Name: Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a isolar neurônios fluorescentes do mouse usando classificação manual para sequenciamento de ARN de célula única. Este método permite capturar populações específicas sem contaminação e preservar neurônios frágeis para análise transcriptômica de alta profundidade.

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Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (5R01MH094705-04 e 01-R01MH109665 para Z.J.H.), pelo fundo de neurociência CSHL Robertson (para Z.J.H.) e por um NARSAD Doctoral Fellowship (para A.P.).

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Autores declaram que não há nenhum concorrentes interesses financeiros.

O manual de classificação protocolo é apropriado para uma sequenciação do ARN supervisionada de neurônio populações que são escassamente rotulada do cérebro de ratos ou estão representando uma população de células raras que caso contrário, não é viável para estudar usando a célula atual da elevado-produção métodos de triagem e amplificação. As células submetidas a FACS geralmente sofrem pressões de linha bainha e amostra na faixa de ~ 9 – 14 psi, dependendo do tamanho do bocal e desejado taxas de evento. Além disso, após...

A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) transformou-se estudos de transcriptomic. Enquanto em grande escala RNAseq de célula única pode ser executada usando uma variedade de técnicas, como as gotas1,2, Microfluido3, nanogrids4e micropoços5, a maioria dos métodos não pode classificar tipos de células definidas que expressam fluorophores geneticamente codificado. Para isolar uma população selecione a célula, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é frequentemente usada para classificar as pilhas etiquetadas em um modo de célula única. No entanto, FACS tem algumas restrições e requer etapas de processamento de amostra meticuloso. Em primeiro lugar, um grande número de células de entrada é normalmente necessários (muitas vezes vários milhões de células / mL), com uma fração significativa (> 15 – 20%) contendo a população rotulada. Em segundo lugar, preparações da pilha podem exigir várias rodadas de etapas de centrifugação gradiente de densidade para remover fração glia, detritos e aglomerados de células que caso contrário podem obstruir o bocal ou fluxo de célula. Em terceiro lugar, FACS geralmente emprega a coloração e descoloração passos para viver/morrer coloração (por exemplo, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), iodeto de propidium (PI) e corantes Cytotracker), que ocupam tempo adicional. Em quarto lugar, como uma regra de ouro para duas cores classificação (como DAPI e proteína fluorescente verde/vermelho (GFP/RFP)), geralmente duas amostras e um controle são necessários, exigindo uma amostra sem rótulo para ser processado além da estirpe do mouse desejado. Em quinto lugar, a filtragem é frequentemente realizada várias vezes antes e durante a amostra classificação para proativamente evitar linhas de exemplo obstruído em uma máquina de FACS. Em sexto lugar, o tempo deve ser atribuído em configurações de FACS mais comumente usadas para inicializar e estabilizar o fluxo de fluido e realizar a calibração da gota. Sétimo, controle de amostras geralmente são executadas em sequência antes da colheita de amostra real para criar matrizes de compensação, rejeição de gibão, definindo portões, etc. os usuários também executar as etapas 6 e 7 se antes do tempo ou exigir o assistência de um técnico em paralelo. Finalmente, post-FACS, muitas vezes há medidas para assegurar que somente rotulado única células estão presentes em cada poço; por exemplo, verificando as amostras em uma configuração de alto teor de triagem como um gerador de imagens de prato rápido.
Para contornar as etapas descritas acima e facilitar um relativamente rápida, alvo de sequenciamento de uma pequena população de neurônios fluorescente etiquetadas único, descrevemos um manual de classificação procedimento seguido por duas rodadas de um altamente sensíveis em vitro Protocolo de amplificação, chamado dobro da transcrição in vitro com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq). A geração de biblioteca de amplificação e do cDNA de RNA é adaptada de Eberwine et al . 6 e Hashimshony et al . 7, com certas modificações para atender interneurônios rato que têm volumes menores de celulares; Além disso, encontramos também é igualmente útil para excitatórios neurônios piramidais.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibidor de Ribonuclease Recombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fragmentação de RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase antártica</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotídeo quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase2, truncado</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp contas magnéticas</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselecione o tamanho das contas magnéticas</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Cat# 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1078</td><td></td></tr><tr><td>Protease de Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5147</td><td></td></tr><tr><td>Mensagem Kit Amp II</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA kit</td><td>Illumina</td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalisador RNA Pico chip Agilent</td><td></td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalisador Chip de DNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalisador 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção com fluorescência e iluminação de campo brilhante com óptica DIC.&nbsp; (Leica modelo MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Modelo MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Microcapilar de vidro: Tubos capilares de borossilicato 500/pk. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, parede= 0,21 mm, Comprimento= 150 mm.</td><td>Warner instruments</td><td>Modelo GC100-15, Pedido # 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipeta capilar</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de resfriamento de tecido vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>65</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenciação do arn de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do mouse usando a classificação manual e duplo in vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (diva-seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) agora é uma ferramenta amplamente implementada para análise de expressão gênica. Plataformas de sequenciação do ARN monocelulares comercialmente disponíveis processam tudo entradas células indiscriminadamente. Às vezes, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é usada contra a corrente para isolar uma população especificamente rotulada de interesse. Uma limitação de FACS é a necessidade de números elevados de células entradas com frações significativamente rotuladas, que é impraticável para coleta e criação de perfil de populações raras ou escassamente rotulada neurônio do cérebro do rato. Aqui, descrevemos um método para manualmente coletando esparsas fluorescente etiquetado único neurônios de recém dissociado tecido de cérebro de rato. Este processo permite a captura de neurônios com rótulo único com pureza elevada e subsequente integração com um em vitro protocolo de amplificação baseada na transcrição que preserva os rácios de transcrição endógena. Nós descrevemos um método de amplificação linear duplo que usa identificadores da molécula original (UMIs) para gerar contagens individuais do mRNA. Duas rodadas de resultados de amplificação em um alto grau de deteção de gene por uma única célula.

Usando o protocolo descrito acima, gabaérgica neurônios manualmente foram classificados (Figura 1) e RNA amplificado, depois foi transformado em uma biblioteca de cDNA (Figura 2) e sequenciado em alta profundidade8. Os produtos amplificados do RNA (aRNA) variaram entre 200 – 4.000 bp em tamanho, com uma distribuição de pico ligeiramente acima de 500 bp (Figura 3A). A bibliotec...

Este protocolo descreve o manual de procedimento para isolar o único neurônios fluorescente etiquetados seguidos em vitro baseada na transcrição de amplificação do mRNA para a sequenciação do ARN de alta profundidade única célula de triagem.

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Este método pode ajudar a resolver um obstáculo chave no campo do isolamento e sequenciamento de um único neurônio. Como a coleta de população específica ou uma subpopulação de neurônio fluorescente rotulado da área cerebral definida pelo usuário. A principal vantagem dessa técnica é que ela garante que o único neurônio de interesse seja capturado sem contaminar detritos.Também é relativamente suave, o que é importante para tipos de neurônios frágeis que morrem rapidamente quando submetidos às pressões fluidas da classificação FACS convencional. Comece preparando microcapillarias de vidro puxados com diâmetro de saída de 10 a 15 mícrons usando um puxador capilar. Use uma tesoura fina para cortar a ponta do capilar para obter o diâmetro desejado da placa.Em seguida, use conectores de tubulação para anexar um comprimento de 120 a 150 centímetros de tubulação flexível de silicone com 0,8 milímetros de diâmetro interno a um filtro de seringa de membrana PVDF de 0,2 mícal e uma válvula de tubulação bidirecional. Prepare 500 mililitros de fluido espinhal cerebral artificial resfriado ou ACSF e oxigene por borbulhar 5% de dióxido de carbono de oxigênio equilibrado através de uma Pedra aérea por 15 minutos ou até que a solução se esclae completamente. Prepare três béquers de 150 mililitros cada um contendo 100 mililitros de ACSF.A um, adicione um coquetel de bloqueadores de atividade. Por outro, adicione fração de Streptococcus para protease a uma concentração final de um miligrama por mililitro. Ao béquer final, adicione FBS a uma concentração final de 1% e oxigene com oxigênio balanceado com 5% de dióxido de carbono através de uma pedra aérea.Finalmente, faça três pipetas Pasteur de haste longa com diâmetros de saída decrescentes, rolando-as sobre uma chama aberta. Disseque o cérebro de um rato eutanizado abrindo o crânio com uma pequena tesoura e extraindo o cérebro fresco usando fórceps finos sem danificar o córtex. Coloque o cérebro em ACSF refrigerado e oxigenado deixando uma Pedra de Ar presa a oxigênio balanceado com dióxido de carbono de 5% durante toda a duração da secção.Posicione o cérebro sobre o mandril vibratome e corte as seções coronal ou sagital a 300 mícrons de espessura. Colete quantas seções necessários para obter um mínimo de 10 a 50 células rotuladas. Coloque fatias em um suporte de fatia de algodão colocado dentro de um béquer para que eles sejam banhados em ACSF oxigenado.Mova as fatias para o béquer contendo ACSF com bloqueadores de atividade e bloqueie por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente enquanto borbulha oxigênio usando uma pedra aérea. Mova as fatias para o béquer contendo ACSF com a solução protease para realizar uma digestão leve à temperatura ambiente. Após a digestão, lave o protease movendo fatias de volta para o béquer contendo ACSF com solução de bloqueador de atividade por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente.Continue borbulhando oxigênio. Em seguida, prepare uma placa de Petri de 100 milímetros contendo ACSF com 1%FBS à temperatura ambiente e mova seções individuais para o disco para microdisseção. Sob um escopo de dissecções fluorescentes, use um par de fórceps finos para micro dissecar áreas e camadas de interesse com um mínimo de 10 a 50 células.Usando uma pipeta Pasteur, mova as peças micro-dissecadas para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo aproximadamente 0,8 mililitros de 1% FBS na solução ACSF. Titular o tecido dissecado no tubo de microfusão à temperatura ambiente. Realize aproximadamente 10 tacadas com cada uma das pipetas Pasteur flamedas começando com as maiores e terminando com o menor diâmetro de saída.Distribua as células dissociadas em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo ACSF oxigenado e espere de cinco a sete minutos para que as células se instalem gradualmente. Observe o sinal GFP e RFP sob um microscópio de dissecção. Identifique os detritos examinando a morfologia sob iluminação de campo brilhante.Uma vez que uma área de células com pequenos detritos tenha sido identificada, use o capilar e conecte-se à tubulação para colher células bloqueando a extremidade da válvula de tubulação com a língua. Em seguida, posicione o capilar perto das células. Solte o bloco no capilar e bloqueie rapidamente novamente para capturar a célula usando ação capilar.Mova o capilar para uma placa de Petri de 100 milímetros com ACSF oxigenado fresco e sopre suavemente no tubo enquanto observa a ponta capilar sob a óptica fluorescência para distribuir as células no prato. Repita o procedimento de coleta até que 100 a 150 células sejam coletadas, certificando-se de que os contaminantes, como os detritos, sejam mínimos em óptica de contraste de interferência diferencial de campo brilhante. Finalmente, usando uma pipeta micro-capilar fresca cada vez, escolha uma única célula e expulse-a em no máximo 0,5 microlitros em um tubo micro-fuge de 0,2 microliter contendo um microliter de tampão de coleta de amostras com primers.Quebre a ponta da pipeta no tubo de microfusão para garantir que a célula permaneça no tampão de coleta. Congele as células colocando os tubos em gelo seco. Armazene em um congelador Celsius de menos 80 graus até o processamento para amplificação de RNA.Os neurônios GABAérgicos foram isolados do córtex cingulet do cérebro do camundongo. O RNA amplificado a partir dos neurônios manualmente classificados variou entre 200 e 4.000 pares de base em tamanho com uma distribuição de pico ligeiramente acima de 500 pares de base. Após a purificação das contas, a biblioteca cDNA é ainda maior restrita por uma segunda rodada de purificação usando contas para eliminar fragmentos com menos de 200 pares de base e para o pico em aproximadamente 350 pares de base.O sequenciamento mostrou uma média de 4,8 vezes 10 para a 5ª mediana ou 6,9 vezes 10 para a 5ª média de leituras mapeadas por célula. Após a remoção duplicada do RNA usando UMIs, cada célula tinha uma média de 1,0 vezes 10 para a 5ª mediana ou 1,4 vezes 10 para a 5ª média de leituras únicas por célula. Em cada consórcio de controles externos de RNA de células únicas, o pico no RNA foi usado como controle interno para calcular o número absoluto de moléculas adicionadas à amostra.Houve uma relação linear de entrada com contagem observada com inclinação de 0,92 e quadrado R ajustado de 0,94. Uma média de cerca de 10.000 genes por único neurônio foram detectados usando este procedimento com mais de 95% das células únicas detectando mais de 6.000 genes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os biólogos moleculares explorarem o transcriptome de estagiários cortical de camundongos bem caracterizados, e identificaram categorias genéticas selecionadas que são responsáveis pela codificação da identidade celular.

single-cell-rna-sequencing-fluorescently-labeled-mouse-neurons-using

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um método para isolar neurônios marcados com fluorescência do cérebro de um camundongo.

Isolando neurônios marcados com fluorescência de um cérebro murino

O RNA total de alta qualidade foi preparado a partir de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser após a coloração de seções da medula espinhal com Azure B em 70% de etanol. RNA suficiente (~40-60 ng) é recuperado de 3.000-4.000 neurônios motores para permitir a análise de RNA a jusante por RNA-seq e qRT-PCR.

Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Este protocolo combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única para isolar e caracterizar os estados das células microgliais no cerebelo de cérebros de camundongos pós-natais precoces. Ele usa dissociação enzimática, centrifugação de Percoll e imunocoloração para revelar a heterogeneidade da microglia e melhorar a compreensão de seus papéis no desenvolvimento e doença cerebelar.

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Aprenda a isolar neurônios fluorescentes do mouse usando classificação manual para sequenciamento de ARN de célula única. Este método permite capturar populações específicas sem contaminação e preservar neurônios frágeis para análise transcriptômica de alta profundidade.

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq) (Vídeo) | JoVE Journal

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

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