Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

Esse método deve ser de interesse para pesquisadores que estão tentando isolar complexos proteicos de RNA e identificar sua composição por espectrometria de massa. Acreditamos que nosso protocolo será especialmente útil para purificar complexos que existem em células em quantidades limitadas e tendem a dissociar durante longos procedimentos de purificação em várias etapas. A principal vantagem deste método é que ele envolve apenas uma única etapa de purificação e poderia ser usado com locais de ligação de RNA de qualquer comprimento e sequência.

Demonstrando alguns dos passos será Xiao-cui Yang, que é um técnico sênior de pesquisa em nosso grupo. Para sites de vinculação significativamente maiores que 65 nucleotídeos, obtenha RNA gerado por T7 e um oligonucleotídeo pcb adaptador conforme descrito no protocolo de texto. Misture 20 picomoles do RNA com 100 picomoles do oligonucleotídeo adaptador em um tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microliters de tampão de ligação.

Coloque o tubo em água fervente e deixe incubar por 5 minutos. Em seguida, deixe a água esfriar até a temperatura ambiente. Primeiro suplemento 1 mililitro de extrato nuclear de rato com 80 mililitros EDTA no pH 8 para uma concentração final de 10 mililitros.

Em seguida, adicione entre 5 e 10 picomoles do substrato RNA que foi marcado com o pcb moiety. Incubar no gelo por 5 minutos, certificando-se de misturar ocasionalmente a amostra. Em seguida, use um microcentrifuge pré-resfriado a 4 graus Celsius para centrifugar a mistura a 10.000 vezes g por 10 minutos para remover eventuais precipitados.

Colete cuidadosamente o supernatante em um novo tubo no gelo, enquanto tome cuidado para evitar a transferência da pelota. Transfira aproximadamente 100 microliters de streptavidin agarose bead suspensão para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione aproximadamente 1 mililitro de tampão de ligação para começar a lavar as contas.

Centrifugar o tubo a 25 vezes g por 2 a 3 minutos e aspirar o supernasal. Repita este processo de lavagem e centrifugação de 2 a 3 vezes para equilibrar as contas com o buffer de ligação. Carregue o supernante coletado anteriormente, que contém o complexo montado sobre as contas equilibradas.

Usando um rotador de tubo, gire o tubo por 1 hora a 4 graus Celsius para imobilizar o RNA e enloucotado nas contas. Em seguida, gire o tubo a 25 vezes g por 2 a 3 minutos para coletar as contas na parte inferior do tubo. Aspire o supernatante.

E enxágüe as contas duas vezes com tampão de ligação, usando o processo de lavagem descrito anteriormente. Depois de remover o supernascimento da segunda lavagem, adicione 1 mililitro de tampão de ligação e gire a amostra por 1 hora a 4 graus Celsius. Gire a amostra a 25 vezes g por 2 a 3 minutos.

Em seguida, adicione 1 mililitro de tampão de ligação e transfira a suspensão para um novo tubo. Gire a amostra a 4 graus Celsius por até 1 hora. Centrifugar os complexos imobilizados a 25 vezes g por 2 a 3 minutos.

Em seguida, aspirar supernascer e adicionar 200 microliters de tampão de ligação. Transfira as contas para um tubo de 500 microliter. Ligue uma lâmpada UV de alta intensidade que emite luz UV a 365 nanômetros e permita que ela atinja o brilho total.

Encha o fundo de uma placa de Petri com gelo bem embalado empilhando-o sobre a tampa do prato. Brevemente vórtice do tubo contendo os complexos imobilizados. Em seguida, coloque-o horizontalmente sobre o gelo e cubra-o com a lâmpada pré-aquecida, certificando-se de que a amostra está a 2 a 3 centímetros da superfície da lâmpada.

Irradie a amostra por um total de 30 minutos, invertendo e vórtice com frequência o tubo para garantir a exposição uniforme e evitar o superaquecimento. Depois disso, gire as contas a 25 vezes g por 2 a 3 minutos e colete o supernatante. Centrifugar este supernatante mais uma vez usando as mesmas condições.

Colete o supernante resultante certificando-se de deixar uma pequena quantidade na parte inferior do tubo para evitar a transferência de quaisquer contas residuais. Usando eletroforese SDS-PAGE, separe uma fração do supernanato elucido UV e a fração correspondente do material deixado nas contas após a eluição uv. Em seguida, use um kit de coloração de prata comercialmente disponível para manchar o gel.

Avalie a eficiência da elução UV comparando as intensidades das proteínas presentes no supernanato elucido UV e as deixadas nas contas após a irradiação UV. Extirpe as faixas de proteína de interesse e determine suas identidades por espectrometria de massa. Depois disso, analise diretamente uma fração do supernante UV elucido por espectrometria de massa para determinar todo o proteome do material purificado de forma imparcial.

Neste estudo, o RNA de alça-tronco marcado com biotina foto-cleavável é incubado com 1 mililitro de um extrato citoplasmado S100 obtido a partir de células de mieloma de camundongos. E o efeito e eficiência da elução UV é analisado pela coloração de prata. Uma série de proteínas são detectadas nas contas de streptavidina antes da eluição UV.

A irradiação com UV de ondas longas libera apenas algumas dessas proteínas no supernante deixando um fundo não específico sobre as contas. Isso enfatiza a importância da etapa de eluição UV. A espectrometria de massa identifica as principais proteínas elucidadas UV como 3'hExo e SLBP com SLBP sendo representado tanto pela proteína de comprimento completo quanto por uma série de produtos de degradação mais curtos.

Quantidades menores de outras proteínas identificadas como várias proteínas de ligação de RNA também foram seletivamente liberadas em solução pela irradiação UV. A elução UV de histona de drosophila imobilizada pre-mRNA marcada com biotina foto-cleavável incubada com um extrato nuclear resultou em uma liberação seletiva de apenas um pequeno número de proteínas no sobrenante com um intenso fundo de proteínas não específicas remanescentes nas contas. A espectrometria de massa identifica essas proteínas como componentes do U7 snRNP.

Eles não são detectados na presença de concorrentes de processamento que bloqueiam a vinculação do U7 snRNP ao histone pré-mRNA. É importante usar lâmpada UV de alta intensidade e colocá-la a uma distância próxima à amostra irradiada, ao mesmo tempo em que certifica-se de que ela não superaquece. O método de elução UV produz complexos proteicos RNA nativos que não possuem contaminantes importantes e são diretamente adequados para etapas adicionais de purificação e ensaios funcionais.

Evite a exposição aos olhos e à pele durante a irradiação UV.