Name: Um ensaio de transporte Rhodopsin por análise de imagem de alto teor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprenda um ensaio de imagem de alto teor para quantificar o transporte de rodopsina mutante em células. Este método permite triagem em alta vazão e avaliação rápida de farmacodinâmica no desenvolvimento de tratamentos para retinite pigmentosa.

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Agradecemos o Dr. Mark E. Schurdak e Universidade de Pittsburgh Drug Discovery Institute para fornecer o sistema de imagem de alto teor e treinamentos iniciais. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartilhados B630 antianticorpos rodopsina e 4 a 1. O plasmídeo contendo o cDNA do rato rodopsina-Venus construção foi partilhado pelo Dr. Nevin Lambert (Universidade de Augusta). Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de saúde grant EY024992 YC e P30EY008098 de grant do núcleo de pesquisa de visão de Universidade de Pittsburgh.

Nota: O rodopsina transporte ensaio.
1. preparação e cultura de células
<ol><li>Reviva a crio-preservados U2OS estáveis celulas que expressam o tipo selvagem (WT) ou proteínas de fusão de rodopsina-Venus rato mutante. Descongele as células a 37 ° C, até que somente os cristais de gelo pequenos são deixados no frasco. Nota: As células U2OS são utilizadas neste protocolo porque não há nenhuma linhagem de células fotorreceptoras disponível para estudos em vitro e pre-ciliar biossíntese de rodopsina é regulada por mecanismos moleculares similares em células de mamíferos. Além disso, as células U2OS anexar firmemente a parte inferior da placa e tem grandes corpos celulares, então eles são ideais para o ensaio de transporte rodopsina. Sete U2OS estáveis células expressando o WT T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N e P267L os mutantes rodopsina são utilizados aqui como um exemplo para mostrar a qualidade e a confiabilidade do ensaio. Células estáveis expressando outros mutantes de rodopsina ou outras proteínas de membrana podem ser usadas, dependendo do objetivo do ensaio. Células estáveis, expressando a rodopsina humana podem ser usadas neste ensaio, se disponível. A rodopsina rato foi usada aqui porque mouse e proteínas rodopsina humana compartilham homologia de 95%, e os compostos identificados por este ensaio será testado na vivo usando um modelo de rato adRP carregando a rodopsina P23H mutação8. As células estáveis foram geradas conforme descrito anteriormente,19. A WT e mutante rodopsina transcrições foram quantificadas por q-PCR, e os clones de células estáveis expressando níveis semelhantes de WT e mutante rodopsina transcrições foram selecionados para este ensaio. A expressão de proteínas de rodopsina foi confirmada por immunoblot e imunocoloração. A passagem de células utilizadas neste ensaio deve ser inferior a 20.</li>
	<li>Transferi cada linha de células para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL do meio de crescimento (glicose alta Dulbecco modificado do águia meio (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 5 µ g/mL Plasmocin).</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 200 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio de crescimento celular para cada linha de celular. Cada linha de suspensão de células de transferência em um prato de cultura de tecidos de 60mm e incubar a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>As células quando o prato de cultura de tecidos atinge 90% confluência como descritas na referência12de subcultura.</li>
</ol>2. células em 5.000 células por poço de semeadura
Nota: Execute os procedimentos a seguir em uma capa de cultura de tecidos.
<ol><li>Trate a placa com poli-lisina.<ol>
<li>Um dia antes da semeadura das células, tratar de uma parede de preto e limpar a placa de 384-poço fundo com 20 µ l/poço de solução de poli-lisina por 30 min.</li>
		<li>Aspire o líquido e permitir que todos os poços secar por 1 h. colocar de volta a tampa da placa e armazenar a placa a 4 ° C durante a noite para a propagação de célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a suspensão de eritrócitos.<ol>
<li>Cultura de cada linhagem de células em meio de crescimento em um prato de cultura de tecidos de 100 mm até confluência de 90%.</li>
		<li>Lavar cada prato com solução salina tamponada fosfato (PBS) e separar as células com 1 mL de 0.05% tripsina a 37 ° C.</li>
		<li>Resuspenda cada linha de células em 10 mL do meio de ensaio (alta-glicose DMEM com 10% FBS, 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 μg/mL).</li>
		<li>Contar as células e diluir cada linha de células para 1,25 x 105 células/mL com o doseamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>As células da semente.<ol>
<li>Use uma pipeta multicanal eletrônica ou um dispensador de reagente automatizado para dispensar a 40 µ l/poço de suspensão de células para três colunas por linha celular e preenchimento colunas 1-21 da placa de 384 (Figura 2).</li>
		<li>Adicionar 40 µ l/poço de U2OS (P23H-Rhodopsin-Vênus) para colunas 22-23 e 40 µ l/poço de U2OS (rodopsina-Venus) a coluna 24, como controles.</li>
		<li>Centrifugue a placa a 300 x g durante 30 s para derrubar todas as células para o fundo da placa a 384. Nota: Evite choque físico a placa após a semeadura da célula. Caso contrário, as células serão esmagadas para um canto de cada poço, e a placa não será adequada para a imagem latente de alto teor.</li>
		<li>Incube a placa de 384 a 37 ° C com 5% de CO2 para 3h para as células anexar a parte inferior da placa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tratando as células com compostos
<ol><li>Gere um mapa de placa com condições de tratamento, como mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Prepare 300 µ l de 5 x soluções de trabalho de até 15 compostos em uma placa de 96 poços.<ol>
<li>Dilua o cps 1 a 15 com o doseamento de cinco vezes de suas concentrações finais de 96-poço em poços A1 para G2 da placa (Figura 2A). Adicione 300 µ l de doseamento em H2 bem. Nota: A concentração final de cada composto é usada na concentração mais eficaz para resgatar o transporte de rodopsina a P23H pela HTS12,13.</li>
		<li>Adicione 100 µ l por alvéolo de 2% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e 25 µM 9 -cis-retinal que são diluídas no meio do ensaio de colunas 11 e 12, respectivamente. Adicionar 9 -cis-retinal com pouca luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 10 µ l por alvéolo de 5x trabalhar soluções para a placa de 384 cultivadas com as células (Figura 2B).<ol>
<li>Use uma pipeta multicanal eletrônica para adicionar compostos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15 linhas A, C, E, G, eu, K, M e O de colunas 1 a 21 (Figura 2). Adicionar compostos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e M para linhas B, D, F, H, J, L, N e P de colunas 1 a 21.</li>
		<li>Adicione 10 µ l por alvéolo de 2% DMSO para colunas 22 e 24. Adicionar 10 µ l por alvéolo de 25 µM 9 -cis-retinal a coluna 23. Nota: DMSO é usado como um controle do veículo, porque todos os compostos são inicialmente dissolvidos em DMSO como estoques. Coluna 22 contendo DMSO Tratado células expressando o P23H rodopsina é usada como o controle de 0%. 9 -Cis-retinais células tratadas expressando a rodopsina P23H é usado como o controle de 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cobrir a placa de 384 com folha de alumínio e incubar a placa a 37 ° C por 24 h.</li>
</ol>4. imunocoloração sem permeabilização da membrana para manchar a rodopsina proteína na superfície das células.
Nota: Evite qualquer detergente no processo inteiro de imunocoloração para manter a membrana celular intacta.
<ol><li>Preparar o paraformaldeído 4% (PFA) diluindo os 16% PFA com PBS em uma relação de volume de 1:4 em uma coifa de química. A 4% de transferência PFA em um reservatório de reagente.</li>
	<li>Retire a placa de 384 em um quarto escuro com pouca luz vermelha. Use um aspirador de 8 canais ligado a uma garrafa de vácuo coleção para aspirar delicadamente o meio. Usar uma pipeta multicanal eletrônica para adicionar 20 µ l por bem preparadas 4% PFA para a placa inteira de 384 e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Para evitar o desprendimento de células, aponte sempre as dicas do aspirador para o mesmo lado de cada poço durante as aspirações. Não toque na área de meio fundo de cada poço. Quando a tomada de imagens, selecione campos para evitar a região tocada pelo aspirador. Para incubação do mais de 10min, cobrir a placa de 384 com a tampa para evitar evaporação. Nota: As células são fixos em um quarto escuro para evitar fotobranqueamento do isorhodopsin regenerada que afetará o resultado do controle de 100%. Após a fixação da placa de 384 pode ser retirada sob luz normal.</li>
	<li>Use um aspirador de 8 canais para aspirar o PFA em cada poço e usar uma pipeta multicanal eletrônica para adicionar 50 μL por poço de PBS. Repita mais duas vezes para executar três lavagens com PBS. Cuidado: Os resíduos líquido contendo PFA são coletado em um frasco tampado e é para ser tratado como um desperdício de químico perigoso após a experiência.</li>
	<li>Bloquear as células adicionando 20 µ l por alvéolo de 5% de soro de cabra para a placa inteira de 384 e incubar a temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Aspirar o soro de cabra de 5% e adicionar 15 µ l por alvéolo de 20 anticorpo de anti-rodopsina B6-30 alimentação de folhas µ g mL-1 em 1% de soro de cabra para linhas À. Adicionar 15 µ l por alvéolo de 1% de soro de cabra a linha P para o grupo controle somente anticorpo secundário.</li>
	<li>Incube a placa de 384 à temperatura de 90 min ou a 4 ° C durante a noite. Cubra a placa com folha de alumínio para evitar fotobranqueamento do fluorophores 384.</li>
	<li>Lave a placa 3 vezes com 50 μL por poço de PBS.</li>
	<li>Aspire PBS e adicionar 15 µ l por alvéolo de 5 µ g mL-1 de caprinos Cy3 conjugados anti-rato anticorpo IgG. Cobrir a placa de 384 com folha de alumínio e incubar à temperatura ambiente durante 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lave a placa 3 vezes com 50 μL por poço de PBS. Adicione 50 μL por poço de PBS contendo 1 µ g mL-1 Hoechst 33342 manchar núcleos em temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Selo da placa de 384 com uma película transparente antes de imagem. Cobrir a placa de 384 com papel alumínio e armazene a 4 ° C por até uma semana se imagens são tomadas imediatamente.</li>
</ol>5.. de imagem
Nota: Este procedimento de imagem de alto teor é adaptado para o sistema de imagens constantes da Tabela do Material. Os procedimentos podem ser diferentes se usando outros sistemas de imagem de alto teor.
<ol><li>Retire a tampa e colocar a placa de 384 o tonalizador de alto teor com A1 posicionado no canto superior esquerdo da placa.</li>
	<li>Abra o software de aquisição de imagem para configurar parâmetros para aquisição de imagens.<ol>
<li>Abra a janela de configuração de aquisição de placa e criar nova configuração ou carregar um arquivo de configuração existente.</li>
		<li>Selecione o objetivo de 20x e configurar pixel binning como 2, então o tamanho do pixel calibrado é 0,80 x 0,80 µm. definir as linhas de varredura como 2.000 e o tamanho da imagem (W x H) como 1.000 x 1.000 pixels (800,00 x 800,00 µm) por site.</li>
		<li>Selecione o tipo de chapa a ser fotografada. Use as informações fornecidas pelo fabricante da placa de 384-bem para preencher as dimensões da placa.</li>
		<li>Selecione os poços para criação da imagem para a placa de 384.</li>
		<li>Selecione quatro sites para ser fotografada por bem. Evite o lado do bem tocado pelas pontas de aspiração.</li>
		<li>Selecione lasers de excitação como 405, 561 e 488 nm. Selecione Filtros de emissão para canais DAPI, FITC e Texas Red. Otimizar a potência do laser e os ganhos de cada canal para garantir o brilho das imagens tiradas dos poços de controle positivo são inferiores ao limiar de saturação.</li>
		<li>Selecione o foco a bem para focagem automática. Selecione o primeiro poço que adquiriu como o inicial bem para encontrar amostras. Definir o local autofocus para todos os sites.</li>
		<li>Selecione as quatro médias por linha para cada canal. Otimize o valor de Z-deslocamento para cada canal.</li>
		<li>Teste 2-3 poços nos cantos diagonais da placa bem 384 para certificar-se de que as imagens estão em foco para todos os poços testados, imagens de todos os sites por alvéolo têm células com mais de 40% de confluência e intensidades de fluorescência de todos os canais são cerca de metade saturada em 100% controle de poços.</li>
		<li>Salve o método de aquisição de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o prato inteiro. Cuidado com a câmera até que termine a captura de imagens da primeira coluna da placa para verificar a qualidade da imagem antes de deixar a câmera. Retire a placa de 384 e armazenar a 4 ° C para uso futuro. Nota: Dependendo do número de sites seleccionados por bem e os canais de tomadas, demora 40 min até 3 h para terminar a imagem de uma placa de 384.</li>
</ol>6. imagem análise.
<ol><li>Pull dos dados de imagem usando um software de análise de imagem de alto teor. Selecione um dos poços para configurar parâmetros de controle de 100% (coluna, 23).</li>
	<li>Selecione o Comprimento de onda multi célula marcando como método de análise e começar a configurar as configurações.<ol>
<li>Defina os núcleos usando imagens do canal DAPI. Visualização para certificar-se de que as formas de núcleos definidos no selecionado bem se encaixa bem com as imagens de núcleos.</li>
		<li>Defina a forma da célula no canal FITC onde rodopsina-Venus é fotografada.</li>
		<li>Defina as áreas de superfície mancha de célula rodopsina no canal vermelho Texas.</li>
		<li>Teste o algoritmo atual em 5 poços para determinar se as configurações são otimizadas. Salvar as configurações e fechar a janela de configuração .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute todos os poços com o método de análise otimizada.</li>
	<li>Exporte o Objeto número como número de célula intacta. Exporte a Intensidade média do canal FITC como intensidade Rhodopsin-Venus (rodopsina-Venus INT). Exporte a Intensidade média do canal vermelho Texas como intensidade de rodopsina na superfície das células (rodopsina INT na superfície das células).</li>
	<li>Abra os dados exportados em um software de planilha eletrônica. Divida a intensidade de rodopsina na superfície das células pela rodopsina-Venus INT como razão para MEM-total. Calcular o Z'-fatores para cada parâmetro para avaliar a qualidade do ensaio. Z′ = 1−3X (STDcontrolar 100%+STD0% controle) / | 100% controle−Meancontrole 0%|. Nota: Um Z'-fator maior do que 0 indica um ensaio moderado suficiente para uma tela de alto teor e um Z' fator entre 0,5 e 1 sugere um excelente ensaio exigido para uma tela de alta produtividade de20,21.</li>
	<li>Use o software de planilha para gerar um mapa de calor de duas cores para cada parâmetro. Organize o nome de linhas celulares no eixo x e os compostos no eixo y.</li>
</ol>

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<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, nós mostramos um ensaio de alto teor de imagem usado para caracterizar sucessos identificados de um HTS A automação única envolvido nestes protocolos é o gerador de imagens de alto teor. A imunocoloração e imagem latente de fluorescência da rodopsina têm sido utilizados comumente para caracterizar a localização de rodopsina5,14,15,16. No entanto, a quantificação das imagens captadas pelos...

Enrolamento de proteínas está envolvido na distrofia muscular, neurais Espinocerebelares, bem como doenças cegantes, incluindo retinite pigmentosa (RP)1. RP é uma degeneração da retina herdada e progressiva, associada com mutações em mais de 60 genes que afetam a função e a homeostase dos FOTORRECEPTORES de haste ou os epitélios pigmentado da retina (RPEs)2,3. Não há tratamento eficaz está atualmente disponível para RP. Rhodopsin mutações representam cerca de 25-30% de autossômica dominante (ad) casos RP. Entre os mais de 150 rodopsina mutações4 (humano Gene mutação de banco de dados, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), as mutações de classe II causam a instabilidade estrutural da proteína rodopsina que contribui para a morte de fotorreceptoras de haste e visão perda5,6,7,8. O P23H é a mutação mais frequente de rodopsina na América do Norte, que também é um exemplo típico da classe II rodopsina mutações9,10. Devido à sua inerente instabilidade estrutural, a rodopsina misfolded é acumulada no retículo endoplasmático (ER) em células de mamíferos, Considerando que a rodopsina tipo selvagem está localizada na membrana plasmática5. A rodopsina misfolded P23H exposições mutante dominante citotoxicidade negativa que não é devido a haploinsuficiência, mas está relacionada com a ativação de ER associado via de degradação de proteínas e a organização do segmento externo haste interrompido. Para aliviar o stress de células fotorreceptoras haste, uma estratégia é estabilizar o dobramento nativo da rodopsina mutante usando um acompanhante farmacológico.
Para atingir este objetivo, realizamos uma tela de alta produtividade baseada em célula (HTSs)11,12,13 usando um ensaio de complementação do fragmento de β-galactosidase para quantificar o mutante de rodopsina P23H transportado no plasma membrana. O protocolo robusto e simples deste ensaio HTS permitiu-nos explorar as atividades de cerca de 79.000 pequenas moléculas para cada tela. No entanto, porque este ensaio HTS lê sinais de luminescência, falsos positivos incluindo os inibidores de β-gal, compostos coloridos ou citotóxicos constam da lista à espera de ser identificado por um ensaio secundário.
O tradicional imunocoloração e métodos da imagem latente de fluorescência tenham usados por anos para estudar o transporte de rodopsina em células de mamíferos5,14,15,16. No entanto, estes métodos convencionais não podem ser usados para quantificar os efeitos farmacológicos de mais de 10 compostos para transporte de rodopsina, porque uma análise confiável de imagem requer um grande número de imagens tiradas sob uma condição altamente consistente, que é não alteráveis pelos métodos convencionais de imagem. Aqui, nós desenvolvemos um protocolo de imagem de alto teor de imunocoloração com base como um ensaio secundário para quantificar o transporte de superfície de célula de misfolded rodopsina mutantes11,13,17. Para rotular rodopsina na membrana plasmática, passámos a etapa de permeabilização da membrana celular e immunostained os mutantes rodopsina por um anticorpo monoclonal (B6-30) antirodopsina reconhecendo o epítopo do N-terminal da rodopsina ao lado extracelular da célula membrana de18. Para visualizar o rhodopsin mutante na célula inteira, nós fundidos rodopsina com a proteína de fluorescência de Venus. Pela quantificação das intensidades de fluorescência em canais de fluorescência diferentes, somos capazes de obter vários parâmetros de uma única experiência, incluindo a intensidade total rodopsina na célula inteira, na superfície da célula e a proporção de fluorescência de rodopsina na superfície da pilha, para que, na célula inteira. Aplicando esse método stable células expressando um total de seis mutantes de misfolded rodopsina, podemos gerar um perfil farmacológico de várias pequenas moléculas chaperones para esses mutantes. Neste protocolo, todas as células são immunostained em uma placa de 384 em fotografaram usando um sistema automatizado de imagens sob uma condição altamente consistente da imagem latente. Uma análise da imagem é realizada para cada poço, contendo imagens de mais de 600 células para reduzir a variação devido à heterogeneidade das células com diferentes a nível de expressão de forma e proteína de célula. O fluxo de trabalho do presente protocolo é resumido na Figura 1. A vantagem deste método é que obtemos imagens de alta resolução, bem como quantificações multi-parâmetros da análise baseada em imagem. Em geral, este protocolo pode ser modificado e aplicado para quantificar o transporte de qualquer membrana misfolded proteínas de interesse.

<table><tbody><tr><td>Células U2OS (rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td>Células</td><td>estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (T4R-rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td></td><td>Células estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (P23H-rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td></td><td>Células estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (P53R-rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td></td><td>Células estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (C110Y-rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Células estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (D190N-rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td></td><td>Células estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (P267L-rodopsina-Vênus)</td><td>NA</td><td></td><td>Células estáveis geradas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>DMEM glicose alta</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Com L-Glutamina, sódio piruvato</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Plasmocin inativado por calor</td></tr><tr><td></td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>Reagente de eliminação de micoplasma</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X soluções antibióticas concentradas para prevenir a contaminação bacteriana de culturas celulares</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0,25%, EDTA 1mM em HBSS sem</td></tr><tr><td>solução de poli-L-lisina</td> de cálcio e magnésio <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70.000-150.000, 0,01%, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Microplacas CellCarrier-384 Ultra</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>Microplacas tratadas com culto de tecido de 384 poços com paredes de poço preto e um fundo de olefina cíclica opticamente transparente para imagens de células em análise</td></tr> <tr><td>de alto conteúdoPlaca estéril de 96 poços</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>Cultura de tecidos tratada com tampa de fundo plano, estéril, livre de pirogênios detectáveis, Rnase, DNase e DNA. </td></tr><tr><td>Sailine Tamponada com Fosfato Não Citotóxico (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x Tampão PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5%, testado em cultura de células</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Compostos Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>testados</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Compostos NA sintetizados personalizados</td><td></td><td>foram comprados de diferentes fornecedores ou</td></tr><tr><td>anticorpo anti-rodopsina B6-30</td> sintetizado personalizado <td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Presente do Dr. Krzysztof Palczewski</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sem metanol</td></tr><tr><td>10% Soro de Cabra Normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Solução de coloração nuclear</td></tr><tr><td>Imager de alto conteúdo</td><td>Molecular Devices</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; Sistema de imagem de alto conteúdo micro confocal</td></tr><tr><td>MetaXpress software de aquisição e análise de imagem de alto conteúdo</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaXpress</td><td>Software de aquisição e análise de imagem de alto conteúdo</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (0,5-10 &micro; L)</td><td>Pipeta</td><td>manual de 8 canais Rainin 17013802</td>, <td>0.5-10 &micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (0,5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>Pipeta manual de 8 canais, 20-200 e micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica multicanal (10-200 &mu; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>Pipeta eletrônica multicanal para tarefas de pipetagem de microplacas de 96 e 384 poços</td></tr><tr><td>Reservatório de reagente de 50ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>Reservior de reagente para dispensação de pippte multicanal</td></tr><tr><td>Aspirador de 8 canais</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>Adaptador de aço inoxidável de 8 canais para aspiração de líquidos de placas de 96 ou 384 poços</td></tr><tr><td>Excel software de planilha</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>O software de planilha para análise de dados e geração de mapa de calor</td></tr><tr><td>Origin2018 software de análise de dados científicos e gráficos</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>O software de análise de dados para gerar as curvas de resposta à dose</td></tr></tbody></table>

um ensaio de transporte rhodopsin por análise de imagem de alto teor

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Mutações misfolding rodopsina levam à morte de fotorreceptoras de haste que se manifesta como autossômica dominante retinite pigmentosa (RP), uma progressiva cegueira doença que não tem tratamento eficaz. Nós hypothesize que a citotoxicidade do mutante rodopsina misfolded pode ser atenuada por farmacologicamente a estabilizar a proteína mutante rodopsina. A mutação P23H, entre as outras mutações de rodopsina de classe II, codifica uma proteína mutante rodopsina estruturalmente instável que é acumulada no retículo endoplasmático (ER), Considerando que a rodopsina tipo selvagem é transportada para a membrana plasmática em mamíferos células. Anteriormente realizamos uma tela de alta produtividade baseada em luminescência (HTS) e identificou um grupo de acompanhantes farmacológicas que resgatou o transporte da rodopsina P23H de ER para a membrana plasmática. Aqui, usando um método de imunocoloração seguido por uma análise de imagens de alto teor, podemos quantificar a quantidade de proteína mutante rodopsina na célula inteira e na membrana plasmática. Esse método é eficaz para identificar o verdadeiras correspondências a partir de falsos positivos após HTS e informativo Além disso, a análise de imagem de alto teor nos permitiu quantificar vários parâmetros de uma única experiência para avaliar as propriedades farmacológicas de cada composto. Usando este teste, analisamos o efeito de 11 diferentes compostos para seis RP associado rodopsina mutantes, obtendo um perfil farmacológico de 2-D para uma compreensão quantitativa e qualitativa sobre a estabilidade estrutural desses mutantes rodopsina e a eficácia de diferentes compostos para esses mutantes.

Caracteriza-se o transporte de rodopsina com três parâmetros: a intensidade da rodopsina-Venus na célula inteira (INT Rhodopsin-Venus), a intensidade de imunocoloração de rodopsina na membrana plasmática (rodopsina INT na superfície da célula) e a proporção de rodopsina mancha na superfície da célula, a intensidade de rodopsina-Venus na célula inteira (proporção de MEM-Total). Um resultado representativo do ensaio transporte rodopsina é mostrado na Figura 3 e...

Aqui, descrevemos um método de imagem de alto teor para quantificar o transporte dos mutantes rodopsina associado com retinite pigmentosa. Uma análise de múltiplos comprimentos de onda pontuação foi utilizada para quantificar proteína rodopsina na superfície da célula ou a célula inteira.

Um ensaio de transporte Rhodopsin por análise de imagem de alto teor

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

O descompactamento da rhodopsina causa degeneração progressiva da retina chamada retinite pigmentosa. Embora um método de imagem tradicional tenha capacidade limitada para quantificar o transporte de rodopsina, este ensaio recém-desenvolvido baseado em imagem permite uma triagem de alto rendimento, eliminando falsos positivos. Esta técnica permite uma avaliação rápida da farmacodinâmica medicamentosa.No olho de resgatar a dobra da rhodopsina causadora de doenças, acelerando assim o potencial de um tratamento para a doença silenciosamente intratável e cegante, a retinite pigmentosa. A localização celular de uma proteína de membrana é muito importante para sua função. Este método pode ser facilmente modificado e aplicado para quantificar o transporte de qualquer outra proteína de membrana de interesse.Certifique-se de preparar um mapa de placas e adicionar suavemente e aspirar líquido de cada poço da placa, para manter o número da célula e as condições de estado imunológico consistentes entre as células. Isso produzirá um alto fator Z, e resultados confiáveis. Para começar, sementes 5000 células por poço em um fundo preto murado, claro, poli-lysine tratada 384-bem-placa.Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por três horas para as células se anexarem ao fundo da placa. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 10 microliters por poço de soluções de trabalho 5X, de acordo com um mapa de placa pré-determinado como o mostrado aqui. Agora, adicione 10 microliters por poço de 2%DMSO às colunas 22 e 24.Além disso, adicione 10 microliters por poço de 25 micromolar 9-cis-retinal à coluna 23 em uma sala escura sob luz vermelha fraca. Quando terminar de carregar todos os vários compostos de teste, cubra a placa com papel alumínio e incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. Tire o 384-bem-prato em uma sala escura com luz vermelha fraca.Aqui, usando aspirador de 8 canais, conectado a uma garrafa de coleta de vácuo, para aspirar suavemente o meio dos poços da placa. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 20 microliters por poço de 4%paraformaldeído recém-preparado a toda a placa de 384 poços, e fixar as células por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação, coloque a placa em luz normal.Lá, use um aspirador de 8 canais, para aspirar o Paraformaldeído em cada poço, e use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters por poço de PBS. Aspire e substitua o PBS por um total de três ciclos de lavagem. Em seguida, adicione 20 microliters por poço de 5% de soro de cabra a cada poço, e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos.Após a incubação, aspire os poços e adicione 15 microlitadores de 20 microgramas por mililitro B630 anticorpo anti-rhodopsin, em soro de cabra de 1%aos poços nas fileiras A a O.Next, adicione 15 microliters por poço de 1%soro de cabra para remar P para o grupo de controle de anticorpos secundários. Incubar a placa em temperatura ambiente por 90 minutos, ou a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, cubra a placa com papel alumínio para evitar o fotobleaching dos fluoroforos.Em seguida, lave a placa três vezes com 50 microliters por poço de PBS. Após a última lavagem, aspire o PBS, e adicione 15 microliters por poço de cinco microgramas por mililitro de anticorpo igG de cabra conjugado Cy3. Cubra a placa com papel alumínio e incuba as amostras à temperatura ambiente por uma hora.Após a incubação, lave a placa três vezes. Em seguida, adicione 50 microliters por poço de PBS, contendo um micrograma por mililitro de mancha hoechst à temperatura ambiente por 15 minutos. Por fim, sele a placa do poço com um filme transparente, cubra-a com papel alumínio e guarde a quatro graus Celsius por até uma semana.Remova a folha e coloque a placa de amostra em um imager de alto teor, com A1 posicionado no canto superior esquerdo da placa. Em seguida, abra o software de aquisição de imagens para configurar parâmetros para aquisição de imagens. Abra a janela de configuração de aquisição da placa e crie uma nova configuração ou carregue um arquivo de configuração existente.Selecione o objetivo de 20X e configure o pixel binning como dois, de modo que o tamanho do pixel calibrado é de 0,80 por 0,80 mícrons. Em seguida, defina as linhas de varredura como 2000, e o tamanho da imagem como 1000 por 1000 pixels por site. Em seguida, selecione o tipo de placa a ser imageado.Use as informações fornecidas pelo fabricante para preencher as dimensões da placa. Agora, selecione os poços a serem imagens junto com quatro sites a serem imagens por poço. Evite o lado do poço, que são tocados pelas pontas de aspiração.Para imagens, selecione lasers de excitação como 405, 488 e 461 nanômetros. Em seguida, selecione os filtros de emissão para canais DAPI, FITC e Texas Red. Otimize a potência laser e os ganhos de cada canal, para garantir que os poços de controle positivo não estejam saturados.Selecione bem para se concentrar bem para foco automático. Em seguida, selecione o poço inicial a ser adquirido e defina o foco automático do site para todos os sites. Além disso, selecione quatro médias por linha para cada canal e otimize o valor de deslocamento Z para cada canal.Valide, que tudo esteja devidamente configurado, primeiro testando dois a três poços nos cantos da placa, para ter certeza de que as imagens estão em foco para todos os poços testados. Em seguida, verifique, que imagens de todos os sites por poço têm células com mais de 40% de confluência. Finalmente, verifique se as intensidades de fluorescência em todos os canais estão quase meio saturadas nos poços de controle 100%.Em seguida, salve o método de aquisição de imagem e execute toda a placa. Observe o imager até que ele termine de capturar imagens da primeira coluna da placa para verificar novamente a qualidade da imagem antes de deixar o imager. Quando terminar, remova a placa e armazene-a a quatro graus Celsius para uso futuro.Puxe dados de imagem, usando um software de análise de imagem de alto conteúdo. Selecione um dos poços de controle de 100% na coluna 23 para configurar os parâmetros. Primeiro, selecione a pontuação de célula de comprimento de onda multi-comprimento como o método de análise e comece a configurar as configurações adicionais.Defina os núcleos usando imagens do canal DAPI. Pré-visualização, para ter certeza de que os núcleos definidos se encaixam bem com as imagens dos núcleos. Em seguida, defina a forma da célula no canal FITC, onde a Vênus de Rhodopsin é imageda.Para isso, configure diâmetros mínimos e máximos de cada célula, intensidade mínima de fluorescência acima do fundo, bem como área mínima de cada célula. Agora, defina as áreas de mancha de superfície da célula de rodopsina no canal Vermelho do Texas, estabelecendo os diâmetros mínimos e máximos de forma celular, intensidade de fluorescência minium acima do fundo, bem como área mínima de cada célula manchada. Teste o algoritmo atual em cinco poços para determinar se as configurações são otimizadas.Em seguida, salve as configurações e feche a janela de configuração. Execute todos os poços com o método de análise otimizado. Quando terminar, exporte o número do objeto como o número de célula intacta.Exporte a intensidade média do canal FITC como a intensidade de Vênus de Rhodopsin, e exporte a intensidade média do Canal Vermelho do Texas como intensidade de Rhodopsin na superfície celular. Use o software de planilha para gerar um mapa de calor de duas cores para cada parâmetro. Organize o nome das linhas celulares no eixo x e os compostos no eixo y.Aqui, nossas imagens de P23H rhodopsin Venus trataram células U2OS, expressando fluorescência de Vênus em verde, e imuno-coloração da superfície celular em vermelho. As células foram tratadas com DMSO ou cinco micromolar 9-cis-retinal. O ensaio de transporte de rodopsina, comparando a quantidade de rodopsina em toda a célula em várias condições, mostra uma recuperação significativa na linha celular mutante P23H, quando tratada com 9 cis-retinal.Além disso, a intensidade da rodopsina na superfície celular, e a razão da mancha de rhodopsina na superfície celular à intensidade de Vênus de rodopsina em toda a célula, não são significativamente menores para o mutante P23H, em comparação com o tipo selvagem rhodopsin tratado com DMSO. Um mapa de calor é uma maneira eficiente de comparar a quantidade média de rodopsina e a localização por célula entre vários mutantes. Aqui, controles de tipo selvagem e seis mutantes de rodopsina são listados horizontalmente, e os efeitos dos tratamentos compostos são comparados verticalmente.De acordo com estudos anteriores, a intensidade de rodopsina na superfície celular e a razão da mancha de rodopsina na superfície celular à intensidade de Vênus de rodopsina são menores para os seis mutantes em comparação com o tipo selvagem tratado com DMSO. Os compostos um, dois, seis e nove aumentaram significativamente a proporção de mancha de rhodopsina na superfície celular para a intensidade de Vênus de rodopsina em T4R, P23H, D190N e P267L mutantes de rodopsina, sugerindo que esses compostos resgatem o transporte desses mutantes de rodopsina para o plasma da membrana. Tenha em mente que as células precisam estar entre 50 e 70% confluentes antes da fixação, pois isso é fundamental para a análise de imagem.Além disso, mostramos imagens de um poço em toda a placa. Certifique-se de que as imagens em foco, e que a fluorescência, que não sai, tem todo o valor limite para qualquer canal. Até um seletor de compostos, que resgatam o transporte de rodopsina, podemos validar o processo, em seguida, passar a eficácia desses compostos in vivo, usando um modelo de rato expressando o mutante rhodopsin P23H.Este método nos permite quantificar a quantidade de proteína de membrana e sua localização. Portanto, é uma ótima ferramenta para micro erro iniciado na proteína da membrana por assistência e degradação. O paraformaldeído, como está neste experimento, possui procedimentos envolvendo o manuseio desse reagente.Será feito sob o capô. Os resíduos, incluindo este reagente, devem ser descartados adequadamente como um produto químico perigoso.

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