterais do 4th ventrículo; a LC origina-se das bordas do 4th ventrículo e pontos em direção a ponte / região de tronco cerebral (Fig. 2b, 2C).</li>
		<li>Seguir a imagem e a localização da LC em determinadas fatias do cérebro, armazenar slides contendo fatias de cérebro a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. detecção da LC em fatias de cérebro
<ol><li>Para localizar a seção do cérebro contendo o LC, cortar o cérebro de rato, como descrito acima e recolher seções em PBS cheia 24 pratos bem, conforme mostrado na Figura 2a.<ol>
<li>Coloque uma seção de cérebro por alvéolo para permitir a localização adequada da LC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colete um total de 48 fatias de cérebro que será immunostained por cérebro. Nota: Todos os poços dos dois pratos mostrados na Figura 2a contenham fatias do cérebro de um animal.</li>
	<li>Delgados cada fatia do terceiro ao quinto para DAP, ou th De preferência, realizar a imuno-histoquímica daquelas fatias de cérebro adjacentes àqueles que são doseados adicional (através de microscopia de fluorescência de raios-x, XFM). Nota: Este procedimento permite a localização exata da LC em fatias o ensaio final (Fig. 2a; rotulado com números entre os poços).</li>
	<li>Ajuste o número de fatias do cérebro que são immunostained dependendo da aplicação, por exemplo, se eles exigem a localização exata do centro e borda de LC, ou apenas uma aproximação áspera.</li>
	<li>Na sequência de imuno-histoquímica, detecta as fatias do cérebro contendo LC através de um padrão característico de expressão em ambos os lados do ventrículoth 4 (Fig. 2b, 2C). Ampliação do sinal do DAP em LC de fatias de cérebro consecutivos é mostrada na Figura 2d, 2e; a imagem ampliada da LC que é manchado por TH é mostrado em Figura 2f.
</li>
	<li>Use as seções adjacentes para aqueles contendo LC para estudos adicionais - neste caso para XFM para quantificar os níveis de metal (Figura 3).</li>
	<li>Para executar a XFM, colete 10-30 µm (dependendo da configuração) cérebro coronal finas fatias na fina película polimérica com o qual podem ser montados em suportes de amostra e fotografadas no Síncrotron.</li>
	<li>Armazenar as fatias do cérebro que são preparadas na fina película polimérica para XFM à temperatura ambiente e realizar XFM.</li>
</ol>4. metal Imaging em LC através de XFM
<ol><li>Cortar o cérebro de rato de exemplo como descrito acima, LC de determinar e medir os níveis de metal através de XFM destas fatias de cérebro contendo o LC.</li>
	<li>Distribuições de imagem elementares na trajetória 2-ID-lés a fonte de fótons avançada (Argonne National Laboratory, Argonne IL).</li>
	<li>Gravar dados 'on the fly' conforme descrito anteriormente,31.</li>
	<li>Determine concentrações elementares em fatias de cérebro contendo o LC usando o programa mapas32,33.</li>
</ol>

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Orientar corretamente o espécime é um passo crucial no presente protocolo. Porque nós estamos usando características anatômicas da superfície dorsal do cérebro para localizar LC (fronteira entre o cerebelo e colículo inferior), é importante que as seções ser alinhados corretamente. Isto requer cuidado em definir corretamente o cérebro na matriz de fatiador de cérebro de rato. Recomendamos cortar ~ 500 μm mais tecido anterior e posterior à LC para evitar perder o núcleo. O erro mais comum é cortar seções muito poucos que ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

O locus coeruleus (LC) é uma região importante do tronco cerebral e um importante local de produção de norepinefrina (NE)1. A LC envia projeções em todo o cérebro2 para o córtex, do hipocampo e do cerebelo3 e regula os principais processos fisiológicos, incluindo o ritmo circadiano4,5, atenção e memória6, estresse emoção9,10, processos cognitivos8e7. Disfunção de LC tem sido implicada em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos11, incluindo Parkinson doença12,13,14, doença de Alzheimer14, depressão15 ,16,17, transtorno bipolar,18,19e ansiedade20,21,22,23, 24. tendo em conta estes papéis, análise da LC é crucial para estudar sua função e disfunção.
Os ratos são amplamente utilizados para estudos de processos de alterações fisiológicos e fisiopatológicas. Devido ao seu pequeno tamanho, o mouse LC tem um diâmetro médio de ~ 300 μm, levando a dificuldade de localizar a estrutura. Durante o corte de cérebro, LC pode ser facilmente perdida nas secções coronais ou sagitais. Estudos disponíveis, descrevendo a identificação de LC em animais não oferecem um protocolo passo a passo que um não-especialista pode acompanhar1,25. Assim, para oferecer orientação para localização de LC, descrevemos um protocolo que desenvolvemos para localizar esta região do cérebro de rato para várias aplicações (Figura 1, Figura 2, Figura 3). O protocolo aplica-se cuidadosamente controladas cérebro seccionamento e imuno-histoquímica de deteção de DAP26,27, ou, alternativamente, TH24, ambas enzimas altamente enriquecidas em LC28. Uma vez que a LC está localizado por imuno-histoquímica, fatias de cérebro adjacente podem ser usadas para estudos adicionais, incluindo análises morfológicas e metabólicas, bem como estudos de imagiologia metais através de de microscopia (XFM) de fluorescência de raios-x29. Descrevemos XFM como exemplo neste protocolo (Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Matriz de fatiador de cérebro de camundongo adulto</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 488 (fonte - burro)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro carregadas</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de corte de criostato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mini, 9,5 cm</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Dopamina &beta;-hidroxilase (DBH) anticorpo - produção interna (fonte - coelho)</td><td>B. Eipper</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de dopamina &beta;-hidroxilase (DBH) - comercialmente disponível (fonte - coelho)</td> <td>Sinalização celular</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon, 50ml</td><td>EUA Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Forano (isofluorano)</td> <td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Hardset montagem mídia</td><td>EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços, 24 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Composto de temperatura de corte ideal (OCT)</td><td>VWR/ tecnologia</td><td>de tecido 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)/ formalina 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way moldes de incorporação descartáveis</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Escova</td><td></td><td></td><td></td>de lápis</tr><tr><td>Fosfato tampolado com solução salina (PBS)</td> <td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de barbear</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>Espátulas</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T pinos</td><td>Office Depot</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>O cérebro do rato em coordenadas estereotáxicas, Paxinos e Franklin, 3ª edição</td><td>Amazon</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (para preparar PBSD)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo tirosina hidroxilase (TH) (fonte - coelho)</td> <td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Filme fino de ultraleno para preparação</td><td>de amostra XRF SPEX</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente de campo amplo</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

localização do locus coeruleus no cérebro do rato

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

O locus coeruleus (LC) é um importante polo de noradrenalina produzindo neurônios que modulam a um número de funções fisiológicas. Anormalidades estruturais ou funcionais do LC impacto de várias regiões do cérebro, incluindo o córtex, hipocampo e cerebelo e podem contribuir para a depressão, transtorno bipolar, ansiedade, bem como doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Estes distúrbios são frequentemente associados com misbalance de metal, mas o papel dos metais na LC é apenas parcialmente compreendido. Estudos morfológicos e funcionais da LC são necessários para melhor compreender as patologias humanas e contribuição de metais. Os ratos são um modelo experimental utilizado, mas o mouse LC é pequeno (~0.3 mm de diâmetro) e difícil de identificar para um não-especialista. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em imuno-histoquímica passo a passo para localizar o LC no cérebro do rato. Dopamina-β-hidroxilase (DAP) e, alternativamente, Tirosina Hidroxilase (TH), duas enzimas altamente expressadas na LC, são utilizados como marcadores imuno-histoquímicos em fatias de cérebro. Seções adjacentes às seções contendo LC podem ser usadas para uma análise mais adicional, incluindo histologia para estudos morfológicos, testes metabólicos, bem como imagens de metal por microscopia de fluorescência de raios-x (XFM).

Alterações na homeostase de metal (tais como, Cu, Fe, Zn e Mn) são frequentemente observadas em distúrbios neurológicos, incluindo alterações na LC34,35. Assim, determinar níveis de metal no cérebro é necessário para a compreensão dos mecanismos da doença. As seções do cérebro geradas usando o protocolo descrito podem ser usadas para quantificar os níveis de Cu e outros metais em LC e compará-los com os níveis em regiões fora da L...

O locus coeruleus é um pequeno aglomerado de neurônios envolvidos em uma variedade de processos fisiológicos. Aqui, descrevemos um protocolo para preparar seções de cérebro de rato para estudos de proteínas e metais neste núcleo.

Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

A disfunção do locus coeruleus tem sido implicada em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, depressão, transtorno bipolar e ansiedade. Dadas essas funções, a análise do lócus coeruleus é crucial para estudar sua função e disfunção. Durante a seção cerebral do camundongo, o lócus coeruleus pode ser facilmente perdido em seções coronais ou sagiais devido ao seu pequeno tamanho.Assim, para oferecer orientação para a localização do locus coeruleus, descrevemos um protocolo que desenvolvemos para localizar essa região no cérebro do camundongo para diversas aplicações. Comece colocando cérebro recém-isolado de um camundongo anestesiado e depois perfumado em 4% PFA em um tubo de 50 mililitros. Incubar o cérebro por 24 horas a 4 graus Celsius.Use fórceps para transferir o cérebro para um tubo cônico de 50 mililitros cheio de 25 mililitros de solução de 30% de sacarose. Incuba-o a 4 graus Celsius por 48 a 72 horas até que o cérebro afunde no fundo do tubo. Para incorporar a seção do tronco cerebral, coloque sua superfície cortada na parte inferior de um molde de incorporação, e adicione o composto de temperatura de corte ideal para cercar o tronco cerebral.Congele o cérebro embutido em um congelador de menos 80 graus Celsius por pelo menos 12 horas até que use mais. Coloque o molde com o cérebro no criostat e incuba-o por várias horas para ajustar sua temperatura à do criostat. Para expor o bloco de OCT contendo o cérebro, use uma lâmina de barbear para cortar as quatro bordas do molde até o fundo, e depois retire o molde de incorporação dele.Use lâminas de barbear para remover o excesso de OCT da superfície do bloco, certificando-se de não tocar no cérebro. Em seguida, monte o bloco oct no mandril do criostat, expondo a superfície cortada do cérebro em direção à frente. Para ajustar o cérebro, oriente a superfície de corte paralela às lâminas de barbear do criostat.Orientar adequadamente o espécime é um passo crucial neste protocolo. Como estamos usando características anatômicas da superfície dorsal do cérebro para localizar LC, como limite entre cerebelo e coloculus inferior, é importante que as seções estejam alinhadas corretamente. Isso requer cuidado em colocar adequadamente o cérebro na matriz de cortador cerebral do camundongo.Corte o cérebro começando na medula, cortando seções de 100 micrômetros rostrally. Uma vez que o cerebelo e o tronco cerebral comecem a cortar como uma fatia contínua ao nível do quarto ventrículo, comece a coletar fatias com espessura de 50 micrômetros. Use fórceps para coletar cada fatia cerebral e colocá-la em um poço de uma placa de 24 poços cheia de PBS.O lócus coeruleus será mais perceptível em uma fatia onde o cerebelo e o colliculus inferior se encontram a cerca de 5,52 milímetros posteriores de bregma. No primeiro dia, lave as fatias cerebrais na placa de 24 poços três vezes por cinco minutos cada na PBS. Em seguida, adicione 0,5% PBS com detergente e permeabiliza-os a quatro graus Celsius por 24 horas.No dia seguinte, lave as fatias três vezes por cinco minutos cada uma com 0,5% de PBSD. Em seguida, adicione o anticorpo primário a uma diluição de um a 500 em 0,5% PBSD e incubar a quatro graus Celsius por 18 horas. No terceiro dia, lave as fatias três vezes por 10 minutos cada uma com 0,5% de PBSD, em seguida, adicione o anticorpo secundário a uma diluição de um a 1000 em 0,5%PBSD.Enrole a placa com papel alumínio e incubar a quatro graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, lave as fatias três vezes por cinco minutos cada uma com 0,5% de PBSD e, em seguida, por cinco minutos na PBS. Cubra as seções usando meio de montagem de conjunto rígido sem DAPI.Cubra com uma tampa de vidro e seque por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, use um microscópio confocal com configurações para detectar sinal do comprimento de onda de fluorescência apropriado para cortar o cérebro da imagem. Depois de ajustar o microscópio ao plano focal da fatia cerebral, use 10 vezes a ampliação para tirar uma única imagem.Use o quarto ventrículo localizado abaixo do cerebelo e acima de pons e tronco cerebral para localizar uma possível região de LC na fatia cerebral. Concentre-se nas bordas laterais do quarto ventrículo e a LC estará localizada a partir das bordas do quarto ventrículo e apontando para a região do tronco cerebral dos pons. A distribuição intracelular da dopamina beta-hidroxilase, proteína expressa na LC, foi avaliada utilizando este protocolo para estudar a morfologia lc e a densidade neuronal.Outra proteína expressa na LC, a hidroxilase de tyrosina, também mostrou um forte sinal fluorescente verde em fatias cerebrais contendo o LC.Alterações na homeostase metálica são frequentemente observadas em distúrbios neurológicos, incluindo alterações na LC.In este exemplo, quando uma fatia cerebral cortada através da LC foi medida para fosfato, potássio, zinco e cobre, apenas o cobre mostrou um aumento específico do sinal. Recomendamos cortar cerca de 500 mícrons mais tecido anterior e posterior para LC para evitar a falta do núcleo, e cortar mais seções do que o necessário, especialmente se a primeira vez realizar este protocolo. Um estudo cuidadoso das imagens do atlas cerebral antes da coloração é muito útil.Uma vez que a LC é localizada por imunohistoquímica, fatias cerebrais adjacentes podem ser usadas para estudos posteriores, incluindo análise morfológica e metabólica, bem como estudos de imagem metálica através de microscopia de fluorescência de raios-X. As seções cerebrais geradas usando o protocolo descrito podem ser usadas para quantificar os níveis de cobre e outros metais na LC e compará-los com os níveis em regiões fora da LC, o que é necessário para a compreensão do mecanismo da doença. Outras aplicações possíveis deste protocolo incluem a detecção de abundância e distribuição intracelular de dopamina beta-hidroxilase, hidroxilase de tyrosina e outras proteínas expressas na LC individualmente, ou nos ensaios de co-coloração, estudos de morfologia LC e densidade neuronal.

localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Fonte: Xavier, A. L. R., et al. Implantação de cânula na cisterna magna de roedores. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o procedimento para implantar uma cânula na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A técnica envolve guiar uma cânula montada em agulha através da dura-máter até a cisterna magna triangular invertida e prendê-la para entrega direcionada no líquido cefalorraquidiano.

Implantação de cânula na cisterna magna em um modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a gravação in vivo do potencial de campo local (LFP) de áreas M2 bilaterais do cérebro do camundongo. Um camundongo anestesiado é protegido e preparado para o procedimento. Para registrar LFPs, insira microeletrodos nas coordenadas-alvo das áreas M2 bilaterais, que são responsáveis por movimentos motores complexos.

Registro do potencial de campo local de ambos os hemisférios do cérebro do camundongo

Este protocolo descreve o uso de imuno-histoquímica para identificar regiões do locus coeruleus em seções cerebrais de camundongos. Ao direcionar a dopamina β-hidroxilase com anticorpos marcados com fluoróforo verde, os neurônios produtores de norepinefrina são visualizados como fluorescência verde ao microscópio.

Imuno-histoquímica para identificação da região do locus coeruleus em seções cerebrais de camundongos

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica de fibras colinérgicas no núcleo basal da região de Meynert de seções cerebrais de camundongos. As seções são bloqueadas e tratadas com anticorpos primários contra colina acetiltransferase, seguidos por anticorpos secundários biotinilados. São adicionados complexos avidina-biotina-peroxidase, que se ligam a anticorpos secundários, seguidos pelo substrato cromogênico. As seções são então desidratadas e montadas antes de serem visualizadas ao...

Coloração imuno-histoquímica de fibras nervosas no núcleo basal de Meyner do cérebro de camundongo

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Nós apresentamos in vivo a gravação eletrofisiológicos do potencial local do campo (LFP) no córtice de motor secundário bilateral (m2) dos ratos, que podem ser aplicados para avaliar o lateralization do hemisfério. O estudo revelou níveis alterados de sincronização entre o m2 esquerdo e direito em camundongos APP/PS1 comparados aos controles de WT.

Avaliação da lateralização do hemisfério com registro de potencial de campo local bilateral no córtex motor secundário de camundongos

Para verificar se os efeitos trigeminal no desempenho cognitivo envolvem a atividade do locus coeruleus, dois protocolos são apresentados que visam avaliar possíveis correlações entre o desempenho e as mudanças de tamanho da pupila relacionadas à tarefa induzidas pela mastigação. Esses protocolos podem ser aplicados a condições em que se suspeita a contribuição locus coeruleus.

Avaliação de alterações ligadas aos alunos na excitação mediada por Locus Coeruleus provocada pela estimulação trigeminal

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos geralmente envolve acesso através dos ossos do crânio e é guiada por marcos do crânio. Aqui descrevemos uma abordagem estereotaxa alternativa para atingir o tronco cerebral caudal e a medula espinhal cervical superior através da cisterna magna que se baseia na visualização direta de marcos do tronco cerebral.

Abordagem Cirúrgica Estereotaxic para Microinpor o Tronco Cerebral Caudal e Medula Espinhal Cervical Superior através da Cisterna Magna em Camundongos

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Aprenda a localizar o locus coeruleus em cortes de cérebro de rato usando imunohistoquímica e marcadores anatômicos. Este método permite analisar proteínas e níveis de cobre para estudar distúrbios neurológicos.

Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato

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