Um sistema BW repórter para estudar interações ligante-Receptor
7 de janeiro de 2019
Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de repórter que pode ser usado para identificar e quantificar as interações ligante-receptor.
Shalom.O BW Reporter System permite estudar interações receptor-ligantes. É extremamente útil nos casos em que o ligante de um receptor específico é desconhecido ou nos casos em que os experimentos com o ligante endógeno são tecnicamente difíceis. Este método é sensível e específico para um receptor individual, fácil de operar e reprodutível.
Demonstrando o procedimento será Shira Kahlon, um pós-doutor para o meu laboratório. Um dia antes da transfecção, placa 10 placas com 10 mililitros de 100.000 células BW5147, e complementar um RPMI. Em seguida, coloque 100 microgramas do plasmídeo pcDNA3 em um tubo.
Adicione acetato de sódio no pH 5.3 ao tubo. Depois disso, adicione 2,5 volumes de 100% de etanol à mistura plasmida. Em seguida, incubar a mistura plasmida durante a noite a menos 20 graus Celsius.
24 horas depois de emplacar as células BW, colete as células em dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar as células a 515 g's por cinco minutos, e descartar o supernasce. Resuspenque o pelotão RPMI sem adições e repita a centrifugação.
Resuspende a pelota resultante em 1 mililitro de RPMI sem adições. Transfira a pelota resuspended para uma pepa de 4 centímetros no gelo. Centrifugar o plasmídeo que sofreu precipitação de etanol.
Em seguida, lave o plasmídeo com um mililitro de 70% de etanol. E repita a centrifugação por mais 20 minutos. Retire todo o etanol e deixe a pelota secar parcialmente.
Em seguida, resuspenque a pelota em 100 microliters de RPMI pré-aquecido, sem adições. Depois disso, adicione o plasmídeo resuspended às células em cuvet. Incubar as células no gelo por cinco minutos.
Em seguida, eletroporar as células. Em seguida, transfira as células eletroporadas para um tubo de 50 mililitros. Adicione 50 mililitros de meio completo ao tubo e centrífuga por cinco minutos, a 515 g's.
Descarte o supernasce e resuspenque as células em 50 mililitros de meio completo. Em seguida, emplaque as células em 24 pratos de cultura, e incubar as células por 48 horas. Depois disso, adicione um mililitro de meio completo, suplementado com 10 miligramas por mililitro de G418 para cada poço.
48 horas depois, descarte um mililitro do volume superior de cada poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo suplementado com cinco miligramas por mililitro de G418 para cada poço. Use 50.000 células BW transfeinadas com seus alvos desejados, em um único poço de uma placa de 96 poços.
Incubar a placa por 48 horas. Em seguida, congele a placa a menos 20 graus Celsius. Cubra uma placa ELISA com anticorpo IL-2 anti-rato.
Coloque 05 microgramas de IL-2 anti-rato, em um volume de 50 microliters de PBS em cada poço. Incubar a placa revestida durante a noite a quatro graus Celsius. Use um breve período de incubação a 37 graus Celsius, para descongelar as células BW congeladas, que foram previamente incubadas com seus alvos.
Em seguida, centrifufique a placa e transfira 100 microliters do supernante de cada poço para a placa ELISA pré-revestida. E incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Depois disso, adicione biotina anti-rato IL-2 à placa ELISA.
Em seguida, após a incubação e lavagem, adicione o streptavidin conjugado hrp à placa. Após a incubação e lavagem, adicione 100 microliters da solução de substrato TMB, a cada poço da placa ELISA. Por fim, leia a placa ELISA em 650 nanômetros.
Neste exemplo, as células LLC foram pré-incubadas com diferentes anticorpos anti-CD20. E então co-incubado com células BW transfectadas que expressam os receptores Fc CD16, antes de serem analisados com ELISA. Após análise com ELISA os resultados foram quantificados.
Os níveis de densidade óptica foram convertidos em concentrações de IL-2 do mouse, com base na curva padrão. Em um experimento adicional, diferentes doses de anticorpos anti-CD20 foram pré-incubadas com células LLC. E então incubado com as células BW transfeinadas.
A partícula contém quatro partes principais. Clonagem, transfecção de células BW, ativação e ELISA. Cada uma das peças deve ser verificada independentemente.
Após esse procedimento, experimentos adicionais podem ser realizados com células que expressam os receptores endógenos, como matar ácidos com células NK para estudar interações com receptores de células NK. Usamos este sistema para descobrir novos ligantes de receptores de células NK. Por exemplo, hemagglutinina é um ligante de NKp46, e PVL é um ligante de TG.
Visão Geral
Este artigo descreve o Sistema Repórter BW, um método sensível e específico para estudar interações receptor-ligante, especialmente quando o ligante é desconhecido ou difícil de manipular. O sistema utiliza células de camundongo BW5147 transfectadas com um construto de receptor quimérico, permitindo a quantificação da ativação do receptor por meio da secreção de interleucina-2 (IL-2) detectada por ELISA. Essa abordagem facilita a análise da ativação do receptor por diversos ligantes, incluindo anticorpos e moléculas da superfície celular.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
Contexto
- As interações receptor-ligante são fundamentais para muitos processos biológicos.
- Experimentos diretos com receptores e ligantes nativos podem ser desafiadores devido a ligantes desconhecidos ou dificuldades técnicas.
- Sistemas repórter podem fornecer detecção sensível e específica da ativação de receptores.
- São necessários ensaios quantitativos para medir os níveis de ativação de receptores.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e demonstrar um sistema repórter para detectar interações receptor-ligante.
- Permitir a quantificação da ativação do receptor mesmo quando o ligante é desconhecido.
- Fornecer um método reprodutível e de fácil operação para estudos de receptores.
Métodos Utilizados
- Clonagem do domínio extracelular de um receptor específico fundido à CD3ζ de camundongo.
- Transfecção de células de camundongo BW5147 com o construto do receptor quimérico utilizando eletroporação.
- Seleção de células transfectadas com o antibiótico G418.
- Incubação de células BW transfectadas com células-alvo ou anticorpos.
- Medição da IL-2 murina secretada utilizando ELISA como leitura da ativação do receptor.
Resultados Principais
- O sistema repórter detecta com sucesso a ativação de receptores específicos por diversas ligantes.
- A medição quantitativa da secreção de IL-2 correlaciona-se com os níveis de ativação do receptor.
- O sistema foi utilizado para estudar a ativação de receptores Fcγ humanos por anticorpos anti-CD20 em células de LLC.
- Os resultados podem ser padronizados utilizando a densidade óptica para conversão em concentração de IL-2 por meio de curvas-padrão.
Conclusões
- O Sistema Repórter BW é uma ferramenta robusta para analisar interações receptor-ligante.
- É aplicável mesmo quando o ligante é desconhecido ou difícil de usar experimentalmente.
- O método é sensível, específico e permite análise quantitativa da ativação do receptor.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O Sistema Repórter BW permite a investigação sensível e quantitativa de interações receptor-ligante, mesmo quando o ligante é desconhecido ou tecnicamente desafiador. Essa capacidade atende um gargalo crítico na descoberta inicial e na validação de alvos, fornecendo uma plataforma reprodutível e escalonável para estudos funcionais de ativação de receptores. O sistema apoia a redução de riscos em toda a carteira e acelera a confiança mecanicista em pontos-chave de inflexão no desenvolvimento de biológicos e anticorpos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a validação funcional da ativação de receptores por diversos ligantes, incluindo ligantes desconhecidos.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao isolar eventos específicos de ativação do receptor.
- Facilita o triagem rápida de alvos candidatos com base em perfis quantitativos de ativação.
- Fornece uma leitura padronizada para a investigação de vias orientada por hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma saída quantitativa e reprodutível baseada em ELISA para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Permite a padronização de ensaios e a reprodutibilidade entre laboratórios em estudos de receptor-ligante.
- Permite a avaliação escalonável de anticorpos ou candidatos a ligantes baseados em células.
- Prepara sistemas biológicos validados para avaliação de compostos com alta confiabilidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de ativação de receptores com terapias com anticorpos ou células relevantes para a doença.
- Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica do engajamento funcional do receptor.
- Apoia o avanço de candidatos biológicos ajustado ao risco com base em limiares quantitativos de ativação.
- Permite o desenvolvimento de biomarcadores translacionais quando a ativação do receptor é um desfecho-chave.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este sistema de repórter se adequa desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica, fornecendo uma plataforma reutilizável para a investigação funcional de receptores e ligantes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas ao quantificar a ativação do receptor em resposta a ligantes candidatos.
- Triagem: Oferece saídas padronizadas e quantitativas de ELISA para comparar a eficácia e especificidade de ligantes.
- Análises: Permite a conversão da densidade óptica em concentração de IL-2 para análise estatística robusta entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e estudos pré-clínicos ao validar o engajamento funcional de alvos terapêuticos.
- Reutilização Corporativa: Fornece um sistema modular e adaptável para diversos estudos de receptor-ligante em diferentes programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece ensaios padronizados, reprodutíveis e escaláveis de ativação de receptores.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao permitir triagem funcional precoce.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos a biológicos e anticorpos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento em clonagem molecular e transfeção celular para a geração de receptores quiméricos.
- Necessita acesso a instrumentação de ELISA e infraestrutura analítica para leituras quantitativas.
- Exige padronização entre equipes nas condições do ensaio e nos fluxos de análise de dados.
- Adaptável a diversos tipos de receptores e fontes de ligantes, incluindo anticorpos e moléculas da superfície celular.
- Depende da verificação independente de cada componente do fluxo de trabalho para resultados robustos.
