Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Nosso método de colheita de células epidérmicas de camundongos adultos é útil para aplicações a jusante, como células-tronco queratinócitos. Nossa técnica é altamente reproduzível e pode ser utilizada em conjunto com procedimentos in vivo em camundongos no contexto do modelo de carcinogênese da pele. Depois de colher amostras de pele dorsal de camundongos adultos eutanizados, use fórceps autoclavados e um bisturi para colocar uma pele dorsal de cada vez lado peludo em uma fina placa de Petri e raspar o tecido subcutâneo, incluindo a gordura do tecido da pele ventral até que o tecido seja semi-translúcido.

Coloque a pele raspada em PBS até que todas as outras peles restantes sejam processadas. Em seguida, use um bisturi para cortar as amostras de pele em tiras de 0,5 por um a 1,5 centímetros. Coloque as tiras do lado peludo em uma placa de Petri estéril antes de flutuar as amostras lado peludo para cima na superfície de um PBS de 20 mililitros mais duas soluçãos x gentamicina, suplementada com 0,25% de trippsina em uma placa de plástico 100 por 20 milímetros petri por duas horas a 32 graus Celsius.

No final da incubação, coloque uma placa de Petri estéril, de plástico e quadrado contendo 15 mililitros de meio de colheita a uma inclinação de 30 graus e use fórceps curvos para transferir cuidadosamente uma faixa de pele flutuante para o prato. Segurando uma nova lâmina de bisturi em um ângulo perpendicular à pele e usando força suficiente, mas não excessiva, raspe a epiderme e os cabelos da amostra para o meio. Quando todas as tiras tiverem sido raspadas, decante cuidadosamente a célula epidérmica contendo supernacido em um frasco estéril de 60 mililitros contendo uma barra de agitação magnética de 1,5 polegadas e enxágue a placa de Petri com meio de colheita adicional para coletar quaisquer células epidérmicas restantes.

Leve o volume final no frasco para 30 mililitros com meio fresco, e mexa a solução de célula epidérmica a 100 rotações por minuto durante 20 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação de agitação em um armário de biossegurança remova a barra de agitação e filtre a solução celular através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Use fórceps e, em seguida, uma pipeta para pressionar os cabelos e os materiais de córnea estrato através do coador para manipular o tecido para liberar as células ciliadas presas e usar mais cinco mililitros de meio de colheita para liberar as células ciliadas presas no tubo.

É fundamental que as células epidérmicas e os cabelos sejam manipulados de modo a liberar as células dos folículos capilares. Leve o volume total do tubo até 50 mililitros com meio fresco e colete a filtragem celular por centrifugação. Resuspend a pelota em 5 mililitros de meio de colheita fresca em cerca de 20 triturações com uma pipeta de 5 mililitros.

Pegue 0,5 mililitros da diluição de um a 20 e transfira-o para um tubo de microfuça de 2 mililitros. Depois de misturar a amostra cuidadosamente, pegue 200 microliters do tubo de microfuge e misture suavemente com um volume igual de 0,4% de solução azul trypan. Misture suavemente esta solução três vezes e transfira as células para um hemótmetro para contar queratinócitos nucleados.

Escore todas as células azuis escuras como células inviáveis e escore pequenas células de ouro e rosado como células viáveis. A viabilidade é de cerca de 80% e o rendimento final de queratinócito por rato deve ser de cerca de 30 milhões de células viáveis. Após a contagem, colete as células com outra centrifugação, e para a cultura de massa resuspend de duas a quatro vezes 10 para o sexto queratinócito viável por placa de Petri de 35 milímetros em 2 mililitros de cultura celular média.

Para um ensaio de formação de colônia clonogênica, resuspenncie as células em uma única vez 10 a 3 queratinócitos por quatro mililitros de William's E Medium modificados com suplementos em concentração de soro por placa de Petri revestida de 60 milímetros em raios-X irradiadas camadas de alimentador suíço 3T3. Para a cultura de massa, cresça as culturas a 32 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono para o período de cultura celular apropriada. Mudando o meio 24 horas após a semeadura inicial para a cultura de massa e três vezes por semana depois.

No final da cultura clonal aspiram o meio e fixam as colônias em formalina 10% tamponada durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, manche as colônias com 0,5% de rhodamina B em água autoclavada por uma hora, antes de enxaguar os pratos em água autoclavada fria até que a água se esclaneça. Em seguida, incline os pratos em suas tampas para secar antes de contar as colônias.

Aqui, resultados típicos da formação de colônias de queratinócitos ensaios após vários tratamentos tópicos são mostrados. As células-tronco do folículo piloso normalmente compõem aproximadamente 9% das células isoladas da pele dorsal do rato C57BL/6 adulto, conforme avaliado pela coloração citométrica de fluxo para marcadores de células-tronco do folículo piloso do rato. Nesta figura podem ser observadas as características de crescimento das colônias de células-tronco queratinócitos após a cultura em quatro condições médias diferentes.

Após este procedimento, as células podem ser usadas para citometria de fluxo, classificação celular ativada por fluorescência, cultura celular e análises biológicas moleculares. Essa técnica nos permitiu determinar que o número de células-tronco epidérmicas é um traço quantitativo e complexo que leva à identificação de um novo gene regulatório de células-tronco.