Name: Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a transfectar macrófagos usando nanopartículas de óxido de ferro revestidas com polietilenimina para entrega de siRNA. Este método permite silenciamento gênico eficiente in vitro e in vivo para pesquisas em nanotecnologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFA0205502) e nacional chave de pesquisa e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (81772308).

Todos os métodos que envolvem animais vivos foram realizados em conformidade com o animal cuidado e usam as diretrizes da Universidade do sudeste, China.
1. preparação do PEI-SPIONs
<ol><li>
Preparação do ácido oleico-modificado SPIONs
	<ol>
<li>Dissolva FeCl3•6H2O e Filipa4•7H2O na água sob a proteção de N2.<ol>
<li>Adicione 28 g de FeCl3•6H2O e 20 g de Filipa4•7H2O em 80 mL de água desionizada num copo. Introduzir a água através de uma canalização de vidro N2 e mexa até dissolver a matéria sólida.</li>
			<li>Aqueça a mistura de reação a 72 ° C, a uma taxa de agita de 800 rpm, seguido pela adição de 40 mL de água de amônia (28%). Mexa por 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicionar 9 mL de ácido oleico gota a gota, na solução acima mencionada e agite-a 72 ° C por 3 h.</li>
		<li>Esfrie a solução resultante a temperatura ambiente (RT). Precipitar a solução através da separação magnética.</li>
		<li>Lavar o precipitado contendo SPIONs 3 x com absoluto álcool etílico e, em seguida, dispersar o precipitado em 100 mL de N-hexano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de dimercaptosuccínico ácido-modificado SPIONs
	<ol>
<li>Adicionar 800 mg de ácido oleico (OA)-modificado SPIONs dispersadas em 200 mL de N-hexano, e 400 mg de ácido dimercaptosuccínico (DMSA) dispersos em 200 mL de acetona, para um balão de três-pescoço em um banho de água a 60 ° C. Nota: Para determinar a concentração de SPION OA-modificado obtido na etapa anterior, tomar um volume pequeno (por exemplo, 1ml) de dispersão SPION, volatilize o N-hexano e pesar o pó resultante.</li>
		<li>200 µ l de trietilamina adicione gota a gota a solução acima mencionada com agitação a 1.000 rpm e refluxo.</li>
		<li>Após 5h de agitação e refluxo, obter um precipitado preto por separação magnética.</li>
		<li>Disperse homogeneamente os hidrofílicos SPIONs em água desionizada, ajustando o pH da solução usando hidróxido de tetrametilamónio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do PEI-SPIONs
	<ol>
<li>Adicionar a solução coloidal de DMSA-modificado SPION gota a gota em solução de PEI (10 kDa) em um balão de 500 mL três-pescoço sob agitação mecânica a 1.000 rpm por 2 h (WFe: WPEI = 1:3). Nota: A carga e tamanho de PEI-SPIONs variam dependendo da proporção de WFe para WPEI. O WFe: WPEI rácio de 1:3 pode ser um bom ponto de partida para a síntese de PEI-SPIONs apropriados para entrega de siRNA.</li>
		<li>Adicionar a solução resultante em um tubo de ultrafiltração, tendo um peso molecular de corte de 100 kDa e um teor de 15 mL; em seguida, centrifugar 5.400 x g por 10 min até que o restante da solução é de 1 mL. Adicionar água desionizada para a solução para tornar o volume 15 mL novamente e repita o processo acima 10 x para obter o produto final. Em seguida, filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm e armazenar o produto final a 4 ° C.</li>
		<li>Determine a concentração de Fe de PEI-SPIONs pelo método colorimétrico, utilizando fenantrolina17. Diluir a PEI-SPIONs com água desionizada estéril, a uma concentração de 1 mg Fe/mL e armazená-lo em 4 ° C.</li>
		<li>Diluir 10 μL da solução de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) para 1 mL com água desionizada; em seguida, teste seu tamanho hidrodinâmico e potencial zeta por um dispositivo de dispersão de luz dinâmico. Nota: Preparar PEI-SPIONs na faixa de aproximadamente 30-50 nm. Nesta faixa de tamanho, o efeito do tamanho da NP na ligação de siRNA e absorção celular parece não ser significativa. PEI-SPIONs tendo um potencial zeta média mais + 37 mV pode ser tóxica na faixa de dose para transfeccao, e um ensaio de citotoxicidade deve ser realizado para garantir a segurança. A carga de superfície e tamanho hidrodinâmico das nanopartículas podem ser controlados dentro de um intervalo desejado ajustando o conteúdo de PEI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação e electroforese do Gel do Agarose de PEI-SPION/siRNA NPs
<ol><li>SiRNA diluído com água livre de RNase para produzir uma concentração final de 20 μM (0.26 μg/μL).</li>
	<li>Prepare cinco livre de RNase microcentrifuga tubos rotulados 0, 1, 2, 4 e 8. As etiquetas representam Fe: siRNA diferentes relações de peso. Pipetar 3 μL de solução de siRNA para todos os tubos (~0.8 μg de siRNA/tubo).</li>
	<li>Adicionar 0, 0.8, 1.6, 3.2, e 6.4 μg de Fe na forma de PEI-SPIONs aos tubos rotulados 0, 1, 2, 4 e 8, respectivamente. Manter o volume total da amostra de cada tubo inferior a 20 μL. Misture suavemente pipetando acima e para baixo.</li>
	<li>Incube as misturas em RT por 30 min para permitir a formação do complexo PEI-SPION/siRNA. Durante este período, fazer um agarose a 3% gel de agarose de alta pureza. Nota: Adicionais PEI-SPION/siRNA complexos com outros rácios de Fe: siRNA (por exemplo, 5 ou 6) podem ser preparados e testados.</li>
	<li>Adicione 1 μL de 6x do amortecedor do DNA-carregamento por amostra 5 μL e misture com cautela. Carregar todas as amostras e executar eletroforese em 5 V/cm até que o azul de bromofenol migra até dois terços do comprimento do gel. Manche o gel com brometo de etídio (EB) por 15-20 min. Nota: Tampão de eletroforese preparados na hora e EB solução devem ser usados.</li>
	<li>Visualize siRNA bandas sob um sistema de imagem de UV. Verifique os rácios de Fe: siRNA na quais complexos de formas de siRNA com PEI-SPIONs e, como resultado, as bandas representando siRNA livre são retardados ou não detectável.</li>
</ol>3. a transfeccao de RAW264.7 macrófagos In Vitro
<ol><li>Cultura do mouse macrófago RAW264.7 células em um prato de 10 cm, usando DMEM completam médio contendo 10% fetal de soro bovino (FBS) por 100 penicilina U/mL por 100 estreptomicina μg/mL a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .</li>
	<li>Um dia antes o transfeccao, Aspire médio das células e enxaguá-los com tampão fosfato salino (pH 7,4). Adicione 1 mL de tripsina 0,25% para o prato de 10 cm. Trypsinize RAW264.7 células por cerca de 5-10 min a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .</li>
	<li>Quando a maioria das células ter desanexado (após 5-10 min), adicione 5 mL de meio completo DMEM ao prato para inactivar a tripsina. Pipetar para cima e para baixo dispersar clusters de célula em células únicas.</li>
	<li>Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL estéril. -Centrifugar a 300 x g por 3 min em RT. Remove o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células com 5 mL de meio de completa DMEM fresco e contar as células.</li>
	<li>Células de4 placa 9 x 10 por bem em uma placa de 6 com 2 mL de meio DMEM completo e incubam a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por cerca de 24 h. Nota: Se utilizar uma placa de um tamanho diferente, ajuste a densidade de celular chapeado na proporção de área de superfície relativa para que as células alcançar confluência de 80% na época do transfection.</li>
	<li>Quando a confluência de célula é de 80%, remover o meio das células e substituí-lo com 1 mL de meio completo DMEM por alvéolo. Devolve a chapa para a incubadora até PEI-SPION/siRNA complexos foram preparados e estão prontos para uso (cerca de 30 min).</li>
	<li>Preparar o PEI-SPION/siRNA complexos: calcular a quantidade de PEI-SPION/siRNA complexos necessários para uma experiência do transfection. Em um 1,5 mL RNase-livre microcentrifuga tubo, misture uma quantidade adequada de PEI-SPIONs com siRNA em uma proporção de Fe: siRNA determinado. Por exemplo, para preparar o NPs PEI-SPION/siRNA contendo 100 µ g de Fe em uma proporção de Fe: siRNA de 4, adicionar 100 µ l (1 mg Fe/mL) de PEI-SPIONs para 96 μL de siRNA (0.26 μg/μL), seguido de misturá-lo suavemente com uma micropipeta. Incubar durante 30 min à RT. Nota: Prepare um volume de PEI-SPION/siRNA complexo que é 10% superior a massa total final responsáveis por quaisquer perdas acidentais. Faça PEI-SPION/siRNA complexos em baixa Fe: siRNA rácios, em que moléculas de siRNA são completamente carregadas na PEI-SPIONs e, portanto, pequenas quantidades de PEI-SPIONs podem ser usadas para minimizar a citotoxidade potencial. Experiências piloto (ensaio de retardo de gel), para a otimização da relação de Fe: siRNA são necessárias.</li>
	<li>Retire a placa de 6 da incubadora (etapa 3.7). Adicionar um volume necessário de PEI-SPION/siRNA complexo gota a gota a cada poço e agite a placa cautelosamente para garantir uma distribuição uniforme. Devolve a chapa para a incubadora até o balanço do celular absorção ou gene "knockdown" eficiência (1-3 d). Nota: Transfecting macrófagos com PEI-SPION/siRNA em uma concentração de ~ 15 μg Fe/mL podem maximizar a eficiência de transfeccao minimizando a citotoxidade potencial.</li>
</ol>4. sistêmica entrega de siRNA para macrófagos em ratos com artrite Experimental
<ol><li>Obter ratos da linhagem Wistar masculinos isentos de organismos patogénicos específicos que são 7 semanas de idade. Se habituar os ratos para 7 d antes da utilização e fornecê-los com água e uma alimentação adequada. Induzi a artrite adjuvante (AA) de ratos como descrito anteriormente,18.</li>
	<li>Prepare-se complexos de PEI-SPION/siRNA conforme descrito na etapa 3.8.</li>
	<li>Injete o NPs PEI-SPION/siRNA (0,3 mg de siRNA/kg) a AA ratos através da veia da cauda. Avaliar a absorção celular através de, por exemplo, citometria de fluxo, tecido biodistribuição através de, por exemplo, uma sistema, de imagem em tempo real da fluorescência ou efeitos terapêuticos com base em, por exemplo, clínica, radiográfica e histológica 18pontos de análises no tempo desejado. Nota: Para estudos de biodistribuição celular e tecidos, tratar os ratos com uma única injeção do NPs desejado; para estudos terapêuticos, injete os ratos com o NPs para ser testado 1x por semana durante três semanas consecutivas.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723(2011).</li>
<li>Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960(2014).</li>
<li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Macrophages+and+Dendritic+Cells%22">Macrophages and Dendritic Cells</a>. , Springer. 123-143 (2009).</li>
<li>Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+nanoparticle+delivers+small+interfering+RNA+to+macrophages+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0118472(2015).</li>
<li>Davignon, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+monocytes%2Fmacrophages+in+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).</li>
<li>Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+targeting+macrophages+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The promise of targeting macrophages in cancer therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+macrophage+necroptosis+for+therapeutic+and+diagnostic+interventions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis.</a> Science Advances. 2 (7), e1600224(2016).</li>
<li>Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+nanocarriers+to+treat+autoimmunity+and+chronis+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases.</a> Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).</li>
<li>Höbel, S., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimines+for+siRNA+and+miRNA+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).</li>
<li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+down+barriers%3A+advances+in+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129(2009).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Alkyl-PEI-functionalized+iron+oxide+nanoclusters+for+efficient+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery.</a> Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).</li>
<li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+macrophages+with+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nature Materials. 13 (2), 125(2014).</li>
<li>Magro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+bound+DNA+on+naked+iron+oxide+nanoparticles%3A+Intelligent+colloidal+nano-vector+for+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).</li>
<li>Abdelrahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+delivery+system+based+on+magnetic+nanovectors%3A+Characterization+and+stability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).</li>
<li>Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+in+three-dimensional+cell+cultures+by+superparamagnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles.</a> ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).</li>
<li>Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-circulating+and+target-specific+nanoparticles%3A+theory+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice.</a> Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).</li>
<li>Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+spectrophotometric+determination+of+iron+%28II%29+and+total+iron+with+1%2C+10-phenanthroline%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline.</a> Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine-functionalized+iron+oxide+nanoparticles+for+systemic+siRNA+delivery+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis.</a> Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).</li>
<li>Fröhlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+surface+charge+in+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+medical+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5577(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-small+particles+of+iron+oxide+as+peroxidase+for+immunohistochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection.</a> Nanotechnology. 22 (22), 225703(2011).</li>
<li>Xia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+coating+enhances+the+cellular+uptake+of+mesoporous+silica+nanoparticles+and+allows+safe+delivery+of+siRNA+and+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li>
<li>Mocellin, S., Provenzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+learning+gene+knock-down+from+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology.</a> Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39(2004).</li>
<li>Courties, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.In+vivo+RNAi-mediated+silencing+of+TAK1+decreases+inflammatory+Th1+and+Th17+cells+through+targeting+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells.</a> Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).</li>
<li>Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+nanoparticles+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: nanoparticles and the immune system.</a> Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).</li>
<li>Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-coated+SPIONs+trigger+macrophage+activation+through+TLR-4+signaling+and+ROS+production+and+modulate+podosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics.</a> Biomaterials. 52, 494-506 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os macrófagos são refratários a transfect por abordagens nonviral comumente usadas, como espécie de lipídios, lipossomas catiônicos e eletroporação. Aqui nós descrevemos um método confiável e eficiente para transfect macrófagos com siRNA. Utilizando o presente protocolo, mais 90% dos macrófagos, como 264.7 pilhas (Figura 2B) e de macrófagos peritoneais de ratos18 pode ser transfected com siRNA sem deterioração significativa da viabilidade celular. Esse método depende ...

Os macrófagos são um tipo de células do sistema imune inatos distribuídos em todos os tecidos do corpo, embora em quantidades diferentes. Produzindo uma variedade de citocinas e outros mediadores, eles desempenham papéis críticos na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos a invadir, na reparação de tecidos após lesão e na manutenção da homeostase de tecido1. Devido à sua importância, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação. No entanto, apesar de sua prevalência em estudos de função e regulação gênica, silenciamento de genes mediada por siRNA é menos susceptível de ter êxito em macrófagos, porque estas células — particularmente, macrófagos primários — são frequentemente difíceis de transfect. Isto pode ser atribuído a um grau relativamente elevado de toxicidade associado com abordagens de transfeccao mais bem estabelecidas que a membrana celular é quimicamente (por exemplo, com polímeros e lipídios) ou fisicamente (por exemplo, por eletroporação e armas de gene) interrompeu deixar siRNA moléculas atravessam a membrana, reduzindo assim drasticamente viabilidade de2,3 dos macrófagos. Além disso, os macrófagos são os fagócitos dedicados ricos em enzimas degradativos. Estas enzimas podem danificar a integridade do siRNA, enfraquecendo sua eficiência silencioso mesmo se siRNA gene-específico foi entregue para a célula3,4. Portanto, precisa de um sistema de entrega de siRNA macrófago-alvo eficaz proteger a integridade e a estabilidade de siRNA durante entrega4.
É cada vez mais evidente que macrófagos disfuncionais estão implicados na iniciação e progressão de certas desordens clínicas comuns como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Por este motivo, modulando a função do macrófago com, por exemplo, siRNA, tem sido a emergir como uma metodologia atraente para o tratamento destes transtornos5,6,7. Embora muito progresso tem sido feito, um grande desafio da estratégia de tratamento baseado em siRNA é a especificidade da célula pobre de siRNA sistemicamente administrado e a absorção de siRNA insuficiente pelos macrófagos, que, consequentemente, levar a efeitos colaterais indesejados. Comparado com terapêutica de ácido nucleico livre que geralmente carecem de seletividade de célula ideal e muitas vezes levam a efeitos adversos, carregado de drogas nanopartículas (NPs), devido à sua propensão espontânea de ser capturado pelo sistema reticuloendotelial, fora do alvo pode ser projetada para o direcionamento passiva de macrófagos na vivo, permitindo a maior eficácia terapêutica com efeitos colaterais mínimos8. Atual NPs explorado para a entrega de moléculas do RNA incluem nanocarriers inorgânicos e lipossomas diversos polímeros9. Entre eles, o polyethyleneimine (PEI), um tipo de polímeros cationic capazes de vinculação e condensação de ácidos nucleicos em NPs estabilizado, mostra o RNA maior fornecimento de capacidade9,10. PEI protege os ácidos nucleicos de degradação enzimática e nonenzymatic, Medeia sua transferência através da membrana celular e promove sua liberação intracelular. Embora inicialmente introduzido como um reagente de entrega de DNA, PEI foi posteriormente demonstrado ser uma plataforma atrativa para na vivo entrega siRNA, localmente ou sistemicamente9,10.
Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIONs) tem mostrado grande promessa na biomedicina, devido às suas propriedades magnéticas, biocompatibilidade, tamanho comparável aos objetos biologicamente importantes, alta proporção de superfície-área-volume e facilmente adaptável superfície para o bioagente anexo11. Por exemplo, por causa de sua utilidade potencial como um agente de contraste e rápida absorção por macrófagos, SPIONs surgiram como uma ferramenta clínica favorita para imagem de macrófagos de tecido12. Enquanto SPIONs também têm sido muito estudados como ácido nucleico entrega veículos11,13,14,15, nosso conhecimento, a literatura contém alguns relatos de SPIONs como um portador para entrega de siRNA macrófago-alvo. Para a entrega do gene por SPIONs, sua superfície geralmente é revestida com uma camada de polímeros cationic hidrofílicos na qual carregados negativamente ácidos nucleicos pode ser eletrostaticamente atraiu e amarrados. Aqui, apresentamos um método para a síntese de SPIONs cuja superfície é modificada com baixo peso molecular (10 kDa), ramificada PEI (PEI-SPIONs). Estes nanoplatforms magnéticos então são empregados para condensar siRNA, formando complexos de PEI-SPION/siRNA que permitem o transporte de siRNA para a célula. Nós razão aquela espontânea fagocitose de SPIONs pelas células do sistema reticuloendotelial16, juntamente com a forte capacidade de ligação e condensação de ácidos nucleicos por PEI, processa a PEI-SPIONs apropriado para o transporte eficiente de siRNA em macrófagos. Os dados apresentados aqui apoiar a viabilidade de silenciamento de genes PEI SPION/siRNA-mediada em macrófagos na cultura, bem como na vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>C11995500BT Quente em 37&deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (1,5 ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio MTS à base de tetrazólio</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Para análise de citotoxicidade</td></tr><tr><td>Linha celular RAW 264.7</td><td>Banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos (6 poços)</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos (10 cm)</td>Tubos <td>sem RNase de 430167</td><td></td> <td>Corning</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td>Tubos de centrífuga <td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>Ratos Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Wistar</td><td>Centro de Animais Experimentais de Xangai da Academia Chinesa de Ciências</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus Calmette&ndash; Gu&eacute; rin liofilizado em pó</td><td>Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Medicamentos, China</td><td></td><td>para induzir artrite adjuvante em ratos</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (Xangai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (Guangzhou, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoimina (10 kDa)</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E107079</tr><tr><td>Água de amônia</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Aladdin Reagente Químico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico Co., Ltd</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&bull; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dimercaptosuccínico</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D107254</tr><tr><td>tubo de ultrafiltração</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>solução de hidróxido de tetrametilamônio</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>Analisador de tamanho de partícula e potencial zeta</td><td>Malvern, Inglaterra</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

nanopartículas de óxido de ferro revestido de polyethyleneimine como um veículo para a entrega de rna de interferência pequeno para macrófagos in vitro e in vivo

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Devido ao seu papel crítico na regulação da resposta imune, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação e representam um alvo terapêutico promissor em muitas doenças, como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Silenciamento de genes mediada por RNAi é uma valiosa abordagem de escolha para investigar e manipular a função de macrófagos; no entanto, o transfeccao de macrófagos com siRNA é considerado frequentemente para ser tecnicamente desafiador, e, neste momento, algumas metodologias dedicadas para a transferência de siRNA para macrófagos estão disponíveis. Aqui, apresentamos um protocolo do uso de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético polyethyleneimine-revestido (PEI-SPIONs) como um veículo para a entrega de alvo de siRNA para macrófagos. PEI-SPIONs são capazes de vinculação e completamente condensação siRNA quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge 4 e acima. In vitro, essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA em macrófagos primários, bem como para a linha de celular de macrófagos, como 264.7 crus, sem comprometer viabilidade celular na dose ideal para transfeccao, e, em última análise, eles induzem silenciamento de genes mediada por siRNA alvo. Além de ser usado para em vitro transfeccao siRNA, PEI-SPIONs são também uma ferramenta promissora para a entrega de siRNA para macrófagos na vivo. Tendo em conta as suas características combinadas de propriedade magnética e silenciamento capacidade, sistemicamente administrado PEI-SPION/siRNA partículas são esperadas não só para modular a função de macrófagos, mas também para ativar macrófagos para ser fotografado e rastreado. Em essência, PEI-SPIONs representam uma plataforma nonviral simples, segura e eficaz para a entrega de siRNA para macrófagos tanto in vitro e in vivo.

O tamanho e a zeta potencial de PEI-SPIONs preparado com este protocolo foram na faixa de 29-48 nm (índice de polidispersividade: 0.12 - 0,23) e 30-48 mV, respectivamente. Eles estavam estáveis em água a 4 ° C por mais de 12 meses sem agregação óbvia. Para avaliar sua capacidade de vinculação de siRNA, PEI-SPIONs foram misturadas com siRNA em várias relações de peso de Fe: siRNA. A Figura 1 mostra que quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge 4 e acima, a ...

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Essa medida pode ajudar a responder a perguntas-chave. No campo da humanologia. Essa resposta na função de macrófagos sob o fim fisiológico de condições patológicas.A principal vantagem desta técnica é que a polietileneimina revestida pode en vitro eficientemente sem comprometer a célula. Sob doses ideais. As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de muitos distúrbios inflamatórios crônicos e cânceres.Onde os macrófagos desempenham um papel essencial na patogênese. Demonstrando o procedimento será Na Jia. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório.E Kaixuan Wang, um estudante de pós-graduação do laboratório do Dr. Xiaohua. Para preparar nanopartículas de óxido de ferro super paramagnética modificadas modificadas ou spion primeiro adicionar 28 gramas de hexahidrato de cloreto de faraó. E 20 gramas faraós autoato heptahydrate a um béquer contendo 80 mililitros de água deionizada.E use um conduíte de vidro para introduzir nitrogênio na solução. Mexendo até que a matéria sólida tenha dissolvido. Aqueça a mistura de reação a 72 graus Celsius com agitação a 800 rotações por minuto.E adicione 40 mililitros de 28% de água de amônia ao béquer. Depois de cinco minutos adicione nove mililitros de ácido aliado gota sábia. E mantenha a mistura a 72 graus Celsius por três horas com agitação contínua.No final da incubação esfrie a solução resultante para a temperatura ambiente. E precipitar a mistura através da separação magnética de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, lave o SPION contendo precipitado três vezes com álcool etílico absoluto.E asperse o precipitado em 100 mililitros de n-hexano. Para preparar o ácido acrílico modificado, o SPION's de ácido acrílico adiciona 800 miligramas do spion modificado do ácido aliado. Dispersados em 200 mililitros de n-hexano e 400 miligramas de ácido acrílico dimercapto dispersados em 200 mililitros de acetona em um frasco de três pescoços em um banho de água a 60 graus Celsius.Em seguida, adicione 200 microliters de trietilamina gota sábia ao frasco com agitação a 1000 rotações por minuto e refluxo. Um precipitado preto pode ser obtido por separação magnética após cinco horas. Em seguida, use hidróxido de tetrametamônio para ajustar o pH da solução para dispersão homogênea do SPION hidrofílico em água desionizada.Spion revestido de polietileneimina degenerada adicionam o ácido acrílico modificado solução coloidal do SPION modificada em uma solução de polietileneimina de 10 quilodalton. Em um frasco de três pescoços de 500 mililitros sob agitação mecânica a 1000 rotações por minuto durante duas horas. No final da incubação adicione a solução resultante a um tubo de ultra filtração com um peso molecular cortado de 100 kilodaltons e um conteúdo de 15 mililitros.Subsutilize a amostra até que a solução restante atinja um volume de um mililitro. Adicione água deionizada à solução para trazer o volume de volta para 15 mililitros. E centrafuse e reidratar a solução mais dez vezes como acabou de demonstrar.Em seguida, filtre a solução através de um filtro de 22 mícrons para armazenamento a quatro graus Celsius. Para preparar as nanopartículas siRNA primeiro adicione três microlitradores de 20 soluções de siRNA micromolar recém-preparadas para cinco tubos microcentroafusados gratuitos da RNA. E adicione 0, 8, 1,6, 3,2 e 6,4 microgramas de SPION de polietileneimina aos tubos rotulados zero, um, dois, quatro e oito, respectivamente.Depois de misturar com tubos suaves, incubar as amostras por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que os complexos de siRNA spion de polietileneimina se formem. E prepare um gel de 3% de agarose com a ágarose da pureza. No final da incubação adicione um microliter de 6X buffer de carregamento de DNA por cinco microliters de amostra para cada tubo e misture cuidadosamente.Em seguida, carregue todas as amostras no gel. E executar eletroforese a cinco volts por centímetro. Até que o corante azul bromofenol migra dois terços do comprimento no gel.Um dia antes da transfecção lavar um micrófago de camundongos como a cultura celular RAW264.7 com PBS. E trate as células com um mililitro de 25% de trippsina por cinco a dez minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Quando a maioria das células se separaram.Inativar a trippsina com cinco mililitros de DMEN completo. Em seguida, pippete a solução várias vezes para dispersar quaisquer aglomerados celulares. Transfira a suspensão celular para um tubo de conackel de 15 mililitros estéril para centrifugação.Em seguida, suspenda novamente as células em cinco mililitros de DMEN completo fresco para contar. Diluir as células para uma concentração de 4,5 vezes dez para a quarta células por mililitro de concentração completa de DMEN. E adicione dois mililitros de médio a cada poço de uma placa de seis poços para uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular.No dia seguinte, prepare a razão apropriada de nanopartículas de siRNA spion de polietileneimina em um tubo de microcentrifuge de fluxo de RNA de 1,5 mililitro com mistura suave como apenas demonstrado. E adicione o volume apropriado de polietileneimina SPION siRNA nanopartícula complexa a cada poço que foi substituído por um mililitro de meio fresco. Prepare os complexos spion si de polietileneimina.neste caso, muitos mais meses de SPION de polietileneimina podem ser usados assim minimizando sua toxicidade potencial. Em seguida, gire a placa cuidadosamente para obter uma distribuição uniforme das nanopartículas através das partes inferiores do poço. Devolva a placa à incubadora de cultura celular até a atualização celular subsequente ou a análise da deficiência de knockdown genético.SPION de polietileneimina com potencial zeta de 30,5 e 37 milivolts não apresentam uma toxicidade cito aparente em concentrações de até 30 microgramas de ferro por mililitro. Que é cerca de duas vezes a contratação do que a concentração normalmente usada para transfecção celular. O potencial zeta da POLIetileneimina SPION de 48 milivolts, no entanto, são tóxicos.Mesmo na dose mais baixa examinada. Como analisado pela citometria de fluxo, mais de 90% das células podem ser transfeinadas com complexos de siRNA de polietileneimina fluorescente a 15 microgramas de ferro por mililitro. A avaliação dos efeitos das concentrações de siRNA de polietileneimina spion na internalização celular esmagando manchas azuis revela uma coloração minimamente detectável a 7,5 microgramas de ferro por mililitro.Mas manchas claramente visíveis a 15 microgramas de ferro por mililitro que não aumentam em concentrações mais altas de ferro provavelmente devido à absorção de saturação de saturação de absorção de siRNA de polietileneimina SPION. Macrófagos peritoneais transfectados com siRNA específico de polietileneimina SPION apresentam uma diminuição significativa nos níveis de mRNA de targe em comparação com siRNA não específica. Sugerindo que o siRNA pode escapar de vesículas endocíticas para o citoplasma para alcançar as máquinas de interferência de RNA.Além disso, após a injeção intravenosa de uma única dose de polietileneimina SPION siRNA nanopartículas flocentimétricas análise flocentimétrica de células positivas CD11b e CD3 positivo revela uma absorção mais eficiente das nanopartículas pelo CD11b expressando macrófagos do que por células positivas CD3 a qualquer momento em todos os órgãos examinados. Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de preparar os SPIONs de polietileneimina com um potencial médio de dados não superior a 37 milvolts e preparar os complexos de siRNA SPION de polietileneimina nas relações de ferro baixo para siRNA. Essa técnica compara a necessidade de os pesquisadores explorarem o potencial terapêutico de segmentação do macrófago em motores animais de doenças humanas, como e câncer.

polyethyleneimine-coated-iron-oxide-nanoparticles-as-vehicle-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Entrega continua a ser o principal desafio para a aplicação terapêutica de RNA de interferência pequeno (siRNA). Este protocolo envolve a utilização de uma plataforma de entrega de siRNA multifuncional e biocompativel, que consiste de arginina e polietilenoimina enxertado micropartículas de silício poroso.

Porous Silicon micropartículas para entrega de siRNA Therapeutics

Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

Este manuscrito demonstra o esgotamento de expressão gênica no intestino da barata alemão através da ingestão oral de RNA double-stranded encapsulada em lipossomas.

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

Inibição de microRNA tecido-específica é uma tecnologia que é subdesenvolvida no campo do microRNA. Aqui, descrevemos um protocolo para inibir com sucesso a família miR-181 microRNA nas células myoblast do coração. Nanovector tecnologia é usada para entregar um microRNA esponja que demonstra significativa na vivo cardio-específicos miR-181 família inibição.

Na Vivo Entrega de nanovector de uma coração-específicas do MicroRNA-esponja

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

Aqui, entregamos miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim via injeção na veia caudal de um vetor não viral e nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de camundongos com doença renal. Isso levou a uma superexpressão significativa de miRNA-alvo no rim, resultando em progressão inibida da doença renal em vários modelos de camundongos.

Entrega de miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim usando nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de doença renal em camundongos

Aqui, descrevemos o protocolo para entrega in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro carregando oligômeros de RNA para câncer de mama metastático em modelos animais, fornecendo uma abordagem clinicamente viável para o silenciamento terapêutico de ácidos nucléicos oncogênicos.

Monitoramento do acúmulo de nanodrogas em metástases de câncer de mama murino

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeo em um modelo animal de glioblastoma multiforme

Aprenda a transfectar macrófagos usando nanopartículas de óxido de ferro revestidas com polietilenimina para entrega de siRNA. Este método permite silenciamento gênico eficiente in vitro e in vivo para pesquisas em nanotecnologia.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Explorar mais vídeos