Name: Técnicas reprodutivas para monitoramento e controle ovariano em anfíbios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de ovariectomia recuperável em anfíbios para obtenção de oócitos sem eutanásia. Este método permite monitorar a saúde reprodutiva e tratar patologias de retenção de ovos em fêmeas de anuros.

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Natalie Calatayud gostaria de agradecer a Dr. Barbara Durrant para a formação e assistência com ultra-som e exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) para a concessão de ajuda financeira para a minha posição de pesquisador associado na SDZG. Graças ao Dr. Kylie Cane para comentários sobre o manuscrito, bem como para os revisores oficiais (quem quer que eles possam ser). Graças a Jonathan Dain nosso companheiro de verão 2018, San Diego Zoo Institute for Conservation Research para fornecer fotos (Figura 1a, B). Monica Stoops amplia a apreciação da Associação de jardins zoológicos e aquários conservação fundo de dotação e do fundo de conservação da Disney Worldwide para fornecer apoio financeiro para estabelecer a população cativa Necturus . Além disso, o apoio também foi recebido através de doações privadas da advogada anfíbia Sra. Iris de la Motte. Obrigado, é dado ao Sr. Christopher DeChant e Dr. Mark Campbell por sua contribuição significativa para a pesquisa.

Os autores não têm nada a revelar.

A manipulação direta, a observação visual e as medidas morfométricas fornecem técnicas não invasoras e são os primeiros critérios da avaliação para determinar a fase reprodutiva fêmea. Entretanto, este estudo mostra que os ovários gravid não podem sempre ser identificados confiantemente pela palpação. Dependendo da espécie, os ovários gravid podem às vezes ser visualmente detectados através de uma pele semitranslúcida (Figura 13a, B) ou completamente translúcida no lado ventral do animal (Figura 13C). As fêmeas que completaram a oviposição podem mostrar alterações óbvias à sua aparência em comparação com fêmeas gravidas (por exemplo, pele solta e perda de até 30% de sua massa corporal, Figura 13D). Durante a reprodução, os machos e as fêmeas exibirão determinados comportamentos que fornecem a informação sobre a proximidade à ovulação e ao oviposition. No caso de R. muscosa indicações de que uma fêmea está perto de oviposição começar com a fêmea entrando handstands.
A aplicação da tecnologia de ultrassom a anãs e Caudatas permite o diagnóstico de presença ou ausência de ovos e se a oviposição foi associada à liberação completa ou parcial de ovos desenvolvidos. Assim, este método proporciona uma avaliação mais completa e precisa do estado reprodutivo sem se limitar a determinar o estado gravid/não gravid através de uma técnica de visualização que varia de acordo com a transparência da pele abdominal, ou a consistência epidérmica entre diferentes espécies de anfíbios. A ultrassonografia pode ser realizada com relativa facilidade e com pouco estresse para os animais (Figura 5 e Figura 13) e pode ser utilizada para caracterizar os ciclos reprodutivos e determinar o estado reprodutivo4. É fundamental familiarizar-se com a espécie; no entanto, este estudo mostrou que Necturus e R. muscosa compartilham sinais comuns de desenvolvimento em seus padrões reprodutivos, permitindo a classificação similar do estágio reprodutivo (Figura 5). Através desta tecnologia há agora evidências de que o desenvolvimento de ovos é elevado em cativeiro Necturus e R. muscosa e que ambas as espécies seguem um padrão sazonal. Embora as razões para estes fenômenos são desconhecidas e exigem um inquérito mais adicional, sem o uso do ultra-som, diversas áreas da deficiência orgânica ovariana, tais como a retenção do ovo e o oviposition parcial, teriam ido undetected. As aplicações futuras a esta técnica serão usadas para determinar se as fêmeas devem ser selecionadas para a criação de animais em um determinado ano e se a oviposição está completa.
Um protocolo de coleta de sangue, como o apresentado em R. muscosa, que é eficaz e provoca um mínimo de angústia para o animal, é ideal para estudar os perfis hormonais em cativeiro e selvagem-capturados anãs (Calatayud, inéditos). Até à data, não existe informação sobre os perfis hormonais anuais de R. muscosa cativo e, portanto, nenhum conhecimento sobre como os hormônios estão influenciando sua saúde e reprodução. Além disso, com evidências de que as fêmeas desta espécie podem não ser criadores anuais, o perfil hormonal será outro método para rastrear os ciclos ovarianos. Juntamente com o ultra-som, a análise hormonal pode levar a uma melhor predição do que as fêmeas estarão prontas para a oviposição. Além disso, no ano passado, foram documentados dois casos de Intersexo na população cativa R. muscosa . Além, o desenvolvimento de almofadas do polegar foi anotado em algumas das fêmeas fundando mais velhas. Razões para isso estão atualmente investigação, mas os resultados iniciais sugerem que pode se relacionar com mudanças nos níveis de testosterona (Calatayud, não publicado). Discernir os ciclos hormonais em fêmeas de diferentes idades nos ajudará a entender por que as fêmeas podem desenvolver características sexuais secundárias associadas ao sexo masculino e se isso deve ser esperado em uma população envelhece.
A terapia hormonal exógena tem sido usada para superar disfunções reprodutivas freqüentemente encontradas em anfíbios em cativeiro. No entanto, para as populações de R. muscosa e Necturus neste estudo, não foram detectadas diferenças significativas na oviposição entre fêmeas tratadas com hormônio e controle ao longo de um período de 2 e 5 anos, respectivamente. Isso pode indicar que o protocolo de administração hormonal, doses, escorva e combinação hormonal utilizada não foi adequada para a espécie. Uma análise mais estreita de histórias reprodutivas fêmeas individuais sugere R. muscosa não pode experimentar a criação de animais anual, que poderia igualmente dar conta da falta do hormonal-efeito observado em fêmeas tratadas. Porque uma certa percentagem de fêmeas consistentemente ignorado reprodução a cada ano, entendendo a história natural da espécie pode ajudar a determinar se há uma necessidade de hormônios EXÓGENOS e quando eles podem ser mais eficazes. Os procedimentos descritos neste artigo podem ser aplicados a um número de espécies, (tabela 1) e são para anãs variando de 5 g a 150 g; animais maiores podem necessitar de seringas diferentes e medidores de agulhas. A localização da injeção varia com alguns hormônios que necessitam de injeção intra-muscular, intra-peritoneal, subcutânea ou intradérmica (Figura 7).
A cirurgia para fins de ovariectomia é um método comum usado em várias espécies de anfíbios para obter oócitos para estudos embriológicos. A ovariectomia também pode ser indicada para controle populacional e questões médicas, como retenção de ovos. No caso de ovariectomias parciais em que a colheita de oócitos é realizada para fins de pesquisa, a cirurgia deve garantir que o animal permaneça reprodutivo. A administração de PGF2α mostrou alguma promessa em resolver a retenção do ovo na R. muscosafêmea. Em vários indivíduos, PGF2α provocou a deposição completa de ovos previamente retidos, mas em outros apenas a deposição parcial ocorreu exigindo remoção manual para remover todos os ovos. Enquanto PGF2α pode servir como uma alternativa à cirurgia para retenção de ovos em R. muscosa, sua capacidade de remediar condições patológicas semelhantes em outros anfíbios exigirá validação específica de espécies. Quando a intervenção cirúrgica é mandatada para o paciente Anuran ou Caudate, é necessário assegurar um plano adequado de anestesia antes que as incisões sejam feitas. Habilidades de observação astuto são necessárias para avaliar e monitorar as respostas normativas de indução e recuperação, conforme descrito neste estudo para cada um dos táxons. Uma vez que se conhece a anatomia específica, uma abordagem cirúrgica adequada, hemostasia, manipulação delicada do tecido e manejo pós-operatório adequado, as cirurgias reprodutivas não colocam obstáculos esmagadores.

Os anfíbios têm sido reconhecidos por muito tempo como modelos biológicos e médicos importantes por uma escala larga de disciplinas da pesquisa. Os dados obtidos estudando espécies particulares como Xenopus laevis e X. tropicalis, o sapo leopardo (Lithobates (anteriormente Rana) pipiens) e o Axolotl (Ambystoma mexicanum) foram aplicados a uma série de outras espécies de vertebrados, incluindo os seres humanos. As técnicas veterinárias, de criação e de reprodução assistida que emergiram do estudo destes e de outros anfíbios prestam assistência aos encarregados do desenvolvimento de cuidados de sucesso, manutenção e sustentabilidade de populações mais raras em cativeiro 1. º , 2. º , 3. º , a 4.
O interesse está ganhando para o uso simultâneo de in e de abordagens de conservação ex situ-Based para reverter a maré de extinção para muitos em risco espécies de anfíbios1,2. Este artigo fornece as metodologias presentemente disponíveis para monitorar e controlar a função ovariana anfíbios em espécies modelo de anurans e de caudates. Adicionalmente, as técnicas existentes para endereçar uma patologia reprodutiva comum da retenção do ovo são apresentadas.
Como em muitos grupos taxonômicos, o controle ovariano de anfíbios envolve uma série de interações fortemente sincronizadas entre o meio ambiente e a fisiologia. A temperatura e o fotoperíodo (conhecidos como sinais proximos) são decodificados pelo olho e cérebro onde são rapidamente convertidos em processos genéticos, hormonais e circadianos (sinais finais)3,4. Os métodos para monitorar e controlar a função ovariana abordados neste artigo incluem técnicas invasivas e não invasivas. O Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) os requisitos de pesquisa e ensino definem técnicas não invasivas como aquelas que causarão mínima ou nenhuma dor física ou sofrimento mental e não necessitará de medicamentos que aliviem a dor5. Aqui, técnicas não invasivas incluem inspeção visual e palpação, observações comportamentais, avaliações morfométricas e ultrassonografia. Pelo contrário, as técnicas de coleta de sangue, administração hormonal e cirurgia (ovariectomia e remoção de ovos retidos) são classificadas como invasivas, uma vez que podem resultar em alguma dor ou desconforto e necessitam de anestesia ou terapia medicamentosa pós-procedimento.
As técnicas ovarianas não invasoras da monitoração podem facilmente ser incorporadas na rotina diária do cuidado para a maioria de anfíbios prisioneiros. Dependendo da espécie, a gravidez ovariana pode frequentemente ser determinada pela inspeção visual simples (râ de vidro). Em outros casos, a palpação pode indicar se uma fêmea é gravid. Vários índices de condição corporal (BCI), tais como peso, comprimento do focinho urostyle (Sul), comprimento do focinho-Vent (svl) e índice de massa padrão (SMI) estão disponíveis para prever a presença ou ausência de ovos4,6,7, 8,9. No entanto, deve-se tomar cuidado com a interpretação dos resultados, pois a maioria não considera a idade, a forma do corpo ou a composição (por exemplo, água retida versus massa ovariana ou gordura)6. Os diagnósticos reprodutivos definitivos podem ser alcançados via ultrassonografia com conhecimento mais aprofundado adquirido em relação ao desenvolvimento de ovos e estadiamento do ciclo ovariano4,7. A ultrassonografia também fornece meios para confirmar e monitorar patologias reprodutivas e condições fisiológicas associadas,4,8.
Além de fornecer informações sobre o estado de saúde, a amostragem de sangue pode ser usada para medir os hormônios reprodutivos. Se o perfil hormonal é o objetivo final, é importante evitar influências relacionadas ao estresse que podem confundir dados de esteroides sistêmicos. Embora uma ferramenta de monitoramento potencialmente poderosa, ainda há um estudo demonstrando respostas endocrinológicas inatas à administração de hormônios EXÓGENOS em qualquer espécie de anfíbios. O sangue pode ser tomado com segurança de vários locais; em rãs isso inclui a veia abdominal ventral, plexo lingual, veia femoral e coração9,10. Em Caudates, o sangue é coletado da veia ventral da cauda. O grau de invasividade, a quantidade de contenção necessária, a necessidade de anestesia, a delicadeza do órgão alvo e o tamanho do animal são fatores a serem considerados na escolha de uma técnica de coleta para o paciente anfíbio. Este artigo apresentará a técnica de coleta de sangue da veia maxilar ou musculocutânea facial de rãs como originalmente descrita por Forzan et al.9.
O controle ovariano é específico da espécie e, como tal, os protocolos hormonais devem ser testados e otimizados. Além da sazonalidade e do Milieu hormonal circulante associado, o controle ovariano também pode estar intimamente ligado à idade, tempo gasto em cativeiro e exposição à administração hormonal repetida, para o qual há pouca informação na literatura11 , 12 anos de , 13. a implementação de terapias hormonais para provocar comportamentos reprodutivos, produção de gametas, maturação e oviposição tornou-se uma abordagem amplamente relatada para resolver problemas reprodutivos comuns associados ao cativeiro4, 8,14,15,16. Como os mecanismos que controlam a reprodução em vertebrados são altamente conservados, há uma série de hormônios, neuropeptídeos e medicamentos comercialmente disponíveis usados terapeuticamente em outros grupos taxonômicos que também podem ser usados de forma confiável em um número de espécies de anfíbios (tabela 1). Hormônio liberador de gonadotropina (GnRH) e gonadotropina coriónica humana (HCG) (ou variações do mesmo, ou seja, pMsg e ECG)17,18, individualmente ou em combinação, têm sido amplamente utilizados em cativeiro anfíbios programas de melhoramento, incluindo: o sul da montanha rochosa boreal (anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; o sapo, sapo dusky Gopher, Rana sevosa (Langhorne et al., inéditos)7; a costa do Golfo Waterdog, Necturus beyeri20; Sapo de Wyoming, anaxyrus do18; a rã-touro, Rana catesbiana21; o sapo americano, Anaxyrus americanus22; a rã de capim, lymnodyaster Edwardsina23; o coqui, Eleutherodactylus coqui24; Xenopus, Xenopus laevis25; o toadlet de Gunther, Pseduophryne guentheri26; a rã do leopardo do Norte, Lithobates pipiens; o argentino Horned-Frog, Ceratophrys ornamentado; o Cranwell ' s Horned-Frog, C. cranwelli; a terra-rã americana, Odontophrynus americanus27; e o salamandra do fogo (salamandra)228. Hormônios esteroides, como a progesterona (P4), são menos comumente relatados, mas demonstraram boa eficácia na elicificação da ovulação e oviposição em algumas espécies de anãs16,18,29. As prostaglandinas (especialmente a prostaglandina 2-alfa (PGF2α)) estão envolvidas na ovulação, juntamente com os corticosteroides30,31,32,34 e atingem níveis elevados durante fase ovulatória31.
Em estudos in vitro, PGF2α é um potente indutor da ovulação31, enquanto in vivo pode induzir a oviposição de ovos retidos em Rana muscosa4,30,32. Extratos hipofisários também são indutores eficazes da ovulação15,16,34; no entanto, as preocupações em torno da biossegurança e o potencial de transmissão de doenças são muitas vezes um impedimento para as colônias de reprodução em cativeiro ao considerar esta abordagem35.
A última seção deste artigo detalha procedimentos cirúrgicos e fornece aproximações alternativas para expandir estudos ovarianos ou auxílio com a definição de patologias reprodutivas. As ovariectomias são mais comumente realizadas em anfíbios para obtenção de oócitos para pesquisa embriológica. No entanto, ele também pode fornecer um remédio para os ovos retidos quando outras opções falham. Embora este procedimento seja invasivo, exigindo total anestesia e incisões para expor as massas de ovos, não requer eutanásia. Além disso, após a ovariectomia parcial, os animais podem fazer uma recuperação completa e continuar a ser reproductivamente ativo após a cirurgia8,36.
Os protocolos descritos abaixo descrevem os métodos invasivos e não invasivos de controle e monitoramento ovariano em anãs e Caudates. As espécies específicas escolhidas para ilustrar técnicas em anãs incluem R. mucosa e X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensise a . mexicanum compreendem as espécies utilizadas para descrever similarmente técnicas em caudates.

<table><tbody><tr><td>Sonda GE logiq Book XP e 8C-RS 4e10 MHz GE Medical Systems</td><td>Sistemas médicos GE</td><td>logiq Book XP</td><td>Ultrassom</td></tr><tr><td>Aloka 500 7,5 mHz linear ou IBEX multifrequência (10-6 mHz) microconvexo</td><td>Sistemas médicos GE</td><td>8C-RS (10 MHz)</td> <td>Sonda de ultrassom</td></tr><tr><td>Seringa de insulina descartável BD U-100 (agulha 28-29 G)</td> <td>Mettler Electronics Corp CA</td><td>Sonigel</td><td>Gel de ultrassom (solúvel em água, sem sal)</td></tr><tr><td><forte>Hormônio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hormônio liberador de gonadotrofina</td><td>BACHEM</td><td>4012028</td><td><forte>sinônimo:</forte> [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetato <forte>abreviação:</forte> GnRH</td></tr><tr><td>Hormônio liberador de hormônio lutenizante</td><td>BACHEM, Sigma-Aldrich</td><td>4033013; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; L1898</td><td>sinônimo: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sal de acetato; [D-Ala6}-LHRH hidrato de sal de acetato <forte>abreviatura:</forte> LHRH</td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana</td><td>BACHEM, Sigma-Aldrich</td><td>4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10</td><td>sinônimo: Gonadotrofina coriônica-&beta; (109-145)(109-119); Coriogonina, HCG (2.500UI, 5.000UI, 10.000UI) <forte>abreviação:</forte> hCG</td></tr><tr><td>Prostaglandina 2&alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P40424;</td><td><forte>sinônimo: < / forte> (5Z, 9 &alfa;, 11 &alfa;, 13E, 15S) -9,11,15-Trihidroxiprosta-5,13-ácido dienóico tris sal, PGF2 e alfa; &menos; Tris; abreviação: PGF2&alpha;</td></tr><tr><td>Hormônio folículo-estimulante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021, F8174</td><td>sinônimo: suíno, ovino abreviação: FSH</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46665; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; P7556</td><td>sinônimo: Vetranal; P4 solúvel em água abreviatura: P4</td></tr><tr><td>Extrato hipofisário</td><td>na</td><td></td><td>sinônimo: Verifique os papéis para derivação de espécies de anfíbios abreviação: PE</td></tr><tr><td>Égua Grávida Gonadotrofina Sérica</td><td>Prospec; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Lee Biosoluções; Sigma-Aldrich</td><td>HOR-272; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 493-10; 9002-70-4</td><td>sinônimo: Égua grávida Gonadotrofina sérica abreviação: PMSG</td></tr><tr><td>Metaclopromida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0763</td><td>sinônimo: 4-Amino-5-cloro-N-[2-(dietilamino)etil]-2-metoxibenzamida, Metoxicloroprocainamida abreviação: MET</td></tr><tr><td>Lucrin</td><td>BACHEM; Sigma-Aldrich</td><td>4033014; &nbsp; &nbsp; L0399</td><td>sinônimo: Acetato de leuprorrelina abreviação: Lucrin</td></tr><tr><td>Lutalyse</td><td>Pfizer</td><td></td><td>sinônimo: PGF2&alpha; - Dinoprost trometamina abreviação: Lut</td></tr><tr><td>Pimozide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1793</td><td><forte>sinônimo:</forte> 1-[1-[4,4-bis(4-fluorofenil)butil]-4-piperidinil]-1,3-dihidro-2H-benzimidazol-2-ona <forte>abreviação:</forte> PZ</td></tr><tr><td>Amphiplex</td><td>veja acima</td><td></td><td><forte>sinônimo:</forte> Hormônio liberador de gonadotrofina + metoclopramida <forte>abreviação:</forte> GnRH + MET</td></tr><tr><td>Ovopel</td><td>Ovopel</td><td>na</td><td><forte>sinônimo:</forte> GnRHa + antagonista do receptor de dopamina (administrado 1 pellet/kg) <forte>abreviação:</forte> Ovo</td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Pentair ecossistemas aquáticos</td><td>Ova10</td><td>sinônimo: Gonadotrofina de salmão + domperidona abreviação: Óvulos</td></tr><tr><td>Domperidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D122</td><td><forte>sinônimo:</forte> 4-(5-Cloro-2-oxo-1-benzimidazolinil)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinil)propil]piperidina <forte>abreviação:</forte> DOM</td></tr></tbody></table>

técnicas reprodutivas para monitoramento e controle ovariano em anfíbios

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

O controle e o monitoramento ovariano em anfíbios requerem uma abordagem multifacetada. Existem várias aplicações que podem induzir com sucesso comportamentos reprodutivos e a aquisição de gametas e embriões para pesquisa fisiológica ou molecular. Os anfíbios contribuem para um-12:45-terço da pesquisa de vertebrados, e de interesse neste contexto é a sua contribuição para o conhecimento da comunidade científica sobre os processos reprodutivos e o desenvolvimento embriológico. No entanto, a maior parte desse conhecimento é derivada de um pequeno número de espécies. Nos últimos tempos, a decimação de anfíbios em todo o mundo exigiu uma intervenção crescente por parte dos conservacionistas. As colônias de recuperação e garantia cativas que continuam emergindo em resposta ao risco de extinção tornam as pesquisas existentes e as aplicações clínicas inestimáveis para a sobrevivência e reprodução de anfíbios mantidos cuidados humanos. O sucesso de qualquer população em cativeiro baseia-se na sua saúde e reprodução e na capacidade de desenvolver descendentes viáveis que levam adiante a mais diversa representação genética de suas espécies. Para os pesquisadores e veterinários, a capacidade de monitorar e controlar o desenvolvimento ovariano e saúde é, portanto, imperativo. O foco deste artigo é destacar as diferentes técnicas reprodutivas assistidas que podem ser utilizadas para monitorar e, quando apropriado ou necessário, controlar a função ovariana em anfíbios. Idealmente, todas as questões reprodutivas e de saúde devem ser reduzidas através de uma adequada criação em cativeiro, mas, como com qualquer animal, questões de saúde e patologias reprodutivas são inevitáveis. Técnicas não invasivas incluem avaliações comportamentais, inspeção visual e palpação e medidas morfométricas para o cálculo de índices de condição corporal e ultrassonografia. Técnicas invasivas incluem injeções hormonais, amostragem de sangue e cirurgia. O controle ovariano pode ser exercido de várias maneiras, dependendo da aplicação exigida e das espécies de interesse.

O estudo da biologia dos anfíbios fornece informações valiosas sobre os processos reprodutivos, fisiológicos, embriológicos e de desenvolvimento que impulsionam os organismos de muitos grupos taxonômicos. Aqui, apresentamos um guia abrangente sobre diferentes metodologias que podem ser usadas para estudar o controle e o monitoramento ovariano em anfíbios.

Técnicas reprodutivas para monitoramento e controle ovariano em anfíbios

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Esta técnica de ovariectomia emprega um procedimento cirúrgico recuperável para a obtenção de oócitos anfíbios para nossa pesquisa médica ou outra aplicação para superar a condição patológica dos óvulos retidos. Não requer eutanásia para obter oócitos anfíbios para fins de pesquisa. De fato, após uma ovariectomia parcial, o sujeito anfíbio pode ser reprodutivamente ativo após a recuperação.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do membro pélvico, coloque um anuran fêmea anestesiado em uma posição dorsal recumbent, e use gaze úmida e estéril para limpar o campo cirúrgico com solução de povidona-iodo por 10 a 15 segundos. Coloque uma cortina de plástico clara e estéril sobre a área cirúrgica e reduza a evaporação mantendo a pele circundante úmida, antes de usar uma lâmina de bisturi número 15 ou 11 para fazer uma incisão de pele perimédia de 3 milímetros no coelomo médio entre os ombros e a cloaca. Use aplicadores com ponta de algodão para aplicar pressão localizada a quaisquer pequenos vasos ao redor da incisão, conforme necessário, e elevar a membrana abdominal para uma incisão de membrana sucessiva.Use retrálires para retrair as incisões e extir esse consumo de uma porção da massa de ovos sem ligar os vasos sanguíneos. Para uma ovaectomia completa, cauterize os vasos sanguíneos circundantes, e use uma sutura mono-filamento para fechar a incisão de ceoliotomia com um padrão de sutura de sempre interrompido. Diferentes espécies anfíbias, como estes Necturus e o sapo de vidro, apresentam diferentes graus de transparência da pele, afetando a capacidade de visualizar seu status reprodutivo transdermicamente.Em algumas espécies, diferenças morfológicas podem ser detectadas entre fêmeas que são ralvidas, versus animais recentemente ovipositados. Neste exemplo, uma moscosa rana fêmea que recentemente ovipositada pode ser distinguida de uma fêmea gravid pela flacidez de sua pele e sua aparência mais fina. Os estágios comportamentais da oviposição em Rana moscosa incluem cortejar, em que um macho persegue ativamente uma fêmea e apiúpida, durante a qual o macho Rana muscosa monta e aperta firmemente nas costas da fêmea.Durante o aplexo, o macho aperta a fêmea de forma suave. Rana muscosa fêmea se move e exibe comportamentos intermitentes de suporte de mão, eventualmente encostado em superfícies que os ovos podem ser presos, enquanto o macho bombeia seu abdômen vigorosamente. Imediatamente após a oviposição, os ovários femininos retornam à categoria estágio um.Durante esse tempo, folículos são difíceis de visualizar ao realizar ultrassom. A segunda fase é representada pelo aparecimento de pontos ecogênicos dispersos por todo o ovário. O estágio três é determinado pela presença de pontos ecogênicos maiores e redondos com centros escuros, indicativos de folículos maduros e gemidos.Nesta avaliação representativa de quatro anos do Necturus feminino cativo, o desenvolvimento de ovos foi elevado, mas a oviposição não foi garantida. Algumas fêmeas com óvulos retidos concomitantes com ganho de líquido na cavidade corporal, apresentaram cintura excessiva e inchaço, juntamente com alguns sinais de vasos sanguíneos estourados, como o mostrado nestes Rana e Necturus afetados. Embora a abordagem cirúrgica possa ser usada para o gerenciamento da patologia ovariana, essa técnica também pode estar envolvida em pesquisas gametas e umbilicais.Após a cirurgia, o praticante pode retornar ao primeiro protocolo descrito neste manuscrito para monitorar a saúde geral contínua do sujeito anfíbio.

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