Name: Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda a técnica de coloração de toda a montagem para visualização 3D do tecido adiposo branco. Este método preserva a arquitetura tecidual e permite estudar interações celulares em condições metabólicas como jejum e obesidade.

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Este trabalho foi financiado por doações de ciências naturais e Conselho de pesquisa engenharia (NSERC) do Canadá, piloto e subsídio de estudo de viabilidade de Banting e Best Diabetes Centre (BBDC), o fundo de arranque SickKids de H-K. S., pesquisa centro programa médico (2015R1A5A2009124) através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, das TIC e futuro planejamento para J-R.K.

Todos os protocolos de animais experimentais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do centro para Phenogenomics (TCP) em conformidade com as normas do Conselho canadense de cuidado Animal. Ratos foram mantidos em ciclos de 12 h claro/escuro e fornecidos com livre acesso à água e comida. 7 mês antiga C57BL/6J camundongos machos foram usados no experimento manchando toda a montagem.
Nota: As seções 1 e 2 estão em ordem cronológica, com seção 3 sendo uma etapa opcional logo após a seção 1. Secção 4 pode ser realizada para analisar a densidade de tamanho e dos vasos sanguíneos dos adipócitos após a conclusão da seção 2.
1. materiais preparação e isolamento de tecido
<ol><li>Prepare-se fresco 1% paraformaldeído (PFA), diluído em 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para fixação de tecidos. Preparar a 0,3% de surfactante não iônico diluído em PBS 1x (doravante referida como PBS-0.3T) para o tecido subsequente etapas de lavagem. Nota: Para cada tecido, preparar cerca de 1,5 mL de 1% PFA para garantir a imersão completa. Volume de fixação pode ser aumentado ou diminuído dependendo do tamanho do tecido. Atenção: Esta etapa é perigosa, como PFA é corrosivo e tóxico. Equipamento de proteção pessoal desgaste (por exemplo, luvas de nitrilo, jaleco, calçados, óculos de segurança) e o punho em uma coifa.</li>
	<li>Eutanásia em animais de acordo com um procedimento aprovado (por exemplo, deslocamento cervical e/ou asfixia de dióxido de carbono). Sem demora, disse o tecido adiposo desejado depósitos (por exemplo, inguinal tecido adiposo branco ou tecido adiposo de perigonadal branco)18.</li>
	<li>Com uma tesoura de dissecação, corte o tecido em um 100 x 15 mm2 placa de Petri em pedaços de aproximadamente 0,5-1 cm de tamanho e mergulhe-os em tubos microcentrifuga preenchidos com 1% PFA. Manter-se no gelo.</li>
</ol>2. montagem de toda a mancha do tecido adiposo branco
<ol><li>Após dissecação completa, mover as amostras de tecido em 1% PFA do gelo a temperatura (RT) por 1h e depois transferir os tecidos para uma placa de cultura de células de 12 ou 24-poços para lavar mais rápido.</li>
	<li>Lave os tecidos com PBS-0.3T, 3 vezes por 5 min cada um em RT em um shaker inclinado em 22 °, com 20 a 25 inclina-se por min como a velocidade. Nota: Utilize esta inclinação e velocidade para todas as etapas subsequentes que envolvam o uso de um agitador. Nota: Se utilizar uma linha de rato multicolor repórter como mT/mG e adicionais mancha do anticorpo não é necessário, o tecido está pronto para microscopia após etapa 2.2.</li>
	<li>Adicionar 0,5 – 1 mL de tampão de bloqueio (5% de soro animal diluído em PBS-0.3T). Colocar a placa no agitador e incubar durante 1 h em RT</li>
	<li>Aspirar a solução de bloqueio e adicionar os anticorpos primários diluídos em PBS-0.3T com 1% de soro de animais.</li>
	<li>Lugar a placa num agitador a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, lave os tecidos com PBS-0.3T 3 vezes por 5 minutos cada em RT</li>
	<li>Use o apropriado anticorpos secundários diluídos em PBS-0.3T. Adicionar 0,5 – 1 soluções de anticorpo secundário mL para cada poço. Embrulhe a placa em folha de alumínio e incube-lo num agitador durante 1 hora a RT Nota: Dilua o anticorpo secundário no escuro para evitar fotobranqueamento.</li>
	<li>Após a incubação do anticorpo secundário, lave com PBS-0.3T duas vezes por 5 min, cada um em RT. as amostras de imagem se uma mancha de lipídios neutros não é desejada. Se a visualização das gotículas lipídicas é necessário usar o lipídio neutro mancha, lave com PBS 1x (sem tensoativo não-iônico) duas vezes, por 5 min cada.</li>
	<li>Após as etapas de lavagem, incubar com a mancha de lipídio neutro diluída com factor de diluição de 1:1500 em PBS 1x por 30 min em RT Os tecidos estão agora prontos para microscopia. Para futura geração de imagens, os tecidos podem ser armazenados nesta solução em 4 ° C. Nota: Qualidade de imagem diminui ao longo do tempo; Portanto, a melhor época para a imagem latente é dentro de 1 ou 2 dias.</li>
	<li>Usando a pinça, coloque o tecido sobre uma lamela de vidro 24 x 60 mm ² e colocá-lo em um sistema de microscópio invertido do laser confocal.</li>
	<li>Se a coloração dos núcleos com DAPI é desejada, adicione 1 a 2 gotas de meio de montagem contendo DAPI para imergir o tecido completamente e evitar a sua secagem.</li>
	<li>Para obter imagens de toda a montagem manchado tecidos em múltiplos planos focais, execute Z-pilhas de 100 – 150 μm em profundidade com 4 – 6 μm-tamanho passo a ampliação desejada.</li>
</ol>3. tecido clareira e Immunolabeling usando iDISCO +
Nota: Este protocolo é baseado em procedimentos previamente publicado9,10,19.
<ol><li>Fixação e pré-tratamento de metanol<ol>
<li>Incube os tecidos em 4% PFA diluído em PBS 1x a 4° C durante a noite em tubos de microcentrifuga de 2 mL. Nota: Deixe os tecidos em tubos de 2 mL para todos os tratamentos seguintes até imagens.</li>
		<li>No dia seguinte, lave os tecidos em 1X PBS três vezes, durante 1 hora num agitador no RT Nota: Este passo pode ser um pausa na ponto de deixar a amostra a noite no RT ou 4 ° C.</li>
		<li>Desidrata os tecidos em RT em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, por 1h cada. Desidratar em metanol 100% em RT por 1 hora, em seguida, transferir os tecidos para fresco 100% de metanol e incubar a 4 C por 1h. Nota: Metanol diluído em água destilada. Durante a incubação de metanol, não há nenhuma necessidade de colocar amostras em uma coqueteleira, enquanto as amostras de tecido são imersos. Atenção: Esta etapa é perigosa, como o metanol é tóxico. É altamente inflamável em chamas. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa. Armazene o metanol de ignição e numa câmara de segurança inflamável.</li>
		<li>Branquear os tecidos com 5% de peróxido de hidrogênio (H2O2; 1 volume de 30% H2O2 diluído em 5 volumes de 100% metanol) durante a noite a 4 ° C. Atenção: 30% de peróxido de hidrogênio é muito perigosa sobre a pele e olhos. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa.</li>
		<li>Hidratar os tecidos em RT em 80%, 60%, 40% e 20% de metanol e 1X PBS, posteriormente, por 1 hora cada.</li>
		<li>Lavar com 0,2% de surfactante não iônico diluído em 1X PBS duas vezes, por 1h cada um agitador no RT</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunolabeling Nota: Encha os tubos de 2 mL contendo o tecido para o topo do tubo com a solução usada em cada etapa para evitar a oxidação do tecido, assim como immunolabeling começa, até que seja concluída a clareira.<ol>
<li>Permeabilize os tecidos incubando-os em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e glicina de 0,3 M a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias. Nota: O tempo de incubação máximo para etapa de permeabilização de 37 ° C é de 2 dias.</li>
		<li>Bloquear os tecidos em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 10% DMSO, soro de burro de 5% e 1% Fc bloco a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias. Nota: O tempo de incubação máximo para a etapa de bloqueio é de 2 dias.</li>
		<li>Incubar os tecidos em anticorpos primários de interesse em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20, 10 µ g/mL heparina, 5% DMSO e 5% de soro de burro a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 4 dias.</li>
		<li>Lavar com 1X PBS, 0,2% polissorbato 20 e 10 µ g/mL heparina, um agitador na RT cinco vezes, cada uma por 1h. Nota: Este passo pode ser um ponto de pausa para deixar amostras durante a noite em RT</li>
		<li>Incubar os tecidos com anticorpo secundário em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20, 10 µ g/mL heparina e 5% de soro de burro a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop por 4 dias. Nota: De passo 3.2.5, todas as amostras precisam ser embrulhado com papel de alumínio para evitar fotobranqueamento de anticorpo secundário.</li>
		<li>Lave tecidos em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20 e 10 µ g/mL heparina, um agitador em RT cinco vezes, de 2h cada. Nota: Este passo pode ser um ponto pausando para deixar as amostras durante a noite no RT</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clearing de tecido adiposo branco e imagens de volume de tecido<ol>
<li>Desidrata os tecidos contidos em tubos de 2 mL incubando em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, cada uma por 1 hora em RT Em seguida, desidrata-se as amostras em metanol 100% duas vezes na RT Nota: Este passo pode ser um ponto pausando para deixar suas amostras em metanol 100% durante a noite no RT</li>
		<li>Incube os tecidos com uma mistura de 2 volumes de DCM para 1 volume de metanol para 3h no RT em uma coqueteleira. Nota: O DCM é volátil. Certifique-se que os tubos são hermeticamente fechados para evitar a evaporação. Atenção: Esta etapa é perigosa. DCM é tóxico após inalação. Exposição prolongada pode causar queimaduras químicas. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas de nitrilo, jaleco, calçados, óculos de segurança). Use uma coifa.</li>
		<li>Incubar os tecidos em 100% DCM duas vezes, durante 15 min cada um agitador no RT</li>
		<li>Incubar em 100% DBE em RT até imagem e para o armazenamento de amostra. Antes de imagem, inverta os tubos várias vezes para misturar as soluções. Nota: Preencha completamente os tubos com DBE para evitar a oxidação, que pode resultar em tecido sem êxito de compensação. Não agite os tubos durante incubação DBE. Atenção: Esta etapa é perigosa. DBE é tóxico. Pode causar irritação dos olhos e pele. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa.</li>
		<li>Imagem da amostra de tecido inteiro com um microscópio de luz que coincide com o índice de refração do DBE solvente orgânico. Execute o Z-empilhamento em uma ampliação desejada e tamanho da etapa para o tecido todo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. exemplos de análise de dados de toda a montagem manchada tecido imagens usando o ImageJ
Nota: Consulte https://imageJ.nih.gov/ij/download.html para obter instruções de download e instalação.
<ol><li>Quantificação da densidade de vasos sanguíneos (Supplementary Figura 2)<ol>
<li>Importe as imagens salvas do canal apenas com vasos sanguíneos imunocoloração para ImageJ. Nota: As imagens para quantificação devem ser consistentes em termos de procedimento de coloração e condição de aquisição de imagem. Reagentes idênticos devem ser usados. O tempo de exposição, intensidade e ampliação devem também ser equivalente ao de imagem do processo20.</li>
		<li>Converta a cor da imagem em preto e branco para quantificação de densidade de vasos sanguíneos. Para fazer isso, sob a aba "Imagem" , selecione o comando "Ajustar" , então a opção de "limiar de cores" . Na "cor do limite" Exibir caixa, escolha "Fundo escuro"20 e selecione "B & W" sob "cor do limite".</li>
		<li>Para medir a porcentagem da área do vaso sanguíneo sinal de contexto, selecione a guia "Analisar" , então o comando "analisar partículas" . Sob a exibição de "partículas analisadas", selecione as opções "resultados claros" e "Resumir" . Clique em "Okey".</li>
		<li>Copie e cole o valor da área sob a guia de Resumo de porcentagem em uma planilha para análise. A porcentagem de área indicará a densidade de vasos sanguíneos. Repita as etapas 4.3.1–4.3.4 para cada imagem individual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação do adipócito tamanho21 (suplementar a Figura 3)<ol>
<li>Importe as imagens salvas dos adipócitos no ImageJ.</li>
		<li>Para definir a escala da imagem, meça o comprimento da escala em pixels, traçando uma linha para a escala com uma distância conhecida na imagem usando a ferramenta seleção em linha reta. Na aba "Analisar" , selecione o comando "definir escala" . A distância da linha que foi traçada antes será automaticamente calculada em pixels.</li>
		<li>Aparecerá a caixa de exibir "definir escala" . Insira a unidade de comprimento e distância conhecida. Selecione "Global" para aplicar a configuração para todas as imagens importadas de escala e clique em "Okey".</li>
		<li>Para escolher a área como o método de medição, sob a aba "Analisar" selecione o comando "definir medições" . Irá aparecer uma lista de opções diferentes para as medições. Selecione a opção "Área" e clique em "Okey".</li>
		<li>Usando a ferramenta de seleção à mão livre, traçar o perímetro de cada adipócito de interesse. Na aba "Analisar" , selecione o comando "Medida (Ctrl + M)" , e a área do adipócito aparecerá. Repita este procedimento para outros adipócitos na imagem. Nota: Para garantir que as medidas exatas, utilize várias imagens para quantificação.</li>
		<li>Copie e cole as medições da área em uma planilha para análise de dados adicional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora as técnicas convencionais como histologia e cryosection oferecem benefícios para observar a estrutura intracelular, manchando toda a montagem fornece uma perspectiva diferente na investigação de tecido adiposo, que permite a visualização 3D de celulares arquitetura do tecido minimamente processado.
Para com êxito executar toda a montagem de coloração, as sugestões a seguir devem ser tida em conta. Depósitos de diferentes de tecido adiposo podem produzir vários resultados de imunocoloraç...

Tecido adiposo é um órgão essencial para o armazenamento de energia e é caracterizado pela dinâmica de remodelação e expansão quase ilimitada1. Além de homeostase de energia, o tecido adiposo também desempenha um papel essencial na secreção de hormônio de mais de 50 adipocinas para modular a função metabólica de corpo inteiro2. Tecido adiposo tem uma arquitectura diversificada composta por vários tipos de células, incluindo os adipócitos maduros, fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico e de células progenitoras dos adipócitos3. Estudos recentes têm mostrado que a obesidade e outras disfunções metabólicas podem significativamente alterar função do tecido adiposo e seu microambiente, que inclui mas não está limitado ao alargamento dos adipócitos, infiltração de células inflamatórias (por exemplo, macrófagos) e disfunção vascular3.
Técnicas morfológicas convencionais como histologia e cryosectioning demonstram várias limitações em estudar Biologia adiposa como etapas longas processamento químico, que pode levar ao tecido encolhimento e estrutura distorção3, 4. Além disso, estas técnicas 2D são insuficientes para observar interações intercelulares exercidas pelos diferentes tipos de células, como as seções obtidas são limitadas a pequenas regiões do tecido inteiro3. Em comparação com os convencionais métodos de imagem fluorescente, manchando toda a montagem não requer etapas adicionais invasivas, tais como incorporação, corte e desidratação; assim, isto evita o problema de diminuir a especificidade do anticorpo. Como tal, é um método simples e eficiente para o tecido adiposo de imagem, com melhor preservação da morfologia dos adipócitos e de estrutura de tecido adiposo total5. Portanto, toda a montagem coloração como uma técnica rápida e barata immunolabeling foi estabelecida para preservar o tecido adiposo arquitetura 3D1,6,7,8.
No entanto, apesar da preservação da morfologia do tecido adiposo, com uso de coloração toda a montagem, esta técnica é ainda incapaz de visualizar estruturas internas sob a superfície de lipídios do tecido. Vários estudos recentes9,10 estabeleceram tecido limpando técnicas combinadas com toda a montagem immunolabeling1,6 , para permitir a visualização 3D abrangente no tecido adiposo. Em particular, redes neurais e a vasculatura densas foram visualizadas em recentes estudos9,10,11,12 com imagem de volume 3D. Com efeito, estudar a plasticidade neural e vascular do tecido adiposo em diferentes condições fisiológicas é essencial para o estudo de sua biologia. Habilitado para Immunolabeling imagem tridimensional da clareira de tecidos de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO +) é um processo composto de pré-tratamento de metanol, immunolabeling e limpeza de opacidade de tecido com reagentes químicos orgânicos diclorometano (DCM ) e dibenzyl de13,de éter (DBE)14. O tecido adiposo, tornando totalmente transparente, uma representação mais precisa da anatomia dentro do tecido, tais como os vasos sanguíneos e fibras neurais pode ser obtida9,10. IDISCO + tem vantagens em que é compatível com vários anticorpos e repórteres fluorescente11,14, e tem demonstrado sucesso em vários órgãos e embriões até14. No entanto, sua principal limitação é um tempo de incubação longa, em que 18 a 20 dias são necessários para completar todo o experimento.
Outra aplicação importante da mancha toda a montagem é a visualização do destino de célula em combinação com um sistema de rastreamento de linhagem. Rastreamento de linhagem é a rotulagem de um gene/marcador específico em uma célula que pode ser transmitida a todas as células da filha e é conservada ao longo do tempo,15. Como tal, é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para determinar o destino de progênie15 de uma célula. Desde a década de 1990, o sistema de recombinação de Cre-LoxP tornou-se uma poderosa abordagem para rastreamento de linhagem em vida organismos15. Quando uma linha de rato que expressa Cre, uma enzima recombinase de DNA, é cruzada com uma outra linha de rato, expressando uma repórter que é adjacente a uma sequência de loxP-STOP-loxP, a proteína de repórter é expressa15.
Para a coloração de toda a montagem, o uso de repórteres multicoloridos fluorescentes é apropriado para a imagem do tecido adiposo, porque permite a mínima interferência com atividades intracelulares do adipócito16. No entanto, repórteres tradicionais normalmente mancham o citoplasma, tornando difícil traçar a linhagem dos adipócitos brancos, que têm limitado a conteúdo citoplasmático17. Para superar este problema, o uso do marcador de repórter eGFP (mT/mG) membrana-limite tdTomato fluorescente/membrana é uma ferramenta ideal. TdTomato membrana-alvo é expressa em células de Cre-negativo18. Após excisão de Cre, ocorre um interruptor para a expressão da membrana-alvo eGFP, tornando este repórter adequado para rastreamento da linhagem do adipócito progenitores17,18 (Complementar a figura 1).
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para montagem em toda a coloração e mostrar como ele pode ser combinado com outras técnicas para estudar o desenvolvimento e a fisiologia do tecido adiposo. Dois exemplos de aplicativos descritos no presente protocolo são seu uso com linhas de rato 1) multicolor repórter para identificar várias origens de adipócitos e 2) tecido de compensação para visualizar mais a arborização neural no tecido adiposo branco (WAT).

<table><tbody><tr><td>LipidTox</td><td>Life Technologies</td><td>H34477</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1 anticorpo primário</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z(CH)</td><td></td></tr><tr><td>TH (tirosina hidroxilase) anticorpo primário</td><td>Millipore</td><td>AB152, AB1542</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mancha</td><td>BD Pharmingen</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscópio confocal</td></tr><tr><td>Ultramicroscópio I</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>Light imagem de folha microscópio fluorescente</td></tr><tr><td>Alexa Fluor anticorpos secundários</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Comprimentos de onda 488, 594 e 647 usados</td></tr><tr><td>Rato purificado Anti-Mouse CD16 / CD32</td><td>BioSciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzil-éter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>30% Peróxido de hidrogênio</td><td>BIO BASIC CANADA INC</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J7126</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Kit de lectina I, fluoresceína rotulado</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>FLK-2100</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497GA</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Montagem Média com DAPI</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salino (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro animal (cabra, burro)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualização da estrutura 3d tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Tecido adiposo é um órgão metabólico importante com alta plasticidade e é sensível ao status de nutrientes e estímulos ambientais. Como tal, desenvolveram-se várias técnicas para estudar a morfologia e biologia do tecido adiposo. No entanto, métodos de visualização convencionais limitam-se a estudar o tecido em seções 2D, falhando capturar a arquitetura 3D do órgão inteiro. Aqui nós apresentamos toda a montagem, um método de imuno-histoquímica que preserva a morfologia intacta tecido adiposo com etapas de processamento mínimo de coloração. Portanto, as estruturas de adipócitos e outros componentes celulares são mantidas sem distorção, alcançar a visualização em 3D mais representativa do tecido. Além disso, toda a montagem de coloração pode ser combinado com métodos de rastreamento de linhagem para determinar as decisões de destino de célula. No entanto, esta técnica tem algumas limitações para fornecer informações precisas sobre as partes mais profundas do tecido adiposo. Para contornar essa limitação, montagem de toda a mancha pode ainda ser combinada com tecido técnicas para remover a opacidade do tecido e permitir a completa visualização da anatomia de todo tecido adiposo usando microscopia fluorescente luz-folha de compensação. Portanto, uma maior resolução e uma representação mais precisa das estruturas de tecido adiposo podem ser capturados com a combinação dessas técnicas.

Devido a fragilidade do tecido adiposo, métodos que envolvem várias etapas de processamento e corte podem levar à desfiguração do tecido adiposo morfologia3 (figura 1A). No entanto, toda a montagem de coloração pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo a exata interpretação dos resultados (figura 1B).
Fixação do excesso de tecido adiposo leva a autofluorescência induzida pelo fixador. Como mostrado...

O foco do presente estudo é demonstrar a técnica de imunocoloração e visualização de toda a montagem como um método ideal para tratamento de imagens 3D do tecido adiposo celular e arquitetura de componente.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia adiposa, como como as interações intercelulares e a fisiologia do tecido adiposo mudam em diferentes condições metabólicas, como jejum e obesidade. A principal vantagem desta técnica é que ela preserva de forma ideal a estrutura 3D adiposa original e evita longas etapas de processamento que geralmente são necessárias para a imunohistoquímica convencional. Embora este método possa fornecer uma visão da estrutura do tecido adiposo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos, como o sistema nervoso, por meio de toda a coloração do cérebro.Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido às dificuldades em obter locais de tecido imobiliário, encontrar o período de fixação adequado e as concentrações ideais de anticorpos. Após a dissecação completa, transfira o prato contendo as amostras de tecido em 1%paraformaldeído do gelo para a temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, transfira os tecidos para uma placa de cultura celular de 12 ou 24 poços para uma lavagem mais rápida.É importante lembrar que o procedimento de coloração de todo o montagem deve começar imediatamente após a dissecação e que não há pontos de pausa entre cada etapa. Lave os tecidos com PBS-0,3T em um agitador inclinado a 22 graus com uma velocidade entre 20 e 25 inclinações por minuto à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes adicionais.Depois disso, adicione aproximadamente 0,5 a um mililitro de tampão de bloqueio contendo 5% de soro animal. Incubar a placa em um shaker usando as condições anteriores durante uma hora. Aspire a solução de bloqueio e adicione o mililitro de anticorpos primários diluídos em PBS-0.3T com soro animal de 1% para cada poço.Incubar a placa durante a noite em um agitador a quatro graus Celsius com uma inclinação de 22 graus e uma velocidade de 20 a 25 inclinações por minuto. No dia seguinte, use PBS-0.3T para lavar os tecidos à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes adicionais.Em seguida, adicione entre 0,5 e um mililitro de soluções de anticorpos secundários apropriadas e diluídas a cada poço. Enrole a placa em papel alumínio e incuba-a em um shaker à temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, lave a placa duas vezes com PBS-0,3T em temperatura ambiente por cinco minutos por lavagem.Se for necessária a visualização de gotículas líquidas durante a mancha lipídica neutra, lave duas vezes com 1x PBS a cada lavagem com duração de cinco minutos. Adicione a mancha lipídica neutra diluída na PBS e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Para começar a imagem, use fórceps para colocar o tecido plano em um deslizamento de tampa de vidro de 24 por 60 milímetros.Se for desejada a coloração dos núcleos com DAPI, adicione uma a duas gotas de um meio de montagem que contenha DAPI para submergir completamente o tecido e evitar que ele seque. Em seguida, coloque o slide em um sistema de microscópio a laser confocal invertido. Para obter imagens de tecido manchado de montagem inteira em vários planos focais, realize pilhas Z de 100 a 150 micrômetros de profundidade com tamanho de passo de quatro a seis micrômetros na ampliação desejada.Neste estudo, a coloração de montagem inteira é usada para preservar a arquitetura de tecido adiposo. Ao contrário de métodos que envolvem múltiplas etapas de processamento e secção, que podem levar à desfiguração da morfologia tecidual adiposa, o método de coloração de todo o montagem pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo precisão na interpretação dos resultados. A superfixação do tecido adiposo leva à fluorescência induzida por fixação, que pode ser indicada por regiões idênticas sobrepostas, como nos sinais de hidroxilase de tirasina e PECAM-1 vistos aqui.Amostras de manchas de montagem total devidamente fixas, no entanto, mostram sinais separados e distintos, indicando que esses sinais não são autofluorescência. A imagem de tecido adiposo manchado de montagem total permite a quantificação de alterações morfológicas em diferentes condições experimentais. Em particular, o tecido adiposo é altamente vascularizado, o que é importante na mediação da homeostase metabólica sobre rápidas mudanças no nível de energia.Por exemplo, os camundongos C57 pretos 6J, que passam por 24 horas de jejum, apresentam um tamanho de adipócito significativamente menor, o que indica lipólise, e uma tendência na densidade elevada dos vasos sanguíneos quando comparados com camundongos continuamente alimentados. Limpar tecidos adiposos com iDISCO+permite que os tecidos adiposos se tornem opticamente transparentes. A imunolabelação do tecido adiposo que passou pela limpeza tecidual mostra arborização neural muito mais densa em comparação com a observada em coloração de montagem inteira sem limpeza tecidual na mesma ampliação.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não sobrefixar suas amostras por mais de uma hora em temperatura ambiente em PFA, caso contrário, isso aumentará a autofluorescência de fundo. No entanto, esse período de fixação pode ser prolongado se as amostras forem fixadas a quatro graus Celsius. Após esse procedimento, outros métodos como quantificação utilizando ImageJ, podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como como a arquitetura celular, como sítios adipócitos e densidade dos vasos sanguíneos, mudança em resposta a várias condições fisiológicas.

visualization-3d-white-adipose-tissue-structure-using-whole-mount

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

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Aprenda a técnica de coloração de toda a montagem para visualização 3D do tecido adiposo branco. Este método preserva a arquitetura tecidual e permite estudar interações celulares em condições metabólicas como jejum e obesidade.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

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