Name: Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a investigar dependências genéticas em leucemia mieloide aguda usando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9 e citometria de fluxo. Este método rápido e escalável acelera a pesquisa oncológica.

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O plasmídeo pCW-Cas9 foi um presente de Eric Lander & David Sabatini (plasmídeo Addgene # 50661) e o pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmídeo W do laboratório Yusa (plasmídeo Addgene #67974. Gostaríamos de agradecer o núcleo de citometria de fluxo no SBP Medical Discovery Institute ajuda oportuna com análise de fluxo e triagem. Nós gostaríamos de reconhecer o apoio da Fundação Memorial Lady Tata a A.D. Gostaríamos de agradecer também o apoio das seguintes fontes de financiamento: NIH/ICN P30 CA030199 Cancer Center patrocinado Grant, a V-Fundação e centros de câncer NCI de San Diego (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. gerar Clones de linha celular AML com alta expressão de Cas9 estável e ativo
<ol><li>Produção de lentivirus Cas9
	<ol>
<li>Dia 0: Placa de 4 x 106 293T células em 10 mL de DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e a penicilina e a L-glutamina em um prato de cultura de tecido de 10 cm em um nível 2 de biossegurança (BSL2) certificado capa de cultura de células. Coloque o prato em uma incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Dia 1: As células 293T chapeado devem ser confluente de 70 a 80% no dia 1. Execute o transfeccao usando o protocolo seguinte à tarde.</li>
		<li>Aquecer a transfeccao, meios de cultura e reagente de transfeccao à temperatura ambiente. Descongele todos os plasmideos exigidos para transfeccao.</li>
		<li>Mix 9 µ g de psPAX2, 0,9 µ g de pMD2.G e 9 µ g de pLenti-Cas9 plasmídeos com 500 µ l de meio de transfeccao em um tubo de 5 mL.</li>
		<li>Adicione 1,7 mL de meio de Transfeccao para um 14 mL redonda tubo inferior. Adicione 57 µ l de reagente de transfeccao diretamente no meio de transfeccao dentro do tubo para evitar tocar a parede do tubo.</li>
		<li>Acrescente a mistura inteira do plasmídeo para solução de reagente de transfeccao e misture batendo suavemente o tubo do lado. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20 a 30 min. Enquanto isso, mude o meio da placa de 293T semeado.</li>
		<li>Adicione a mistura de transfeccao, gota a gota, a placa e agitar suavemente a placa para o lado para uma mistura eficiente. Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Dia 2: Aspire o sobrenadante da placa de transfeccao suavemente tal que as células não são perturbadas ou desalojadas da placa. Desprezar o sobrenadante. Adicione 10 mL de meio fresco de DMEM 10% deslizando suavemente para baixo dos lados da placa para evitar desalojar as células.</li>
		<li>Dia 3: Colete o vírus contendo sobrenadante da placa de transfeccao lentamente por desenhá-lo para uma seringa estéril de 10 cm. Depois que o sobrenadante é recolhido para a seringa, coloque um filtro estéril de µM 0.45 a seringa e mantenha a seringa e o filtro sobre um tubo cónico polipropileno de fresco, estéril 15 mL. Mergulhar suavemente a seringa para filtrar o vírus contendo sobrenadante através do filtro de 0,45 µM no tubo polipropileno cônico de 15 mL.</li>
		<li>Loja meio condicionado viral em alíquotas de 2 mL em 2 mL cryovials a-80 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Transdução da linha celular de LMA
	<ol>
<li>Dia -1: Diluir 1 mg/mL caldo de fragmento fibronectina humana recombinante a 10 µ g/mL com solução salina tampão fosfato (PBS). Casaco de uma cultura de não-tecidos tratados 6 placa bem com 2 mL da solução de trabalho de 10 µ g/mL fibronectina humana recombinante fragmento em uma capa de cultura de células BSL2 aprovado. Embrulhe o prato em filme plástico para evitar a perda por evaporação e armazenar à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>Dia 0: Descongele o sobrenadante viral contendo Cas9. Aspire a solução do fragmento recombinante humano fibronectina completamente da placa revestida antes spinfection. Adicionar 2 mL do meio condicionado viral com Cas9 à placa e girá-lo em 1.300 x g durante 90 min a 35 ° C. Isso ajuda as partículas virais anexar para o spinfected bem.</li>
		<li>Enquanto isso, contar as células para ser transformados e spin-down 2 x 106 células em um tubo cónico polipropileno de 15 mL. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2 mL de meio de cultura fresco.</li>
		<li>Após spinfection, retire todo o sobrenadante viral a spinfected bem e descarte. Retrovirais partículas do líquido sobrenadante estão ligadas à parte inferior do spinfected bem. Para isso, adicione as 2 x 106 células resuspended em 2 mL do meio da etapa acima.</li>
		<li>Gire a placa novamente a 1.300 x g muito rapidamente (1 a 2 min) suficiente para permitir que as células de assentar no fundo. Coloque a placa de volta para a incubadora e deixar durante a noite para transdução com partículas virais spinfected anexadas ao poço.</li>
		<li>Dia 1: Dependendo da densidade da célula, adicione mais meio às células transduzidas para evitar o crescimento excessivo.</li>
		<li>Dia 2: Desde o plasmídeo pLenti-Cas9 tem um marcador de resistência Blasticidin, adicione Blasticidin em uma dose de 10 µ g/mL para transduzidas e untransduced (controle) MOLM13 ou células de leucemia do MLL-AF9 para a seleção de Cas9 expressando as células. Nota: Seleção de Blasticidin dos Cas9-transfectadas MOLM13 ou MLL-AF9 células de leucemia é considerada completa quando todas as células de untransduced controle foram eliminadas. Para linhas de célula diferente MOLM13 e MLL-AF9 leucemia, uma curva de resposta de dose deve ser realizada antes desta experiência para que uma dose ideal pode ser empregada. Titulação do sobrenadante viral também pode ser executada no caso de taxas de baixo-transdução.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleção de células expressando alta-Cas9 de clone. Nota: Notamos que em algumas linhas de célula AML, seleção de clone pode não ser necessária: a maior população de Cas9-Blasticidin selecionado já tem alta eficiência de edição de genoma. Neste caso, é possível pular a etapa 1.3 e passar para a etapa 1.4 para avaliar Cas9 expressão nas células AML granel Cas9-blasticidin pela mancha ocidental. Ainda seria importante avaliar a eficiência de edição de gene naquelas celas de granel Cas9-AML (passo 1.5) antes de prosseguir para os concurso de ensaios. Supomos que a seleção de clones de alta-Cas9 única reduz a variabilidade de edição de genoma, que é especialmente importante quando o teste um número de guia único diferente RNAs (sgRNAs).<ol>
<li>Realize uma única célula tipo do Blasticidin-Cas9 selecionado as células de leucemia MOLM13 e MLL-AF9 doravante chamadas MOLM13-Cas9 e células MLL-AF9-Cas9, respectivamente, usando um classificador de FACS contido em uma capa de BSL2 aprovado. Classificação pode ser realizada em 5 – 10 fundo redondo cultura de não-tecidos 96 bem placas tratadas.</li>
		<li>Uma vez única MOLM13-Cas9 e clones de MLL-AF9-Cas9 tem sido escolhidos e nomeado individualmente, expanda clones de 10 – 20 com 10 µ g/mL de Blasticidin em meios de cultura para garantir a manutenção da expressão Cas9.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificar expressão da proteína de Cas9 estável immunoblotting.
	<ol>
<li>Fazer extratos nucleares de todos os clones selecionado de Blasticidin de leucemia MOLM13 e MLL-AF9 usando o Kit de extração Nuclear conforme o protocolo do fabricante. Verifica a expressão de proteínas Cas9 usando antibandeira M2 anticorpo desde o Cas9 no plasmídeo pLenti-Cas9 está ligado a um epítopo do N-terminal bandeira.</li>
		<li>Carrega 50 µ g de proteínas totais de cada extrato nuclear para 10%, Bis-Tris gel e funcione o gel em 120 V até bandas superiores são bem separadas.</li>
		<li>Bloquear a membrana com solução de leite de 5% em tampão TBST por 1h.</li>
		<li>Incube a membrana com 1:1,000 diluição do antibody de anti-Flag M2 em uma concentração final de 1 µ g/mL a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte, lave a membrana com buffer TBST e incubar com HRP anti-rato secundário anticorpo conjugado a uma diluição de 1:5,000 (concentração final de 0,16 µ g/mL) à temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Lavar a membrana cuidadosamente com TBST e desenvolver o blot utilizando substrato ECL.</li>
		<li>Escolha 3 – 4 clones com a mais alta expressão da proteína de Cas9 visto pela mancha ocidental para analise posterior funcional (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Garantindo alta atividade Cas9 em clones selecionados
	<ol>
<li>Preparar Lentivirus sobrenadante de um vetor de codificação de sgRNA com sgRNAs visando o ser humano ou mouse AAVS1 locus de porto seguro, como descrito no passo 1.1.</li>
		<li>Transduce topo MOLM13 Cas9-expressando ou leucemia MLL-AF9 clones com o sobrenadante Lentivirus de anti-AAVS1 sgRNA usando o spinfection método descrito acima. Selecione com puromicina de 2,5 µ g/mL durante 4 dias.</li>
		<li>Purifica o DNA genômico dos clones de leucemia MOLM13-Cas9 ou MLL-AF9-Cas9 após puromicina juntamente com os respectivos controles de tipo selvagem usando o kit de extração de DNA genômico conforme as instruções do fabricante. Uso 50 ng de DNA como um modelo para realizar uma PCR com o AAVS1_test_primers usando 2 x mestre mistura do Polymerase de Taq e o programa PCR listados na tabela 1.</li>
		<li>Executar o produto do PCR em um gel de agarose 2% e gel-purificar a banda 268 pares de base usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante. Sequência de Sanger gel purificada produto do PCR usando o primer AAVS1_target-frag_F.</li>
		<li>Avalie a eficiência de edição pela comparação entre o AAVS1 editada e sua sequências usando ferramentas baseadas na web on-line (Figura 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. clonagem e transdução de sgRNAs nas células da LMA-Cas9
<ol><li>
Rendimento médio de clonagem de sgRNAs
	<ol>
<li>Projeto 4 – 6 sgRNAs para o gene de interesse usando um software de design CRISPR baseado na web. Há um número de ferramentas de design CRISPR disponíveis on-line tais como http://crispr.mit.edu/ que geram sequências de sgRNA com base em uma sequência de DNA a entrada.<ol>
<li>Preencha uma informações apropriadas nos campos com asteriscos. Clique no genoma alvo para o projeto de sgRNA. Cole a sequência de destino na caixa sequência e clique no botão Enviar .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para clonagem na pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmídeo de expressão sgRNA W, preceder os nucleotídeos "CACC" para o sentido do oligo e "AAAC" para o reverso oligo antisentido complementado antes de encomendar. Os oligos sentido e antiordem sentido pré-misturado em uma placa de 96 poços rotulados Oligo-Mix de uma empresa de síntese do oligonucleotide. Nota: Temos feito uso da pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmídeo de W, que tem o site de restrição BbsI para sgRNA clonagem. No caso de outro plasmídeo de expressão sgRNA é usado, as saliências usadas para os oligonucleotides sgRNA precisam ser alterado em conformidade.</li>
		<li>Pegue uma separado placa de 96 poços de fundo U rotulada Placa de recozimento. Faça uma mistura de mestre de 1 µ l T4 PNK, 1 µ l de 10x buffer de ligadura do ADN T4 e 6 µ l de água por reação de recozimento.</li>
		<li>Adicione 8 µ l do mix mestre para cada poço da placa de recozimento. Adicione 1 µ l de 100 µM cada, sentido e antisentido oligo (ou 2 µ l de oligos mistos de sentido-antisentido) à mistura de mestre. Pipetar 2 – 3 vezes suavemente para misturar bem, girar a placa brevemente para obter a mistura para o fundo dos poços.</li>
		<li>Use o seguinte programa de recozimento em uma máquina PCR: 30 min a 37 ° C, 2 min 30 s a 95 ° C seguido de resfriamento lento a 22 ° C, à taxa de 0,1 ° C/s. Após recozimento, leve um prato de 96 poços fresco rotulado OligoMix diluído. Esta placa, dilua os oligos fosforilada e recozido da reação acima com água (1: 200), usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Digest 5 µ g de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vetor da W, com 1,5 µ l de enzima de restrição BbsI (10.000 unidades/mL), usando um amortecedor apropriado a 37 ° C por 2 h para linearizar-para ligadura mais tarde.</li>
		<li>Pegue um prato bem fresco 96 rotulados Ligadura da placa e adicione 20 ng da BbsI digerido (BbsI) - PGKpuro2ABFP - pKLV2-U6gRNA5 vetor W a um poço por ligadura sgRNA desejado. Para isso, adicione 2 µ l de oligos fosforilados, recozidos da placa OligoMix diluído .</li>
		<li>Adicione 1 µ l de tampão de ligase x T4 10 e 1 µ l da enzima T4 DNA Ligase. Delicadamente, pipetar com uma pipeta multicanal e incubar a mistura de ligadura em temperatura ambiente por 2 h. Nota: Misturas de ligadura podem ser armazenadas a-20 ° C durante a etapa de transformação mais tarde.</li>
		<li>Enquanto isso, o degelo 90 µ l de quimicamente competentes de Escherichia coli células no gelo 10 min antes do final da etapa de ligadura.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, fazer 10 alíquotas µ l de células competentes em cada poço da placa 96 bem separados.</li>
		<li>Adicione a mistura de ligadura da etapa 2.1.8 no bem contendo as células competentes, pipeta de cima e para baixo suavemente e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Pipeta de 5 µ l do mix bactérias-DNA diretamente da reação acima em um 6 bem placa contendo LB-ágar com 100 mg/mL ampicilina. Repita para cada uma das reações de transformação.</li>
		<li>Cada reação de transformação em um separado etiquetado bem de uma placa de 6 da placa. Adicione aproximadamente os grânulos de vidro de 5 a 8 para cada bem e agitar a placa toda 6 8 a 10 vezes em um movimento circular.</li>
		<li>Escolha 1 – 2 colônias única de cada poço com uma ponta de pipeta estéril 20 µ l e raia-lo em um local cuidadosamente rotulado em uma estéril 10cm placa de Petri com ágar LB e 100 mg/mL ampicilina. Depois de estrias em placa de LB, simplesmente Ejete a ponta usada para clone estrias em 3 mL de LB-Ampicillin médio contendo em um mL 14 redondo tubo inferior marcado com o número correspondente de clone bacteriana.</li>
		<li>Enviar a placa bacteriana diretamente para Sanger sequenciando com primer promotor U6 humana para a frente.</li>
		<li>Após a confirmação da sequência de sgRNAs clonado, purifica o DNA do correspondente tubo 14 mL usando um kit de mini-preparação de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Medir a concentração e a qualidade de cada um dos minipreparações com um espectrofotômetro. Normalize a cada mini-preparação a uma concentração de 15 ng / µ l e pipeta em um prato bem 96 rotulados sgRNA placa de Clones. Nota: Este prato pode ser armazenado a-20 ° C ou usado diretamente para a preparação de vírus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Produção viral de sgRNA construções e transdução
	<ol>
<li>Para a produção de particulas de Lentivirus de sgRNA no formato de 96 poços, siga o "shRNA/sgRNA/ORF alto Throughput produção Viral (96 bem)" protocolo da plataforma de perturbação genética (web Portal do GPP) do Instituto Broad (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).</li>
		<li>Transferência de 200 µ l do sobrenadante viral para tubos estéreis e congelar a-80 ° C imediatamente.</li>
		<li>Dia -1: Revesti uma parte inferior lisa Non-tecido tratada 96 bem placa de cultura com 100 µ l de fragmento de fibronectina humana recombinante em uma concentração de 10 µ g/mL em uma capa de cultura de células BSL2. Embrulhe o prato com filme plástico para evitar perda de evaporação e deixá-lo no banco durante a noite.</li>
		<li>Dia 0: Remova o fragmento de fibronectina humana recombinante de cada poço. Descongele o sobrenadante viral de cada sgRNA à temperatura ambiente. Adicione 50 µ l do sobrenadante viral de cada tubo a cada revestido bem da placa de transdução. Girar a placa de transdução em 1.300 x g durante 90 minutos a 35 ° C.</li>
		<li>No final do spinfection, conta MOLM13-Cas9 (clone B3) células do frasco de cultura. Use a 10.000 células por poço no volume 100 µ l. Conte as células de todos os poços de transdução, atendendo volume morto.</li>
		<li>Após o spinfection de 90 min, remova o sobrenadante de todos os poços utilizando uma pipeta multicanal ajustada a 50 µ l lentamente pela inclinação da placa. Adicione 100 µ l de cultura de células de MOLM13-Cas9 clone B3 para cada bem lentamente deslizando para baixo da borda.</li>
		<li>Gire a placa a 1.300 x g por 2 min a 35 ° C, para permitir que as células resolver na parte inferior. Transfira a placa para a incubadora de grau de cultura de tecidos de 37 ° C.</li>
		<li>Dia 1: Adicione 100 µ l de meio fresco para cada bem contendo sgRNA transfectadas Cas9-MOLM13 ou células de leucemia Cas9-MLL-AF9 tal que o volume médio final é 200 µ l.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ensaio de crescimento competitiva
<ol><li>Dia 3: 72 h (dia 3) post transdução, verificar a porcentagem de sgRNA contendo células positivas BFP em cada poço por citometria de fluxo (FACS). Use uma tintura de viabilidade celular para marcar e excluir as células mortas da análise.</li>
	<li>Continue a re-chapeamento uma proporção das células em novos poços com meio fresco após cada análise de FACS para evitar o crescimento excessivo durante o ensaio.</li>
	<li>
Repeti a análise de FACS cada 2-3 dias para verificar a proporção relativa de BFP positivo (BFP + ve) células em comparação com as contrapartes BFP negativas (BFP-ve) (Figura 3). Analise a porcentagem de células positivas BFP para cada ponto de tempo (usando o FlowJo ou o software de análise de FACS similar).
	<ol>
<li>Arraste arquivos Fcs para cada amostra a FlowJo software. Clique duas vezes em qualquer arquivo de uma amostra e plotar um borrão do ponto de dispersão para a frente (FSC) vs lado dispersão (CCD) com FSC na X eixo e SSC no eixo Y. Portão de todas as células.</li>
		<li>Clique duas vezes sobre as células fechadas e parcela-las na mancha de viabilidade (no eixo Y) vs FSC altura (H) ou borrão do ponto de área (A). Portão a viabilidade mancha negativas células (ao vivo).</li>
		<li>Clique duas vezes em células vivas fechadas e plotar BFP (no eixo de Y) vs FSC (A) no eixo X. Portão BFP + ve as células. Aplicam-se todas estas portas para todas as amostras, arrastando a amostra selecionada para Todas as amostras sob a guia do grupo .</li>
		<li>Clique no Editor de tabela para fazer uma tabela de análise das amostras. Arraste o BFP + ve contagem de uma amostra para a tabela e clique no botão Exibir no Editor de tabela para criar um relatório de lote das amostras com uma tabela que exibe a porcentagem de células BFP + ve . Salve a tabela como um xls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular o proporcional aumento ou diminuição de células positivas de % BFP dentro da população de células vivas ao longo do tempo e comparar esta relação com a proporção de células positivas BFP no sgRNAs de controle (como luciferase, mexidos ou sgRNA GFP).</li>
	<li>Traça a proporção de células positivas BFP para os sgRNAs diferentes, incluindo os genes de interesse, bem como controles usando dia 3 como linha de base.</li>
</ol>

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<li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).</li>
</ol>

A.J.D é consultor de fármacos A2A (Nova Jersey) e Salgomed Therapeutics (San Diego). Outros autores não têm nenhum conflito para declarar.

Este manuscrito, descrevemos um protocolo detalhado para a realização de um ensaio de crescimento competitivo CRISPR-Cas9-baseado para investigar o papel de genes candidatos em linhas de células de LMA usando citometria de fluxo em células de LMA murino/humano (Figura 5). O objetivo do ensaio é identificar o efeito de supressão do gene na manutenção da proliferação celular AML mais de duas a três semanas em uma escala de rendimento médio. Alguns passos críticos precisam ser seguidos cuidados...

Nas últimas décadas tem visto inúmeros esforços de pesquisa focados em identificar a contribuição das principais vias moleculares na patogênese da leucemia mieloide aguda (LMA). Tradicionalmente, gene-interrupção nas células da LMA foi realizado utilizando camundongos knockout condicional ou RNA curto-gancho de cabelo (shRNA). Enquanto ratos do KO oferecem um sistema sofisticado para controle espaço-temporal de gene-exclusão, gerar os ratos nocaute do gene é trabalhoso, demorado e caro. Além disso, gene-nocautes usar estratégias de recombinação não é facilmente escalável; Estas estratégias não se prestam bem para o interrogatório de vários genes em paralelo. Após a descoberta de métodos de interferência do RNA de mRNAs endógenos de knock-down usando o RNA de interferência pequeno (siRNA) ou shRNA, muitos grupos começaram a usar técnicas de interferência do RNA para investigar o papel de genes específicos na LMA. Desde que as células de LMA murino e humanas são notoriamente difíceis de transfect usando métodos tradicionais baseados em lipídios transfeccao, maioria estuda shRNA trabalhador assalariado, lentivirally ou retrovirally-codificado para estudar a função dos genes em células de LMA. A recente descoberta do cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) e as associado nucleases de Cas (CRISPR-Cas9) revolucionou a gene-alvo tecnologias1,2,3. Usando CRISPR-Cas9, genes específicos ou regiões genômicas podem ser excluídas, edição ou marcadas com facilidade e eficiência. CRISPR Cas9-gene-edição baseada está a emergir como o método de escolha para investigar relações genótipo-para-fenótipo em tipos de células diferentes devido a simplicidade, eficácia e ampla aplicabilidade desta técnica. Métodos baseados em CRISPR-Cas9 também estão se tornando o método de escolha na LMA, não só para interrogar os genes individuais, mas também como uma maneira de atingir múltiplos genes na matriz ou em pool genéticos telas destinadas a investigar vários genes em paralelo como potencial AML-dependências4,5,6.
Este manuscrito, descrevemos um ensaio de crescimento competitivo simples para medir o impacto do gene-perturbação no crescimento de células da LMA, com base em estável CRISPR Cas9-mediada por gene-edição seguido por citometria de fluxo elevado-throughput. Este método é simples, eficiente e escalável para médio-taxa de transferência experiências para investigar o papel de vários genes em paralelo nas células da LMA.

<table><tbody><tr><td>FLAG-M2 Anticorpo</td><td>sigma-aldrich</td><td>F3165, lote # SLBS3530V</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato</td><td>Invitrogen</td><td>31446, lote # TA2514341</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade Máxima</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>BIO RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo</td><td>Fisher 15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS)</td><td>SAFC</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>vetor de gRNA único</td><td>Addgene #67974</td><td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td><td></td></tr><tr><td>CelLytic Kit de extração nuclear</td><td>sigma-alorich</td><td>NXTRACT</td><td></td></tr><tr><td>XtremeGENE 9</td><td>sigma-alorich</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Retronectina</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEBioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 tampão de ligação de DNA</td><td>NEBioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase enzima</td><td>NEBioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher científica</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>LB ágar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9731-500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de mini-preparação Qiagen</td><td>Espectrofotômetro NanoDrop Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Murine Recombinante IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Murine Recombinante IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF murino recombinante</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes estáveis</td><td>NEBiolabs</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultura de tecidos</td> Solução de lise <td>de células 353003</td><td></td>da <td>Fisher Scientific</td></tr><tr>Solução de<td>precipitação</td><td>de</td> proteínas <td>Qiagen</td> 158906 <td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidratação de DNA</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BbSI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit</td><td>Genessee Scientific</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos</td> <td>de polipropileno de 50 mLTubos</td> cônicos de polipropileno Fisher scientific <td>1495949A</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr></tbody></table>

investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em crispr-cas9

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Estudos de perturbação do gene têm sido amplamente utilizados para investigar o papel dos genes individuais na patogênese da LMA. Para alcançar a interrupção completa do gene, muitos desses estudos fizeram uso de modelos de complexo gene nocaute. Enquanto estes estudos com camundongos knockout para oferecer um sistema elegante e já testado para investigar as relações genótipo-para-fenótipo, um método rápido e escalável para avaliar genes candidatos que jogar um papel na proliferação celular de LMA ou sobrevivência em modelos de LMA ajudará a acelerar o interrogatório paralelo de múltiplos genes candidatos. Recentes avanços em tecnologias de edição de genoma melhoraram drasticamente nossa capacidade de executar perturbações genéticas em uma escala sem precedentes. Um tal sistema de edição de genoma é o método CRISPR Cas9-baseada que pode ser usado para fazer alterações rápidas e eficazes no genoma de célula de destino. A facilidade e a escalabilidade do gene-exclusão CRISPR/Cas9-mediada torna uma das técnicas mais atraentes para o interrogatório de um grande número de genes em ensaios fenotípicos. Aqui, apresentamos um ensaio simples usando CRISPR/Cas9 mediada gene-interrupção combinado com alta produtividade fluxo cytometry-concorrência baseada nos ensaios para investigar o papel dos genes que podem desempenhar um papel importante na proliferação ou sobrevivência de humanos e linhas de célula murino AML.

Em nosso estudo, nós primeiro transfectadas MOLM13 humana AML linhagem celular que leva a translocação de MLL-AF9 com vírus de alta-Título codificação o plasmídeo de Lentivirus Cas9-blasticidin. Em nossas mãos, em massa de células de MOLM13-Cas9 não seleccionadas não exibir alto nível Cas9 expressão pela mancha ocidental e também não executou bem quando analisada por gene eficiente edição-usando o método descrito anteriormente7. Por conseguinte, procedeu-se a estab...

Este manuscrito descreve um método de CRISPR-Cas9-baseado em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repete (CRISPR) para investigação célere e simples do papel dos vários genes candidatos na proliferação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) em paralelo. Esta técnica é escalável e pode ser aplicada em outras linhas de células de câncer também.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Este vídeo demonstrará um método simples para investigar múltiplos genes candidatos em LMA em paralelo, usando o sistema Crisper-Cas9 combinado com o ensaio de crescimento competitivo baseado em citometria de fluxo. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida e escalável. Demonstrando o procedimento será Bo Rui Chen, um pós-doutor do nosso laboratório.Um software de design CRISPR baseado na Web é usado para projetar RNAs de quatro a seis guias únicos para o gene de interesse. Para começar, preencha as informações apropriadas nos campos com asteriscos. Em seguida, selecione o genoma alvo para o design de RNA de guia único.Cole a sequência de destino na caixa de sequência e clique no botão enviar. Para clonagem no guia único desejado plasmídeo de expressão RNA, prepend os nucleotídeos CACC para o sentido oglionucleotídeo e AAAC para o oligonucleotídeo antissamparado reverso. O sentido pré-misturado e oligonucleotídeos antissamo-americanos são então encomendados de uma empresa em uma placa de 96 poços, rotulada Oligo Mix.Coloque uma placa de poço U-Bottom 96 separada, rotulada placa de annealing. Prepare uma mistura mestre de um microliter de T4 polinucleotídeo quinase, um microliter de 10x T4 tampão de ligadura de DNA, e seis microliters de água por reação de ressarcimento. Adicione 8 microliters da mistura mestre a cada poço da Placa de Enraizamento, seguido por 2 microliters de sentido pré-x e oligonucleotídeos antissamonucleotídeos.Pipeta duas a três vezes suavemente para misturar bem, e, em seguida, gire a placa brevemente para obter as misturas para o fundo dos poços. Use o seguinte programa de ressarção em uma máquina PCR. 37 graus Celsius durante 30 minutos, 95 graus Celsius por dois minutos e 30 segundos, seguido de resfriamento lento a 22 graus Celsius a uma taxa de 0,1 graus Celsius por segundo.Quando o ressarcimento estiver completo, prepare uma placa fresca de 96 poços, rotulada de Mistura Oligo Diluída, diluindo os oligonucleotídeos fosforilados e enlatados da reação de ressarcimento de um a 200 com água. Linearize o vetor de expressão RNA de guia único digerindo cinco microgramas do vetor com 1,5 microliters de enzima de restrição BBS1, usando um buffer apropriado a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, pegue uma placa de ligation fresca de 96 bem rotulada, e adicione 20 nanogramas do vetor de expressão RNA de guia único do BBS1 a um bem por ligadura de guia único desejada.Para isso, adicione 2 microliters de oligonucleotídeos relados fosfoilados da placa Oligo Mix diluída. Adicione a cada poço, um microliter de tampão de ligase 10X T4, e um microliter de enzima ligase T4, e pipeta suavemente para misturar. Incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas.Cerca de 10 minutos antes da reação de ligadura ser feita, encha 90 microliters de células E.coli quimicamente competentes no gelo. Transfira 10 alíquotas de microliter das células competentes para cada poço de uma placa de 96 bem separada individualmente. Adicione a mistura de ligadura nos poços que contêm as células competentes.Pipeta para cima e para baixo suavemente, e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Pipeta cinco microliters da bactéria DNA misturam-se de cada reação de transformação diretamente em um poço de uma placa de 6 poços, contendo ágar LB com 100 miligramas por mililitro de ampicillina. Adicione aproximadamente cinco a oito contas de vidro a cada poço, e agite a placa de 6 poços oito a dez vezes em um movimento circular.Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, escolha uma a duas colônias únicas de cada poço, com uma ponta de pipeta de 20 microliteres estéril, e coloque-a em um ponto rotulado em uma placa de petri de 10 centímetros estéril, com ágar LB e 100 miligramas por mililitro de ampicillina Depois de estiliar na placa LB, ejete a ponta em três mililitros de ampicillina média em um tubo de 14 mililitros em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros. , marcado com o número correspondente do clone bacteriano. A placa bacteriana é então enviada diretamente para sequenciamento Sanger.Após uma confirmação sequencial do guia único clonado RNAs, purifique o DNA do tubo correspondente de 14 mililitros, usando um kit miniprep de acordo com as instruções do fabricante. As partículas lentiviras de RNA guia única são produzidas em um formato de poço 96, conforme descrito no protocolo de texto. E o supernante viral é imediatamente congelado a menos 80 graus Celsius.Um dia antes da transdução de RNAs guia único em células AML Cas9, cubra uma cultura plana de fundo não tecido tratada 96 placas de poço, com 100 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Enrole a placa com envoltório de aderência para evitar a perda de evaporação e deixe-a no banco durante a noite. No dia seguinte, remova o fragmento de fibronectina humana recombinante de cada poço da placa do poço 96.Descongele o supernatante viral de cada RNA guia a temperatura ambiente. Adicione 50 microliters de supernascer viral de cada tubo a cada poço revestido da placa de transdução. Enrole a placa com envoltório de aderência para evitar contaminação potencial durante a centrifugação.Gire a placa a 1.300 vezes g a 35 graus Celsius por 90 minutos. No final da spinfecção, conte o alto Cas9 expressando células B3 do frasco de cultura. Após a contagem, abaixe o número necessário de células e resuspense em meio fresco.Após a 90 minutos de spinfection, use uma pipeta multicanal ajustada a 50 microliters para remover o sobrenante de todos os poços lentamente inclinando a placa. Adicione 100 microliter da cultura das células B3 clones a cada poço lentamente, deslizando para baixo da borda. Gire a placa a 1.300 vezes g a 35 graus Celsius por dois minutos para deixar as células se acomodarem até o fundo.Transfira a placa para uma incubadora de grau de cultura de tecido de 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 100 microliters de meio fresco a cada poço contendo células transduzidas por RNA de guia único, de tal forma que o volume médio final seja de 200 microliters. Devolva a placa para a incubadora.72 horas após a transdução, verifique a porcentagem de RNA guia único contendo células positivas de BFP em cada poço por citometria de fluxo. Use um corante de viabilidade celular para marcar e excluir células mortas da análise. Continue reescarando uma proporção das células em novos poços com meio fresco após cada análise de fatos para evitar o crescimento excessivo durante o ensaio.A cada dois ou três dias, repita a análise dos fatos para verificar a proporção relativa de células positivas de BFP em comparação com as contrapartes negativas do BFP. Analisar a porcentagem de células positivas de BFP para cada ponto de tempo, utilizando um software de análise de fatos. A chave para o sucesso do ensaio de proliferação competitiva é usar as técnicas adequadas de gating para garantir que os eventuais números de células vivas sejam precisos.Arraste arquivos FCS para cada amostra no software. Clique duas vezes em qualquer arquivo de amostra e plote um gráfico de ponto de dispersão para a frente versus dispersão lateral, com dispersão para a frente no eixo x e dispersão lateral no eixo y. Portão todas as células.Clique duas vezes nas células fechadas e local de vibilidade do gráfico no eixo y versus altura de dispersão dianteira ou gráfico de ponto de área. Portão a viabilidade mancha células negativas. Clique duas vezes nas células ao vivo fechadas e plote BFP no eixo y versus dispersão para a frente no eixo x.Portão das células positivas BFP. Aplique todos esses portões a todas as amostras arrastando a amostra selecionada para todas as amostras sob a guia do grupo. Clique no editor de tabela para fazer uma tabela de análise de todas as amostras.Arraste a contagem positiva do BFP de uma amostra para a tabela e clique no botão de exibição no editor de tabela para criar um relatório em lote de todas as amostras, com a tabela exibindo a porcentagem de células positivas de BFP. Salve a tabela como um arquivo excel. Este sistema foi usado para investigar o papel dos genes que podem desempenhar um papel na proliferação ou sobrevivência das linhas celulares humanas e murinas da LMA.O alvo do lócus de porto seguro AAVS1 com dois RNAs guia único separado não teve efeito na proliferação de células humanas MOM13 Cas9 Em contraste, quando o gene associado à replicação de DNA, RPA3, foi direcionado, observou-se um declínio progressivo e significativo no percentual de células positivas de BFP em comparação com as contrapartes negativas não traduzidas do BFP. Da mesma forma, os efeitos das RNAs de guia única visando Dot1l, um regulador epigenético, e Rhodopsin, o gene de pigmentação ocular, foram testados em células MLL-AF9 Cas9 do mouse. O guia único RNAs visando o Dot1l, mostrou um declínio dramático e progressivo na proliferação competitiva em contraste com o guia único RNAs visando Rhodopsin.Esses resultados demonstram a vulnerabilidade do MLL-AF9 expressando células de leucemia em massa ao esgotamento do Dot1l, confirmando resultados publicados anteriormente. Assumindo quatro a seis RNAs guia por gene, este método é bem adequado para ser usado para testar pelo menos 16 a 24 genes em paralelo, e também pode ser aplicado para testar dependências genéticas em qualquer linha celular cancerosa. No caso de um número maior de genes, como toda uma via molecular que precisa ser testada em células AML, as telas baseadas em pool CRISPR-Cas9 serão mais úteis.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

A entrega direta de complexos de ribonucleoproteína de RNA de Cas9/guia pré-montados é um meio rápido e eficiente para a edição de genoma em células hematopoiéticas. Aqui, nós utilizamos esta aproximação para suprimir de um silenciador intronic RUNX1 e para examinar as respostas transcricional em pilhas leucêmicas OCI-AML3.

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.

Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9

Este manuscrito descreve uma abordagem de triagem baseada em células em escala de genoma para identificar interações receptor-ligantes extracelulares.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.

Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Uma abordagem meticulosa e estruturada é dada para selecionar genes resistentes e sensíveis de radiação por meio da aplicação de um método de triagem CRISPR / Cas9 em todo o genoma. Este protocolo também tem o potencial de servir como uma estrutura versátil para outros empreendimentos de pesquisa que investigam os mecanismos de resistência a drogas químicas administradas clinicamente.

Tela CRISPR em todo o genoma para revelar genes radiossensíveis e radiorresistentes

Aprenda a investigar dependências genéticas em leucemia mieloide aguda usando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9 e citometria de fluxo. Este método rápido e escalável acelera a pesquisa oncológica.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

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