Name: Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores usando fotoconversão in vivo em camundongos transgênicos Kaede. Este método permite rastrear dinâmicas imunes endógenas em câncer de pele.

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Os autores gostaria de agradecer o Dr. Marcus Bosenberg para fornecer YUMM 1.1 e 1.7 YUMM linhas de melanoma murino e Dr. Deborah J. Fowell para fornecer B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr ratos de acordo com a RIKEN BRC através do Bio-recurso nacional do MEXT, Japão.

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Oregon Health & Science University e institucional Cuidado Animal.
1. indução da inflamação e FITC pintura de Mouse Pinna
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar, anestesiar um rato C57Bl/6 utilizando isofluorano vaporizado (induzir no 3-5% isofluorano e manter-se em 1-3% isofluorano; taxa de fluxo de oxigênio em 0,5-1,0 L/min). Assegurar a adequada anesthetization monitorando a perda do reflexo de pedal, movimentos involuntários e taxa respiratória reduzida.</li>
	<li>Lançar uma orelha plana com o lado ventral do ouvido fique virado para cima. Pipetar 20 µ l de solução FITC 5% dissolvido em 1:1 acetona: Dibutilftalato (DBP) para o lado ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.</li>
	<li>24 h após a aplicação de FITC, eutanásia os ratos através de exposição de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical. Colete o transformam de orelha em PBS separando as orelhas na cabeça com uma tesoura. Colete o dLNs cervical e inguinais não-drenando LNs em PBS, usando uma pinça para separar os serviços de imigração dos tecidos circundantes. Inguinais não-drenando LNs irão servir como controles negativos para a presença de leucócitos FITC+/Kaede vermelho+ . Descarte de carcaças de acordo com o protocolo institucional. Nota: O tempo ideal post photoconversion para análise dependerá do tipo de célula e comportamentos migratórios conhecidos. Células dendríticas, por exemplo, podem ser detectadas em dLNs tão cedo como aplicativo de DBP post 6 h.</li>
</ol>2. indução de inflamação e Photoconversion de rato Pinna
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar, anestesia um rato de Kaede-Tg (fundo C57Bl/6) pela injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina e xilazina 10 mg/kg, dissolvido em solução salina. Assegure a adequada anesthetization conforme descrito no passo 1.1.</li>
	<li>Lançar uma orelha plana com o lado ventral do ouvido fique virado para cima. Pipetar 20 µ l de um 1:1 acetona: DBP ao lado ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.</li>
	<li>Após a aplicação de DBP, cortar uma fenda em um pedaço de papel alumínio e puxar a orelha através da fenda para expor a orelha para a fonte de luz violeta. Deite a orelha com a dorsal virada para cima, usando fita adesiva para proteger a orelha para a folha.</li>
	<li>Posição da orelha diretamente sob a fonte de luz e photoconvert por 3 min usando uma fonte de luz de 405 nm em 100 mW de potência.</li>
	<li>24 h após photoconversion, eutanásia em ratos a Kaede-Tg e colher o transformam de orelha, LNs cervicais e inguinais LNs, conforme descrito na etapa 1.3. Nota: Além de considerações citadas na etapa 1.3, as taxas de proliferação irão determinar o tempo de análise como a perda de Kaede vermelho ocorrerá em rapidamente dividir células.</li>
</ol>3. vaccinia infecção do Mouse Pinna e aplicação FITC
<ol><li>Anestesia um rato C57Bl/6 com isofluorano vaporizado, conforme descrito no passo 1.1.</li>
	<li>Coloque o lado ventral da orelha plana. Pipetar 5 x 106 deformação unidades (PFU) de vírus vaccinia (VacV) diluído em 10 µ l de PBS para o pavilhão da orelha. Usando uma agulha de calibre 29, cutucar o pavilhão auricular 25 vezes40.</li>
	<li>pós-infecção 24 h, anestesiamos ratos infectados VacV com isofluorano, conforme descrito no passo 1.1 e pipetar 20 µ l 5% FITC dissolvido em acetona na face ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.</li>
	<li>24 h após a aplicação de FITC, eutanásia de ratos e recolher transformam a orelha, LNs cervicais e inguinais LNs conforme descrito na etapa 1.3. Nota: FITC pode ser aplicado em qualquer infecção de post do ponto de tempo para determinar DC tráfico em vários intervalos de 24h. Anteriormente, informou que a migração de DC para o dLNs é mantida a níveis semelhantes de dia 1 a 3 post infecção41.</li>
</ol>4. vaccinia infecção do Mouse Pinna e Photoconversion.
<ol><li>Anestesia um rato de Kaede-Tg com isofluorano vaporizado, conforme descrito no passo 1.1.</li>
	<li>Infectar o pavilhão auricular orelha com VacV conforme descrito no passo 3.2.</li>
	<li>pós-infecção 24 h, anestesiamos a ratos infectados VacV Kaede conforme descrito no passo 2.1 e executar photoconversion, conforme descrito nas etapas 2.3-2.4.</li>
	<li>24 h após photoconversion, eutanásia de ratos e colher o transformam de orelha, LNs cervicais e inguinais LNs, conforme descrito na etapa 1.3. Nota: Como mencionado acima, no passo 3.4, photoconversion pode ser administrado em qualquer infecção de post do ponto de tempo.</li>
</ol>5. ouvido e linfonodo processamento por citometria de fluxo
<ol><li>Criar suspensões única célula de transformam ouvido: Descasque separados os lados ventrais e dorsais do pavilhão auricular orelha usando dois pares de pinças e lugar com o interior da orelha voltada para baixo, para os poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 DNase U/mL, diluído em Hank é Buffered Saline solução (HBSS) (que contém Ca2 + e Mg2 +). Incube a 37 ° C por 30 min. Pressione o tecido digerido através de um filtro de célula de nylon 70 µm.</li>
	<li>Criar suspensões celulares único de LNs: Coloque LNs em poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 U/mL DNase diluído em HBSS. Provocadora Abra o nó de linfa cápsula usando duas agulhas de calibre 29 e então incubar os linfonodos a 37 ° C por 30 min. Pressione o tecido digerido através de um filtro de célula de nylon 70 µm.</li>
</ol>6. intradérmica Melanoma Tumor implantação e Photoconversion.
<ol><li>Raspe o pelo do centro das costas de um rato de Kaede-Tg usando um barbeador elétrico.</li>
	<li>Posicione uma agulha de calibre 29 no centro das costas entre as escápulas esquerdas e superiores direito e por via intradérmica, injetar 5 x 105 pilhas do tumor (diluídas em 50 µ l de soro fisiológico) na pele de ratos Kaede-Tg. Tumores devem ser cuidadosamente posicionados para assegurar a drenagem linfática, para linfonodos especificados (ou seja, esquerda e direita braquial LNs para tumores colocados no meio da parte superior das costas). Evite colocar o tumor acima dLN, pois isso pode resultar em photoconversion direto dos LNs através do pele/tumor.</li>
	<li>Permitir que os tumores crescem para o tamanho desejado (100-650 mm3).</li>
	<li>Um dia antes da coleta do tecido, anestesiar um rato Kaede-Tg conforme descrito no ponto 2.1 e raspar qualquer recém regrown peles ao redor do tumor.</li>
	<li>Corte um buraco circular em papel de alumínio e puxe o tumor através de expor o tumor para a fonte de luz. Cortar o furo ligeiramente menor do que o tumor para impedir que o tumor volta a cair no buraco e minimizar a conversão da pele adjacente, não-tumoral.</li>
	<li>Posicione o tumor diretamente abaixo da fonte de luz e photoconvert por 5 min usando uma fonte de luz de 405 nm em 200 mW de potência.</li>
	<li>24 h após photoconversion, eutanásia os ratos, conforme descrito na etapa 1.3. Colete os tumores, dLNs braquial e inguinais não-drenando LNs em PBS. Corte os tumores longe da pele circundante com uma tesoura e retire o LNs, conforme descrito na etapa 1.3.</li>
</ol>7. o tumor e linfonodo processamento por citometria de fluxo
<ol><li>Criar suspensões celulares único de tumores: picar os tumores com tesoura em poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 U/mL DNase diluído em HBSS. Incube a 37 ° C, durante 1 h. Pressione o tecido digerido através de um filtro de nylon 70 µm.</li>
	<li>Crie suspensão única célula dos gânglios linfáticos, conforme descrito no passo 5.2.</li>
</ol>8. anticorpo que mancha para citometria de fluxo
<ol><li>Após a digestão dos tecidos em suspensões celulares simples, execute técnicas de coloração padrão fluxo cytometry para rotular as células com marcadores de interesse. Brevemente, Pipetar 2 x 106 células em uma placa de 96 poços. Incubar as amostras com bloco de Fc (1 µ g/mL) por 20 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs (1% albumina de soro bovino em PBS). Adicionar ao vivo/morto mancha (diluída em PBS) para as amostras e incube por 15 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs. Incube com anticorpos primários (Tabela de materiais), diluídos em tampão de FACs por 30 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs. Nota: Kaede verde e Kaede se sobrepõe a fluorescência vermelha com fluorophores FITC e PE; assim, FITC e anticorpos conjugados a PE não podem ser usados em combinação com proteínas de Kaede.</li>
	<li>Depois da coloração, execute as amostras em um citômetro de fluxo. Alternativamente, consertar as células com 2% PFA.</li>
</ol>9. fluxo Cytometry Analysis
<ol><li>Definir o FITC (Kaede verde) e PE (Kaede vermelho) canal tensões de PGTO para 70-80% da amplitude total (centro de população em aproximadamente 104) usando ex vivo Kaede verde ou vermelho Kaede splenocytes de cor única ou sangue. Nota: Não compensa a Kaede verde (FITC) e canais de Kaede vermelho (PE) pois isso resultará em maior sinal espalhado.<ol>
<li>Para criar controles de Kaede da único-cor, colete um baço ou o sangue de um rato de Kaede-Tg. Lisar os glóbulos vermelhos com buffer ACK e, em seguida, dividir as células em dois grupos: unconverted Kaede verde e convertido Kaede vermelho.</li>
		<li>Para única cor Kaede controles vermelhos, suspender as células em 1 mL de PBS e photoconvert em uma placa de 24 por 5 min usando uma fontes de luz de 405 nm, com uma potência de 100 mW. Usar essas células para definir a Kaede verde (FITC) e Kaede tensões de PGTO vermelhas sobre o citômetro de fluxo (passo 9.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que as tensões para as proteínas de Kaede tiver sido definida, compensa todas as outras manchas de anticorpo primário usando single-fluoróforo rotulado contas de compensação, as instruções do fabricante.</li>
	<li>Execute as amostras em um citômetro de fluxo para coletar dados. Nota: A proteína de Kaede está continuamente sendo produzida pelas células. Isto significa que 24 h após photoconversion, células convertidas será positivo duplo para Kaede verde e proteína Kaede vermelho como Kaede recém sintetizado (verde) tem acumulado na célula.</li>
	<li>Analise os dados usando o software de FlowJo ou um software similar.</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito para divulgar.

Embora a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos é fundamental para a iniciação e a resolução de respostas imunes, os mecanismos moleculares que governam o egresso são mal compreendidos. Esta lacuna no conhecimento é em grande parte devido à pronta disponibilidade de ferramentas para a quantificação em vivo. Aqui, descrevemos o uso de ratos de photoconvertible (Kaede-Tg) para quantificar a saída de leucócitos endógeno da pele e tumores e fornecer uma comparação direta de frente a frente com tin...

Respostas imunes de tecido periférico são moldadas não apenas por recrutamento de leucócitos para os locais de inflamação, mas também por mecanismos que regulam sua retenção subsequente. Assim, a imunidade protetora é ditada pela cumulativos mecanismos celulares e moleculares que determinam se um leucócito entra, fica dentro, ou melhor migra do tecido periférico, através de vasos linfáticos. Importante, a propensão para leucócitos sair do tecido através de vasos linfáticos (denominado Egresso) está ligada às suas funções especializadas. Células dendríticas (DC) adquirem comportamento migratório, em resposta a sinais de maturação, levando a transporte do antígeno e apresentação na drenagem dos gânglios linfáticos (dLN), um processo que é necessário para a imunidade adaptativa1. Eliminação de células mieloides, tais como os macrófagos e os neutrófilos, servem para limpar escombros apoptotic através da fagocitose. Durante a infecção bacteriana, os neutrófilos saída de tecido e, finalmente, sofrem apoptose em dLNs2 e em um modelo da colite induzida por DSS, dados suporta a hipótese de que o egresso macrófago é necessário para resolver a inflamação local3. No entanto, se o egresso de neutrófilos e macrófagos ocorre em todos os contextos inflamatórios, é desconhecido. Provas para saída de linfócitos T de estado estacionário4,5,6,7, infectados8e inflamada4,9,10, 11,12 periféricos, não-linfoides tecidos indica que células T recircular ativamente, embora os sinais baseados em tecido que impulsionam esta saída permanecem mal compreendidos. Vários estudos têm identificado os sinais necessários para a migração direcional para drenagem linfáticos capilares e subsequentes saída incluindo chemokine (C-C motif) ligand 21 (CCL21) e seu receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12) e seu receptor CXCR42,14e esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Estes mecanismos não são ativos em todos os contextos, no entanto, e se eles determinam a saída de todos os tipos de célula permanece uma questão em aberto. Importante, ainda mais insight sobre os mecanismos que regem o egresso e sua relevância funcional na doença requer métodos quantitativos na vivo de análise.
Vários métodos têm sido utilizados para quantificar o egresso em vários modelos animais na vivo incluindo canulação direta dos vasos linfáticos, transferência adotiva de ex vivo rotulado leucócitos, aplicação de transdermal dos marcadores fluorescentes, injeção de partículas rotuladas e na vivo photoconversion17,18. Canulação direta dos vasos linfáticos aferentes do rato é difícil e limitado em pequenos animais pelos volumes de líquido que pode ser recolhido. Assim, canulação em grande parte foi realizada em animais de grandes porte (ex., ovelha) onde tais manipulações cirúrgicas são práticas. Estes estudos fornecem a evidência direta da presença de células linfoides e mieloides em linfa10,19,20. Além disso, modelos de ovinos revelam que inflamação aguda e crônica aumentou a presença de linfócitos na linfa por quase 100 vezes10,21.
Transferência adotiva de linfócitos etiquetados e manipulados geneticamente importante revelou que CCR7 é necessária para a saída dos CD4+ T células de5,da pele inflamada aguda11, enquanto o pré-tratamento dos linfócitos com a pequena molécula agonista do receptor de S1P, FTY720, apenas parcialmente inibe sua saída10. Curiosamente, a saída de linfócitos transferidos de pele cronicamente inflamada é independente CCR710, mas parcialmente pode exigir CXCR49. Experimentos de transferência adotiva, no entanto, entregam números não-fisiológicos da ex vivo ativados e rotulados de linfócitos no tecido através de injeção, que altera o ambiente biomecânico dos tecidos e pressões elevadas de fluido intersticiais que abrir os capilares linfáticos iniciais e alterar suas propriedades de transporte22. Como uma alternativa, aplicação de transdermal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) na presença ou ausência de irritantes dérmicas (EG., Dibutilftalato, DBP) ou infecção23,24 permite o acompanhamento das células fagocíticas que acumulam tracer e migram para o dLNs. Da mesma forma, tumores fluorescente etiquetadas fornecem um meio para controlar as células fagocíticas que tem engolido o tumor material25. Esses métodos têm fornecido importantes insights sobre os mecanismos que regem a DC saída13,14,17,26,27 , mas são incapazes de controlar não-fagocíticas linfócitos e, a interpretação podem ser complicadas por drenagem linfática grátis de solúvel FITC rotulando assim não migratória, LN residentes DCs.
Alternativamente, a microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite o rastreamento no vivo das populações de leucócitos fisiologicamente relevantes em tempo real28,29. Usado em combinação com o repórter ratos e anticorpo-baseado na vivo imunofluorescência etiquetando, intravital microscopia revelou o complexo espacial e temporal dinâmica de imune celular de tráfico, incluindo a migração intersticial30 , transmigração através do endotélio linfático, passagem dentro do lúmen linfática e migração em cima LN entrada28,31. Ampla adoção de técnicas de imagem intravital é limitada pela despesa, conhecimentos necessários para configurar e limitado throughput para quantificação dos vários tipos de células. Ainda, métodos quantitativos que analisam a dinâmica populacional de acoplamento tecidos com intravital imagem irão fornecer uma visão mecanicista adicional e importante no que diz respeito as mecanismos de mobilidade e migração em direção e dentro de capilares linfáticos 18 , 31 , 32.
Por conseguinte, na vivo photoconversion emergiu como um método que permite em situ etiquetando, independente da atividade fagocítica e para a quantificação de saída de leucócitos fisiológica (quando acoplado com citometria de fluxo) na ausência ou presença de desafio. Ratos de Kaede-Tg constitutivamente expressam uma proteína isolada de corais stony que apresenta fluorescência verde (Kaede verde) até expostos à luz violeta, após o qual ele converte irreversivelmente a fluorescência vermelha (Kaede vermelho)33. Photoconverted células podem ser rastreadas como eles saída de sítios de tecidos periféricos e acumular-se no dLNs. Esta e outras semelhantes photoconvertible rato modelos34,35 revelaram importante biologia incluindo egresso constitutivo de pilhas de T reguladoras de pele36, egresso de células B CXCR4-dependente de Peyer37 , mobilização de células de memória residente T após peptídeo re-desafio38e saída de leucócitos amplo de tumor microambiente39. Neste documento, podemos realizar uma comparação frente a frente de photoconversion com aplicação de transdermal FITC no contexto da inflamação cutânea e infecção para permitir a comparação direta dos dados existentes com o método de photoconvertible. Além disso, demonstramos photoconversion em tumores implantados e descrever a eficiência de conversão e saída seletiva do microambiente do tumor. Como tal, podemos argumentar que é necessária mais aplicação destes métodos para elucidar a biologia crítica do egresso de leucócitos de tumores, que terá implicações significativas para interpretar a complexidade de leucócitos intratumoral, imunidade anti-tumoral, e resposta à terapia.

<table><tbody><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Silver-LED-405B fonte de luz com fibra óptica e colimador</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Isômero de isotiocianato de fluoresceína I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>ftalato de dibutila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de calibre 29</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de 70 um</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Caisson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de células mortas Aqua corrigível LIVE/DEAD</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse purificado CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (clone 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (clone 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (clone M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (clone RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (Fração V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Rat e Anti-Hamster Igk / Conjunto de Partículas de Compensação de Controle Negativo</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Saída de leucócitos de tecidos periféricos para drenagem de linfonodos não é somente crítica para vigilância imune e iniciação mas também contribui para a resolução das respostas do tecido periférico. Embora uma variedade de métodos são usados para quantificar a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos, os mecanismos celulares e moleculares que governam o egresso de contexto-dependente permanecem mal compreendidos. Aqui, descrevemos o uso de photoconversion em situ para análise quantitativa de saída de leucócitos da pele murino e tumores. Photoconversion permite a rotulagem direta de leucócitos residente no tecido cutâneo. Embora a exposição da pele à luz ultravioleta induz local respostas inflamatórias caracterizam por infiltração de leucócitos e leakiness vascular, em uma comparação frente a frente com aplicação transdérmica dos marcadores fluorescentes, photoconversion especificamente rotulado de populações de células dendríticas migratórias e simultaneamente habilitado a quantificação de mieloide e linfoide egresso do microambiente cutâneo e tumores. Os mecanismos de saída de leucócitos mantêm um componente em falta em nossa compreensão da complexidade de leucócitos intratumoral, e, portanto, a aplicação das ferramentas descritas neste documento fornecerá uma visão única da dinâmica do tumor imune microambiente que ambos Só firme estadual e em resposta à terapia.

Primeiro procuramos replicar photoconversion resultados publicados na literatura para avaliar a eficiência e determinar a inflamação associada na pele do rato. O pavilhão auricular orelha foi exposto a 100 mW violeta luz (405 nm) para 3 min como anteriormente descrito33. Único suspensões celulares geradas a partir de pele de orelha ou cervical dLNs imediatamente após a exposição revelaram uma eficiência de conversão de 78% de todos os CD45+ leucócitos na...

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

A fotoconversão fornece um método in vivo rastreável para a análise quantitativa da saída de leucócitos para uma visão mecanicista sobre a residência leucócito e a dinâmica de saída de múltiplos sítios teciduais em estados doentes. Bem, aqui demonstramos a utilidade do rastreamento de leucócitos de tumores cutâneos. A aplicação deste ensaio a outros tecidos e doenças é limitada apenas pela capacidade de administrar a luz.A principal vantagem dessa técnica é que permitir a quantificação de populações endógenas, em vez de transferir populações de células imunes como saída de tecidos inflamados in vivo. Para induzir a inflamação, após confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo, use uma micropipette para administrar 20 microlitradores de ftalato de dibutil ou DBP, para o lado ventral do pina auditivo de um rato transgênico Kaede anestesiado. Depois de permitir que o DBP seque, puxe a orelha através de uma fenda em um pedaço de papel alumínio e use fita dupla face para fixar a orelha fixamente à folha com o lado dorsal voltado para cima.Então, posicione que você está diretamente sob uma fonte de luz de 405 nanômetros e fotoconvertido por três minutos a 100 miliwatts de potência. Para infecção por vaccinia, use uma micropipette para administrar 5 vezes 10 a 6ª placa formando unidades do vírus da vaccinia em 10 microliters de PBS no fone de ouvido de um rato transgênico Kaede anestesiado e cutuque o pinna 25 vezes. 24 horas depois, fotoconverta o pinna como apenas demonstrado.No momento experimental apropriado, colmam o pináculo e os linfonodos cervicais e inguinais e use dois pares de pinças para descascar o lado ventral e dorsal de cada pinna. Em seguida, coloque os linfonodos e os pedaços de pinna, com o interior da orelha virado para baixo, em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 1 miligrama por mililitro de Colagenase D e 80 unidades por mililitro de Dna diluído em HBSS contendo cálcio e magnésio. Use duas agulhas de calibre 29 para provocar a abertura de cada cápsula de linfonodo e coloque a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.No final da incubação, pressione os tecidos de pináculo e linfonodos digeridos através de coador de células de nylon de 70 micron para obter suspensões celulares únicas de cada tecido. Quando os tumores crescerem para o tamanho experimental apropriado, raspe qualquer pele recém-recreada ao redor do local do tumor e puxe o tumor através de um buraco circular cortado em um pedaço de papel alumínio. Posicione o tumor diretamente abaixo da fonte de luz de 405 nanômetros e fotoconverte por 5 minutos a 200 miliwatts de potência.24 horas após a fotoconversão, colher os tumores e linfonodos braquiais e inguinais de cada animal e usar uma tesoura para picar os tumores dentro de poços individuais de uma placa de 24 poços contendo Colagenase D e DNase no HBSS. Coloque os linfonodos em poços separados e provoque abrir as cápsulas como apenas demonstrado. Depois de incubar os tumores por uma hora e os linfonodos por meia hora a 37 graus Celsius, pressione os tecidos digeridos através de 70 coadors de micron separados para obter suspensões celulares únicas de cada tecido.Para analisar as suspensões de células únicas por citometria de fluxo, primeiro coletar o baço ou o sangue de um rato transgênico Kaede e lise os glóbulos vermelhos com tampão de potássio de cloreto de amônio. Divida as células em um Kaede FITC não convertido e uma população de Kaede PE convertida e resuspenda as células kaede pe de cor única em um mililitro de PBS em um poço de uma placa de 24 poços, em seguida, fotoconvertir as células por 5 minutos sob uma fonte de luz de 405 nanômetros a 100 miliwatts de potência. Em seguida, use as células de Kaede PE fotoconvertidas e as células Kaede FITC não convertidas para definir as tensões fotomultiplier para 70 a 80% da faixa total de cada canal fluorescente.Uma vez definidas as tensões para as proteínas Kaede, compense todas as outras manchas de anticorpos primários usando contas de compensação rotuladas por fluorohore único, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, execute as amostras no citômetro de fluxo de acordo com os protocolos de análise citométrica de fluxo padrão. Suspensões de células únicas geradas a partir da pele do ouvido ou linfonodos cervicais de drenagem imediatamente após a exposição à fotoconversão revelam uma eficiência de conversão de 78% de todos os leucócitos positivos CD45 na pele, sem células convertidas observadas nos linfonodos drenantes.Quantificação dos números de leucócitos positivos CD45 infiltrados em orelhas fotoconvertidas zero e 24 horas após a conversão, revela que a exposição à luz violeta causa um aumento estatisticamente significativo na infiltração de leucócitos. Este aumento na infiltração de leucócitos positivos cd45, no entanto, é pequeno em relação à infiltração induzida por um potente estímulo inflamatório, como o vírus da vaccinia. A fotoconversão também aumenta a permeabilidade vascular no pináculo do ouvido medida pelo ensaio de Miles, indicando juntos que os efeitos da luz violeta na inflamação tecidual devem ser considerados ao otimizar a dose, o tempo de exposição e a interpretação dos dados.A análise citométrica de fluxo de células tumorais dissociadas de animais fotoconvertidos revela uma conversão significativa de células positivas cd45 intratumoral de Kaede FITC positivo para Kaede PE positivo, enquanto as células linfonodas de drenagem permanecem inconvertidas. A eficiência da fotoconversão dos leucócitos positivos CD45 variou significativamente entre tipos e tamanhos tumorais, com leucócitos positivos CD45 dentro de pequenos tumores de melanoma demonstrando a fotoconversão mais eficiente. À medida que os volumes tumorais aumentam, a eficiência de conversão diminui para cerca de 50% Notavelmente, a melanina tem um impacto impressionante na eficiência da fotoconversão com uma fotoconversão máxima de células positivas CD45 observadas dentro de tumores produtores de melanina de apenas cerca de 30% em tumores menores, que cai para 10% à medida que os volumes tumorais se aproximam de 400 milímetros cúbicos.O exame de tumores drenando linfonodos 24 horas após a fotoconversão revela a presença de células imunes positivas de Kaede de vários fenótipos, demonstrando assim a emigração leucócito do tumor fotoconvertido. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da Imunologia descobrirem a cinética do estado estável e a rotatividade inflamada de leucócitos no tecido periférico. Ao tentar esse procedimento, é importante garantir que apenas o tecido de interesse seja fotoconvertido, pois a fotoconversão inadvertida do tecido circundante comprometerá seus resultados.Indivíduos novos nesse método devem otimizar o tempo de exposição para conversão de seu tecido, bem como a duração dos tempos antes da coleta de tecidos ocorrer com base na dinâmica do leucócito de interesse.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar a migração de células dendríticas após infecção da pata com Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG em camundongos. Após a infecção bacteriana, as células DC da pele ativadas são marcadas com um corante de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína permeável a células (CFSE). Após um intervalo adequado para a migração da DC para o linfonodo de drenagem poplítea, as células do linfonodo são isoladas e submetidas à...

Um ensaio baseado em CFSE para monitorar a migração de células dendríticas da pele para linfonodos de drenagem em camundongos infectados

Este protocolo descreve um método para a avaliação detalhada de subconjuntos de leucócitos dentro do microambiente tumoral em um modelo de tumor de camundongo. Células de melanoma B16 que expressam chemerina foram implantadas por via subcutânea em camundongos singênicos. As células do microambiente tumoral foram então coradas e analisadas por citometria de fluxo, permitindo análises detalhadas de subconjuntos de leucócitos.

Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo

Um ensaio em camundongos para rastrear a migração celular da pele para o linfonodo de drenagem é descrito, o que permite a caracterização das células dendríticas da pele mobilizadas para o linfonodo após infecção do pata com Bacilo Calmette-Guérin.

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

Observação microscópica da Dinâmica do Linfócito em Patches de Rat Peyer

O melanoma é uma doença muito agressiva que rapidamente se espalha para outros órgãos. Este protocolo descreve a aplicação de imagens de ultrassom de ultra-alta frequência, juntamente com renderização 3D, para monitorar o volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático.

Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores usando fotoconversão in vivo em camundongos transgênicos Kaede. Este método permite rastrear dinâmicas imunes endógenas em câncer de pele.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

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