Name: Estabelecimento de linhas de celulares superexpressão DR3 para avaliar a resposta Apoptotic a terapêutica antimitótica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprenda a estababelecer linhas celulares HT29 superexpressando DR3 marcado com FLAG por infecção retroviral para estudar apoptose induzida por agentes antimitóticos. Este método fornece ferramentas confiáveis para pesquisa in vitro e in vivo.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios 53110000117 (a G.W.) e 043222019 (para X.W.) da Universidade de Tsinghua.

Por favor, note que todos os experimentos de rato aqui descritos foram aprovados e efectuados de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) na Universidade de Tsinghua.
1. geração de linhas de células de superexpressão DR3
<ol><li>Construir o plasmídeo de expressão DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandeira), inserindo cDNA de DR3 completo com 3 x bandeira no C-terminal em vetor retroviral pMXs-IRES-Blasticidin dos locais de restrição de BamHI/XhoI.</li>
	<li>Desenvolvem-se células Plat-A em pratos de 60 mm com 4 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM). No dia seguinte, quando as células atingem 80% - 90% confluência, transfect as células com 2 μg de plasmídeo pMXs-IRES-DR3-bandeira usando o reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) de acordo com manual20 do fabricante.</li>
	<li>Depois de 72 h, recolher o sobrenadante, a mídia usando um filtro de estéril 0,45 μm do filtrado e manter a suspensão viral no escuro a 4 ° C.</li>
	<li>Desenvolvem-se células HT29 em DMEM em um prato de 60 mm e incubar a 37 ° C com 5% CO2células.</li>
	<li>No dia seguinte, quando as células atingem 30% - 50% de confluência, infectar as células com 2 mL de vírus em suspensão na presença de 8 μg de 1,5-dimetil-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide por mililitro de suspensão viral. Após 4-6 h de incubação a 37 ° C, aspirar a suspensão viral, adicione 4 mL de DMEM fresco e devolver o prato para a incubadora.</li>
	<li>Descartar os meios de comunicação de postinfection de 24 h a pratos e lavar cuidadosamente as células com 2 mL de PBS escaldadas. Adicionar 1 mL de tripsina-EDTA para as células e incubar a 37 ° C por 3 min.</li>
	<li>Depois de observar ao microscópio com ampliação de 10x que a maioria das células têm destacado, pare a tripsinização com 2 mL de DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Recolher a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de DMEM. Misture bem delicadamente pipetagem para cima e para baixo. Dilua as células de fatores de 30, 100 e 300. As células em pratos de 150 mm com 20 mL de DMEM contendo 1 µ g/mL blasticidin de sementes. Incube a uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por ~ 1-2 semanas.</li>
	<li>Durante este período, as colônias observe todos os dias com um microscópio invertido na ampliação de 10x. Marca as colônias bem isoladas no fundo do prato quando o diâmetro da colônia é cerca de 1-2 mm.</li>
	<li>Aspire o meio e lavar as células com 3 mL de PBS pré-aquecido. Adicione 2 ml de EDTA-tripsina em um prato de 60 mm. Use pinça estéril para pegar autoclavados cilindros clonagem estéril e colocá-los no prato 60 mm. Pegue os cilindros contendo tripsina-EDTA e delicadamente, coloque-os sobre as colônias marcadas. Certifique-se de cada cilindro clonagem só contém uma colônia e evitar a contaminação com colônias vizinhas.</li>
	<li>Devolver o prato para a incubadora durante 3 minutos.</li>
	<li>Depois de 3 min, verificar as células sob o microscópio com ampliação de 10x para ver se eles têm destacado. Quando as células têm levantado, adicione 70 μL de meio de cultura para cada cilindro para inactivar a tripsina. Misture suavemente a suspensão de células com uma pipeta de 200 μL. Certifique-se de não se mover o cilindro durante este processo.</li>
	<li>Transferi a suspensão de células de cada colônia para duas placas de 24 poços contendo 1 mL de DMEM por alvéolo. Adicionar 30 μL da suspensão de células por poço na placa A e 70 μL no correspondente poços na placa B. Label as placas corretamente e colocá-los de volta na incubadora.</li>
</ol>2. verificação da linha DR3 Overexpression celular
<ol><li>Quando as células na placa B estão na confluência de 90%, remova a mídia e lavar cuidadosamente as células com 1 mL de PBS. Completamente remover PBS e lyse as pilhas com 50 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE 1x. Transferir os lisados celulares da placa de 24 para tubos de centrífuga de 1,5 mL e ferva as amostras durante 10 minutos a 100 ° C.</li>
	<li>Execute as amostras no gel de sulfato de sódio (SDS) de dodecil de sódio 10% em uma tensão constante de 80 V por 15 min e, em seguida, em 120 V por 1h.</li>
	<li>A proteína de transferência para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno por transferência molhada em uma corrente constante de 400 mA por 2 h.</li>
	<li>Teste a expressão DR3 em diferentes clones com anticorpo anti-FLAG, usando as selvagem-tipo pilhas HT29 como um controle negativo (Figura 1). Diluir o anticorpo primário por um fator de 5.000 em 5% leite desnatado que é dissolvido em TBST (Tris salino contendo 0,1% Tween-20). Incube a membrana com anticorpos de bandeira a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lave a membrana com TBST sacudindo um agitador decoloring a 200 rpm no RT. Refresh a cada 5 min para um total de tempo de 15 min de lavagem TBST.</li>
	<li>Incube a membrana com anti-rato anticorpo secundário diluído por um fator de 10.000 em 5% de leite desnatado a 4 ° C, durante 5-6 h.</li>
	<li>Lave a membrana novamente como descrito na etapa 2.5.</li>
	<li>Detectar a expressão bandeira usando substrato de quimioluminescência reforçada ocidental (ECL) e a membrana com um sistema de documentação do gel de imagem (consulte a Tabela de materiais). Identifica os clones expressando DR3 como os clones positivos.</li>
	<li>Transferi os clones na placa A que correspondem aos clones positivos na placa B para uma placa de 6 e continuam a amplificar as células até cultivá-las em pratos de 10 cm. Faça estoques congelados das células de crescimento de clones positivos e armazená-los a-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>3. avaliação da resposta a agentes antimitóticos Apoptotic de células
Nota: Diazonamide é uma nova classe de produto natural marinho que tem notável atividade em inibir o crescimento de células de câncer, que espelha a outros agentes de tubulina-desestabilizando21. No entanto, seu modo de ação ainda não está claro. Para testar a resposta celular das células aos agentes antimitóticos, paclitaxel e diazonamide foram usados para tratar o selvagem-tipo HT29 pilhas e pilhas HT29-DR3. As drogas foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), existências de 10 mM e, depois, mais diluídas para diferentes concentrações: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM e 10.000 nM em DMSO.
<ol><li>Recolha pilhas HT29 e HT29-DR3 por tripsinização. Medir a densidade de células usando um contador automático de células. Em seguida, as sementes das células em placas de 12-poços em DMEM com uma densidade de 3 x 104 células por poço. No dia seguinte, adicionar 10 nM diazonamide e usar 1% DMSO como controlo negativo. Após 48 h de tratamento, as células sob um microscópio com ampliação de 10x (Figura 2) da imagem.</li>
	<li>HT29 sementes e HT29-DR3 células em placas de 96 poços em DMEM com uma densidade de 3 x 103 células por poço e permitir-lhes a crescer durante a noite a 37 ° C. Em seguida, adicione cada dose maiores concentrações de diazonamide de 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM e 100 nM para cada poço, usando 1% DMSO como controlo negativo.</li>
	<li>Após 48 h de tratamento, medir a viabilidade celular usando um kit de ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência de acordo com o manual do fabricante.<ol>
<li>Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixá-lo ficar em RT por aproximadamente 30 min. Em seguida, adicione 50 µ l de reagentes de ensaio para cada poço, agitar a placa no RT por 2 min para lisar as células e incube a placa na RT para outro 10 min. Determine a luminescência de cada poço usando um leitor de microplacas (Figura 3). Nota: A viabilidade celular representa a intensidade de luminescência relativa de cada um para o controle bem tratada com 1% de DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use camundongos BALB/c seis semanas de idade fêmeas nuas para na vivo estudo14. Nota: Os ratos foram mantidos sob condições específicas isentos de organismos patogénicos.<ol>
<li>Trypsinize HT29 e HT29-DR3 célula e, em seguida, pare a tripsinização usando DMEM pré-aquecido a 37 ° C. Recolher a suspensão de células em um tubo de 50 mL e centrifugar as células a 1.000 rpm durante 10 minutos a RT. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio DMEM sem FBS. Centrifugar as células novamente e ressuspender as células em PBS.</li>
		<li>Contar as células usando um contador automático de células e diluir as células a uma concentração de 2,5 x 107 células/mL usando PBS. Gere tumores através de uma injeção subcutânea de 200 µ l de suspensão de célula HT29 ou HT29-DR3 no flanco direito de cada rato (5 x 106 células/mouse)22.</li>
		<li>Medir o volume do tumor (TV) usando compassos cada 2 d após o transplante. Calcular a TV usando a seguinte fórmula: TV = 1 / 2L x W x W (aqui, w: largura de tumor, l: comprimento do tumor). Quando o volume do tumor médio atinge cerca de 100 mm3, randomizar os ratos para o controle ou grupo tratado (n = 6 por grupo) e iniciar o tratamento.</li>
		<li>Prepare a solução de paclitaxel como segue. Primeiro, dissolver o paclitaxel completamente em etanol a 5% do volume total e, em seguida, adicione o óleo de mamona 5% do volume final de polioxilo 35 hidrogenados. Finalmente, compõem os restantes 90% do volume com D5W (5% dextrose em água, pH 7,4).</li>
		<li>Injetar o paclitaxel por via intravenosa na dose de 20 mg/kg 3 x por semana, durante duas semanas. Medir o tumor volume e corpo peso 3 x uma semana14. Encerrar o experimento e eutanásia dos animais, se o peso do corpo diminui em 20% ou o volume do tumor atinge cerca de 2.000 mm3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+for+gene+transfer%2C+expression%2C+knockdown%2C+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li>
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<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li>
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<li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este manuscrito, descrevemos um método para gerar linhas de célula estável HT29-DR3. HT29-DR3 células fornecem um modelo para estudar os mecanismos moleculares pelos quais DR3 contribui para a apoptose induzida por agentes antimitóticos. Esta abordagem é versátil e repetíveis. Para garantir o sucesso do procedimento, quatro etapas-chave do protocolo precisam ser considerados. Em primeiro lugar, a fim de produzir uma alta suficiente concentração de vírus, recomenda-se realizar a transfeccao de DNA quando as células Plat-A...

Expressão gênica heteróloga é frequentemente usado para estudar a função dos genes de interesse. Dois métodos, transfecção transiente e estável, são predominantemente utilizados em células e biologia molecular para inserir um segmento de DNA ou RNA em uma célula de acolhimento1,2. Transitoriamente transfectadas DNA ou RNA não pode ser passado às células, para que a alteração genética só pode ser retida por um curto período de tempo. Por outro lado, nas células transfectadas estàvel, genes exógenos são integrados no genoma da célula de acolhimento, sustentando a sua expressão na linhagem celular. Assim, transfection estável é um método que é geralmente reservado para a investigação em regulamento genética a longo prazo. A linha celular estável também pode ser transplantada como xenografts em modelos do rato in vivo estudo3. Transfection estável pode ser dividido em duas categorias: nonviral e virais. Comparado a nonviral transfecção, infecção viral pode transferir genes para uma ampla variedade de células humanas com uma maior eficiência4,5,6,7. Além disso, uma linha de celular estável de um único clone oferece a vantagem de homogeneidade e pureza clonal.
Divisão e crescimento descontrolado de células são as características de câncer. Em ambientes clínicos, agentes antimitóticos são os tratamentos primários para muitos tipos de tumores8. No entanto, algumas limitações significativas de agentes antimitóticos não podem ser ignoradas. Em primeiro lugar, esses agentes quimioterápicos também podem matar células normais juntamente com as células cancerosas indesejáveis e, assim, podem resultar em efeitos colaterais graves8. Segunda, antitubulin de drogas não são eficazes contra todos os tipos de tumores, apesar da expressão de onipresente da tubulina em uma grande variedade de tecidos diferentes, como uma proteína do citoesqueleto9,10. Não está claro por que agentes antitubulin mostraram promissor eficácia contra ovário, pulmão e cancros hematológicos no tratamento clínico, mas não no rim, cólon ou cânceres pancreáticos11. Finalmente, mesmo os pacientes com o mesmo tipo de tumor podem responder para os antimitotics diferente de forma imprevisível. Pode haver uma molécula efetora chave que afeta a sensibilidade dos pacientes diferentes agentes antimitóticos, resultando em diversos resultados vistos no tratamento clínico12. Assim, as potenciais sensibilidades diferenciais dos pacientes ao tratamento antimitóticos devem ser tomadas em consideração para otimizar intervenções terapêuticas13.
Uma tela de biblioteca do elevado-throughput do inteiro-genoma siRNA demonstrou que o knockdown DR3 poderia render sensíveis células resistentes a drogas antimitóticas, implicando um papel para DR3 na apoptose induzida por quimioterapia14. Como um membro da superfamília do receptor (TNFR) de fator de necrose tumoral, DR3 tem sido relatado para mediar a apoptose celular em diversos sistemas15,16,17,18. Assim, partimos para estabelecer linhas de célula estável superexpressão DR3 para estudar os mecanismos moleculares pelos quais Medicamentos antimitóticos induzem apoptose. Um modelo de célula apropriada para o estudo DR3 superexpressão pode ser fornecido pela linha de celular de câncer de cólon humano HT29, que foi encontrado para ser DR3-deficiente. Além disso, na clínica, cancros do cólon são insensíveis a medicamentos antimitóticos19.
Neste artigo, descrevemos um método que permite a geração de uma linhagem de células estáveis de HT29-DR3 através de infecção retroviral. Ainda mais, nós mostramos como validar a expressão DR3 nestas células usando a mancha ocidental e como avaliar a sensibilidade aos agentes antimitóticos usando um ensaio da viabilidade celular e observação morfológica. As células são amplificadas de clones único e, assim, têm a vantagem de um fundo genético homogênea. Além disso, o tag da bandeira no DR3 permitido para a visualização de DR3 celular por microscopia e análise da interação de expressão e da proteína do gene por abordagens bioquímicas. Além disso, as células podem ser xenografted em ratos para analisar mais a progressão do tumor em resposta a antimitotics no vivo14.
O sistema de célula de HT29-DR3 apresentado aqui ofereceu uma ferramenta eficaz para estudar os mecanismos moleculares de como antimitotics matar células de câncer14. Desde superexpressão e linhas celulares "knockdown" são ferramentas comuns para estudar a função do gene, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros genes de interesse ou outras linhas de células e, assim, transformou-se uma abordagem amplamente utilizada.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>Suplementado com 10% de FBS e 1% de Penicilina/Estreptomicina</td></tr><tr><td>Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Dimetil-1,5-diazaundecametileno polimetobromida</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Reagente de transfecção</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-bandeira</td><td>Linha celular Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29 Linha celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A Linha celular</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonagem</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Leitor multimodo de imagem celular</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 Microscópio invertido</td> Placas <td></td> de cultura de células de 12 <td>poços Placas</td><td></td></tr><tr><td>de cultura de células de 12 poços</td><td>Placas</td><td>de cultura de células Nest 712001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Tubos</td><td>de</td> centrífuga de 15 mL Nest 705001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro estéril</td> Centrífuga <td>SLGP033RB</td><td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de Poliestireno Branco de 96 Poços&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL Substrate</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Descolorindo Shaker&nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Meio</td><td>Thermo</td><td>Fisher 31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de linhas de celulares superexpressão dr3 para avaliar a resposta apoptotic a terapêutica antimitótica

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Estudar a função de um gene de interesse pode ser conseguido manipulando o seu nível de expressão, tais como diminuindo sua expressão com linhagens celulares "knockdown" ou aumentando a sua expressão com linhas de células de superexpressão. Transfecção transiente e estável são dois métodos que são usados frequentemente para a expressão dos genes exógenos. Transfecção transiente é útil somente para expressão de curto prazo, Considerando que transfection estável permite que genes exógenos ser integrado no genoma da célula de acolhimento onde ele será continuamente expressa. Como resultado, transfection estável é geralmente empregado para pesquisa em regulamento genético a longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo simples para gerar uma linha de celular estável superexpressão do receptor de morte marcou 3 (DR3) para explorar a função DR3. Nós escolhemos o único clones após uma infecção retroviral a fim de manter a homogeneidade e a pureza das linhas celulares estável. As linhas de célula estável geradas usando este protocolo processam DR3-deficiente HT29 células sensíveis às drogas antimitóticas, assim, reconstituir a resposta de apoptose em células HT29. Além disso, o tag da bandeira no DR3 compensa a indisponibilidade de bom anticorpo DR3 e facilita o estudo bioquímico do mecanismo molecular pelo qual agentes antimitóticos induzem apoptose.

Uma caracterização das pilhas HT29 estàvel expressando DR3 é mostrada na Figura 1. Os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem, que serve como um controle negativo, não mostram a expressão dos genes exógenos. Aqui mostramos apenas cinco clones, entre os quais clonar 1 e 5 expressam o alto nível de DR3. Nós escolhemos o clone 1 e 5 para os experimentos seguintes.
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Estabelecer uma linha de celular estável superexpressão de um gene de interesse para estudar a função do gene pode ser feito por estável do transfection-colheita única clones, depois transfecting-los através de infecção retroviral. Aqui nós mostramos que linhas de célula HT29-DR3 geradas desta forma elucidar os mecanismos pelos qual morte receptor 3 (DR3) contribui para a apoptose induzida por antimitotics.

Estabelecimento de linhas de celulares superexpressão DR3 para avaliar a resposta Apoptotic a terapêutica antimitótica

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

A superexpressão de genes nas células é uma maneira importante de estudar a função genética. Transfecção estável com o retrovírus permite que genes endógenos sejam integrados ao genoma hospedeiro e sejam expressos continuamente. Pegamos colônias únicas da infecção retroviral e geramos linhas de células estáveis superexpressando DR3 com marca de BANDEIRA.As linhas celulares compensaram a indisponibilidade de um bom anticorpo DR3 e forneceram excelentes ferramentas para o estudo da função DR3 pós in vitro e in vivo. Geramos as linhas de células de superexpressão DR3 captando uma única colônia da infecção retroviral. Linhas celulares de uma única colônia poderiam manter a homogeneidade e pureza.Além disso, o protocolo é fácil e simples de manusear. Para iniciar este procedimento, cresça células plat-A durante a noite em pratos de 60 milímetros com quatro mililitros de DMEM. Quando as células atingem 80 a 90% de confluência, use reagente de transfecção para transfetá-las com dois microgramas do plasmídeo construído, conforme descrito no manual do fabricante.Depois de 72 horas, pegue o supernaspe. Usando um filtro estéril de 0,45 micrômetro, filtre a mídia e mantenha a suspensão viral no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, cultivar células HT29 durante a noite em um prato de 60 milímetros com DMEM, incubando as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Quando as células atingem 30 a 50% de confluência, infecte-as com dois mililitros de suspensão viral na presença de oito microgramas de polibreno por mililitro de suspensão viral. Incubar as células infectadas a 37 graus Celsius por quatro a seis horas. Então, aspirar a suspensão viral.Adicione quatro mililitros de DMEM frescos e devolva o prato para a incubadora. Às 24 horas após a infecção, remova a mídia dos pratos e lave cuidadosamente as células com dois mililitros de PBS pré-aquecidos. Adicione um mililitro de trippsina EDTA, e incuba as células a 37 graus Celsius por três minutos.Usando um microscópio a 10 vezes a ampliação, observe as células para garantir que a maioria delas tenha se destacado. Depois disso, adicione dois mililitros de DMEM contendo 10% de FBS para parar a trippsinização e colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente, e remover o supernatante.Suspenda a pelota da célula em 10 mililitros de DMEM e aplique suavemente para cima e para baixo para misturar. Em seguida, diluir as células por fatores de 30, 100 e 300. Sementes as células são pratos de 150 milímetros que cada um contém 20 mililitros de DMEM contendo blasticidina a uma concentração de um micrograma por mililitro.Incubar a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por aproximadamente uma a duas semanas. Durante esse período, use um microscópio invertido a 10 vezes a ampliação para observar as colônias todos os dias. Marque as colônias bem isoladas na parte inferior do prato quando o diâmetro das colônias é de aproximadamente um a dois milímetros.Quando o período de incubação estiver completo, aspire o meio e lave as células com três mililitros de PBS pré-aquecidos. Adicione dois mililitros de trippsina EDTA em um prato de 60 milímetros. Use fórceps estéreis para pegar cilindros de clonagem estéril autoclavados e colocá-los no prato.Em seguida, pegue os cilindros que agora contêm aproximadamente 30 microliters de trypsin EDTA, e coloque-os suavemente sobre as colônias marcadas. Devolva o prato para a incubadora por três minutos. Depois disso, verifique as células sob um microscópio para garantir que elas se separaram.Quando as células se levantarem, a 70 microliters de cultura média a cada cilindro para inativar a trippsina. Use uma pipeta de 200 microliter para misturar suavemente a suspensão da célula, certificando-se de não mover o cilindro durante a mistura. Coloque duas placas de 24 poços, e rotule-as de placa A e placa B.Adicione um mililitro de DMEM a cada poço.Adicione 30 microliters de suspensão celular a cada poço da placa A, e adicione 70 microliters aos poços correspondentes da placa B.Coloque as placas de volta na incubadora. Quando as células da placa B estiverem com 90% de confluência, remova a mídia e lave cuidadosamente as células com um mililitro de PBS. Remova completamente o PBS e adicione 50 microliters de 1X buffer de carregamento SDS-PAGE para lise as células.Após cinco minutos, transfira o lisecelular da placa de 24 poços para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Ferva as amostras a 100 graus Celsius por 10 minutos. Execute as amostras em gel de 10% SDS a uma tensão constante de 80 volts por 15 minutos e depois a 120 volts por uma hora.Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de flúor de polivinida por transferência molhada a uma corrente constante de 400 miliamperes por duas horas. Diluir o anticorpo primário por um fator de 5.000 em 5% de leite sem gordura que é dissolvido em TBST. Adicione o anticorpo FLAG à membrana e incubar a quatro graus Celsius durante a noite.Utilizando um agitador decoloramento definido para 200 RPM, lave a membrana com TBST por 15 minutos, atualizando o TBST a cada cinco minutos. Em seguida, diluir um anticorpo secundário anti-rato por um fator de 10.000 em leite sem gordura de 5%. Incubar a membrana com anticorpo secundário diluído a quatro graus Celsius por cinco a seis horas.Lave a membrana no agitador decoloramento novamente como descrito anteriormente. Depois disso, use a chemiluminescência aprimorada ocidental e um sistema de documentação de gel para imagem da membrana e detectar a expressão FLAG. Primeiro, colete as células HT29 e HT29-DR3 por tentativa de insinização, e use um contador automático de células para medir a densidade celular.Semear as células nos poços de placas de 12 poços com DMEM a uma densidade de 30.000 células por poço, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 10 nanomolares de diazonamida a cada poço que contenha células usando 1%DMSO como controle negativo, e transfira as placas para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas de tratamento, imagem as células sob um microscópio a 10 vezes a ampliação.Em seguida, sementes ambas as células HT29 e HT29-DR3 nos poços de placa de 96 poços com DMEM a uma densidade de 3.000 células por poço, e permitem que elas cresçam a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione concentrações de diazonamida de aumento de dose, conforme descrito no protocolo de texto. Após 48 horas de tratamento, use um kit de ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência para medir a viabilidade celular.Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixe-a em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de reagentes de ensaio a cada poço, e agite a placa por dois minutos à temperatura ambiente para lise as células. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, usar um leitor de microplaca para determinar a luminescência de cada poço.A caracterização das células HT29 expressando o DR3 revela que os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem não mostram expressão genética exógena. Os genes um e cinco são vistos para expressar os mais altos níveis de DR3, e por isso são escolhidos para outros experimentos. A morfologia das células HT29 e HT29-DR3 são observadas após serem tratadas por 48 horas com diazonamida.As células HT29-DR3 exibem apoptose óbvia com uma membrana celular quebrada e detritos celulares. No entanto, as células HT29 mostram apenas apreensão mitótica com células intactas que exibem uma forma de célula arredondada. A viabilidade celular desses tipos de células é então determinada após ser tratada por 48 horas com três nanomolares de diazonamida.As células HT29-DR3 são vistas com uma morte celular de mais de 80%, enquanto as células HT29 parentais demonstram apenas uma ligeira resposta na forma de prisão mitótica. Isso indica que a superexpressão do DR3 reconstituiu a via apoptóica induzida pela diazonamida nessas células. Diluições seriais adequadas são importantes para obter a densidade ideal de clones únicos.Também é importante garantir que cada cilindro clone contenha apenas uma colônia e evite contaminar colônias próximas. As linhas celulares superexpressas dr3 facilitaram o estudo bioquímico dos mecanismos moleculares in vitro. Geramos xenoenxertos HT29-DR3 através de injeção subcutânea de células HT29-DR3, e ajudou a elaborar os mecanismos de apoptose induzida por agentes antimitóticos in vivo.Este protocolo pode ser usado para estudar genes de interesse em outras linhas celulares. Além disso, o gene knockout é outra maneira de estudo funcional, e nosso protocolo pode ser adaptado aos sistemas de knockdown genético. Assim, é geralmente aplicável a funções genéticas elucidadas.Lembre-se de deixar cair o relé do vírus no lixo para recipientes específicos para descarte de segurança.

establishing-cell-lines-overexpressing-dr3-to-assess-apoptotic

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