Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Este método pode ajudar a resolver um obstáculo chave no campo do isolamento e sequenciamento de um único neurônio. Como a coleta de população específica ou uma subpopulação de neurônio fluorescente rotulado da área cerebral definida pelo usuário. A principal vantagem dessa técnica é que ela garante que o único neurônio de interesse seja capturado sem contaminar detritos.

Também é relativamente suave, o que é importante para tipos de neurônios frágeis que morrem rapidamente quando submetidos às pressões fluidas da classificação FACS convencional. Comece preparando microcapillarias de vidro puxados com diâmetro de saída de 10 a 15 mícrons usando um puxador capilar. Use uma tesoura fina para cortar a ponta do capilar para obter o diâmetro desejado da placa.

Em seguida, use conectores de tubulação para anexar um comprimento de 120 a 150 centímetros de tubulação flexível de silicone com 0,8 milímetros de diâmetro interno a um filtro de seringa de membrana PVDF de 0,2 mícal e uma válvula de tubulação bidirecional. Prepare 500 mililitros de fluido espinhal cerebral artificial resfriado ou ACSF e oxigene por borbulhar 5% de dióxido de carbono de oxigênio equilibrado através de uma Pedra aérea por 15 minutos ou até que a solução se esclae completamente. Prepare três béquers de 150 mililitros cada um contendo 100 mililitros de ACSF.

A um, adicione um coquetel de bloqueadores de atividade. Por outro, adicione fração de Streptococcus para protease a uma concentração final de um miligrama por mililitro. Ao béquer final, adicione FBS a uma concentração final de 1% e oxigene com oxigênio balanceado com 5% de dióxido de carbono através de uma pedra aérea.

Finalmente, faça três pipetas Pasteur de haste longa com diâmetros de saída decrescentes, rolando-as sobre uma chama aberta. Disseque o cérebro de um rato eutanizado abrindo o crânio com uma pequena tesoura e extraindo o cérebro fresco usando fórceps finos sem danificar o córtex. Coloque o cérebro em ACSF refrigerado e oxigenado deixando uma Pedra de Ar presa a oxigênio balanceado com dióxido de carbono de 5% durante toda a duração da secção.

Posicione o cérebro sobre o mandril vibratome e corte as seções coronal ou sagital a 300 mícrons de espessura. Colete quantas seções necessários para obter um mínimo de 10 a 50 células rotuladas. Coloque fatias em um suporte de fatia de algodão colocado dentro de um béquer para que eles sejam banhados em ACSF oxigenado.

Mova as fatias para o béquer contendo ACSF com bloqueadores de atividade e bloqueie por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente enquanto borbulha oxigênio usando uma pedra aérea. Mova as fatias para o béquer contendo ACSF com a solução protease para realizar uma digestão leve à temperatura ambiente. Após a digestão, lave o protease movendo fatias de volta para o béquer contendo ACSF com solução de bloqueador de atividade por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente.

Continue borbulhando oxigênio. Em seguida, prepare uma placa de Petri de 100 milímetros contendo ACSF com 1%FBS à temperatura ambiente e mova seções individuais para o disco para microdisseção. Sob um escopo de dissecções fluorescentes, use um par de fórceps finos para micro dissecar áreas e camadas de interesse com um mínimo de 10 a 50 células.

Usando uma pipeta Pasteur, mova as peças micro-dissecadas para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo aproximadamente 0,8 mililitros de 1% FBS na solução ACSF. Titular o tecido dissecado no tubo de microfusão à temperatura ambiente. Realize aproximadamente 10 tacadas com cada uma das pipetas Pasteur flamedas começando com as maiores e terminando com o menor diâmetro de saída.

Distribua as células dissociadas em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo ACSF oxigenado e espere de cinco a sete minutos para que as células se instalem gradualmente. Observe o sinal GFP e RFP sob um microscópio de dissecção. Identifique os detritos examinando a morfologia sob iluminação de campo brilhante.

Uma vez que uma área de células com pequenos detritos tenha sido identificada, use o capilar e conecte-se à tubulação para colher células bloqueando a extremidade da válvula de tubulação com a língua. Em seguida, posicione o capilar perto das células. Solte o bloco no capilar e bloqueie rapidamente novamente para capturar a célula usando ação capilar.

Mova o capilar para uma placa de Petri de 100 milímetros com ACSF oxigenado fresco e sopre suavemente no tubo enquanto observa a ponta capilar sob a óptica fluorescência para distribuir as células no prato. Repita o procedimento de coleta até que 100 a 150 células sejam coletadas, certificando-se de que os contaminantes, como os detritos, sejam mínimos em óptica de contraste de interferência diferencial de campo brilhante. Finalmente, usando uma pipeta micro-capilar fresca cada vez, escolha uma única célula e expulse-a em no máximo 0,5 microlitros em um tubo micro-fuge de 0,2 microliter contendo um microliter de tampão de coleta de amostras com primers.

Quebre a ponta da pipeta no tubo de microfusão para garantir que a célula permaneça no tampão de coleta. Congele as células colocando os tubos em gelo seco. Armazene em um congelador Celsius de menos 80 graus até o processamento para amplificação de RNA.

Os neurônios GABAérgicos foram isolados do córtex cingulet do cérebro do camundongo. O RNA amplificado a partir dos neurônios manualmente classificados variou entre 200 e 4.000 pares de base em tamanho com uma distribuição de pico ligeiramente acima de 500 pares de base. Após a purificação das contas, a biblioteca cDNA é ainda maior restrita por uma segunda rodada de purificação usando contas para eliminar fragmentos com menos de 200 pares de base e para o pico em aproximadamente 350 pares de base.

O sequenciamento mostrou uma média de 4,8 vezes 10 para a 5ª mediana ou 6,9 vezes 10 para a 5ª média de leituras mapeadas por célula. Após a remoção duplicada do RNA usando UMIs, cada célula tinha uma média de 1,0 vezes 10 para a 5ª mediana ou 1,4 vezes 10 para a 5ª média de leituras únicas por célula. Em cada consórcio de controles externos de RNA de células únicas, o pico no RNA foi usado como controle interno para calcular o número absoluto de moléculas adicionadas à amostra.

Houve uma relação linear de entrada com contagem observada com inclinação de 0,92 e quadrado R ajustado de 0,94. Uma média de cerca de 10.000 genes por único neurônio foram detectados usando este procedimento com mais de 95% das células únicas detectando mais de 6.000 genes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os biólogos moleculares explorarem o transcriptome de estagiários cortical de camundongos bem caracterizados, e identificaram categorias genéticas selecionadas que são responsáveis pela codificação da identidade celular.