Name: Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda análise proteômica de macrófagos humanos em ambientes com baixo oxigênio usando quantificação sem rótulo. Este método permite caracterizar estados de ativação celular e padrões de expressão proteica em condições hipóxicas.

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AM é financiado pelo programa de líder do grupo de jovens (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), por la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC da Fondation pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo partir a espectrometria de massa para a plataforma de biologia (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, Paris). Agradecemos a Lauren Anderson para a leitura do manuscrito.

Amostras de sangue humano (LRSC) de doadores saudáveis, elimina identificados foram obtidas de EFS (serviço nacional de sangue da francesa) como parte de um protocolo autorizado (DC CODECOH-2018 – 3114). Os doadores deram consentimento assinado para o uso de sangue.
1. mídia e preparação de Buffer
<ol><li>Prepare o suporte de macrófagos [glutamax RPMI + 10 mM HEPES + 1 x não aminoácidos essenciais (timina)] e aquecê-lo a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar o macrófago médio + 10% de soro humano de plasma AB (SAB), filtrar (filtro de 0,22 µm) e, em seguida, esquente a 37 ° C (conhecido como macrófago médio + 10% SAB daqui em diante).</li>
	<li>Preparar o buffer de classificação [1 x salina tamponada fosfato (PBS) + 0,5% albumina de soro bovino (BSA) + ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)], filtrar (filtro de 0,22 µm) e mantê-lo em 4 ° C.</li>
</ol>2. isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) da câmara de leucorredução sistema (LRSC)
<ol><li>Colocar 15 mL de solução de separação de células gradiente de densidade (ver Tabela de materiais) em 50 mL de um tubo de centrifugação assim que pode aquecer à temperatura ambiente (RT) antes de receber o LRSC. Nota: A densidade depende da temperatura. Como este produto é armazenado em 4 ° C, esta etapa deve ser feita com antecedência, então isso pode equilibrar a RT</li>
	<li>Esvazie o LRSC em um tubo de centrifugação de 50 mL, adicionar até 50 mL de 1X PBS e misture. Muito lentamente, adicione 25 mL da mistura preparada durante a etapa 2.2 em cima de 15 mL de solução de gradiente de densidade aquecida durante a etapa 2.1. Nota: Tenha cuidado para não misturar as fases durante esta etapa. O sangue deve ser adicionado a solução de gradiente de densidade sem nenhum distúrbio desta fase.</li>
	<li>Centrifugue a ambos os tubos de centrifugação para 25 min a 700 x g, sem pausas. Nota: No final da centrifugação gradiente de densidade, as camadas de baixo para cima são: os eritrócitos e granulócitos, formando a pelota, fase de solução gradiente de densidade, camada de PBMC e plasma.</li>
	<li>Com uma pipeta, passar pela fase de plasma sem aspiração- e recolher a camada PBMC em um novo tubo de centrifugação de 50 mL. Adicione até 50 mL de 1X PBS para os PBMCs como uma etapa de lavagem e centrifugação por 10min a 300 x g.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 40 mL de meio de macrófagos.</li>
</ol>3. magnético rotulagem e isolamento de CD14+ células (monócitos)
<ol><li>Conte os PBMCs em uma câmara de Malassez. Retirar a quantidade de PBMC necessária para a realização do experimento (tipicamente 100 a 300 x 106 células), colocá-los em um tubo de centrifugação e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 80 µ l de buffer de classificação preparado durante a etapa 1.3 por 107 PBMCs. Adicionar 20 µ l de CD14 microbeads por 107 PBMCs. Mix bem e incube por 15 min a 4 ° C, sob agitação constante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão por 107 PBMC de classificação como uma etapa de lavagem e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 500 µ l de tampão por 108 PBMC de classificação.</li>
	<li>Coloca uma coluna no campo magnético do separador. Prepare a coluna, enxaguá-lo com 3 mL de tampão de classificação.</li>
	<li>Aplica a suspensão de células na coluna. A coluna depende do número de células a ser isolado (aqui, são usadas colunas LS para até 109 PBMCs). Colete o escoamento contendo células sem rótulo. Nota: Começando com esta etapa, todos os tubos (seleções de negativos e positivos) são mantidos para depois verificar as diferentes etapas por citometria de fluxo.</li>
	<li>Lave a coluna com 3 x 3 mL de tampão de classificação. Recolha pilhas sem rótulo, passando através do mesmo tubo da etapa 3.12. Executar etapas de lavagem por adição de buffer classificação, tenha cuidado para não secar a sua coluna. Coloque um tubo de coleta sob a coluna e removê-lo do separador.</li>
	<li>Pipete 5 mL de tampão de classificação para a coluna. Imediatamente lave as pilhas magneticamente etiquetadas empurrando firmemente o êmbolo na coluna. Para aumentar a pureza do CD14+ células, a fração eluted é enriquecida sobre uma segunda coluna.</li>
	<li>Repita as etapas de 3.4 a 3.7 com uma nova coluna.</li>
</ol>4. chapeamento de monócitos
<ol><li>Conte os monócitos em uma câmara de Malassez. Verificar a pureza do CD14+ células por citometria de fluxo. Retirar a quantidade de monócitos necessários para o experimento e colocá-los em um tubo de centrifugação.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspire o sobrenadante e ressuspender o monócito em meio de macrófagos. As células da placa e deixá-los a resolver para 50 min a 1 h. Aspire o meio e substituí-lo com média de macrófagos + 10% SAB + 25 ng/mL macrófago colônia estimulante fator (M-CSF) para induzir a diferenciação.</li>
</ol>5. polarização de macrófagos no dia 6
<ol><li>Aspire o meio. Substituí-lo por meio do macrófago + 10% SAB com vários estímulos. Por exemplo, adicione 10 ng/mL interferon gama (INFγ) + 1 lipopolissacarídeo ng/mL (LPS) para obter a polarização de M1, ou 20 ng/mL interleucina 4 (IL4) + 20 ng/mL interleucina 13 (IL13) para a polarização de M2. Nota: A estimulação pode ser realizada entre 24 e 48 h antes de prosseguir para outros testes.</li>
	<li>Colheita de células usando uma solução de desmontar ou um raspador de célula.</li>
</ol>6. célula de cultura sob condições de baixo oxigênio
<ol><li>A partir do passo 4, manter a monócitos e macrófagos em um ambiente controlado por oxigênio para realizar análise de condição hipóxica. Use uma estação de trabalho de hipóxia para manter as células sob a pressão parcial de oxigênio desejado durante o experimento. Nota: Quando se trabalha sob pressão de oxigênio baixa, é importante preparar todas as mídias e buffers de lavar debaixo da estação e esperar suficientemente para obter a correta pressão parcial no líquido. Por exemplo, 10 mL de PBS em uma placa de Petri de 60mm requer aproximadamente 2h para chegar a 25 mmHg para O pressão parcial de2 a partir de pressões atmosféricas (como medimos usando um sensor de oxigênio de fibra óptica). Em muitas estações de hipoxia ou incubadoras, a pressão de oxigênio é definida como uma percentagem da pressão atmosférica. Se medidas precisas são necessárias, é melhor usar uma estação autorizando para definir diretamente a pressão de oxigênio em mmHg.</li>
</ol>7. Lise e digestão em-Gel (protocolo 1)
Nota: Nesta e as seções a seguir, são descritos dois protocolos usados para obter peptídeos e executar análise de LC-MS/MS. Protocolo n º 1 descreve lysis da pilha e fracionamento em gel e digestão e protocolo 2 descreve a lise celular em solução seguida em solução de digestão e fracionamento usando um método de focagem isoeléctrico.
<ol><li>Execute o lysis da pilha no buffer Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% de glicerol, 33,3% (v/v) β-Mercaptoetanol, azul de bromofenol 0,2% w/v]. Carrega o equivalente de proteína de 300.000 células para cada amostra em géis de acrilamida bis-Tris 4-12%.</li>
	<li>Controle a duração da migração eletroforética para permitir que cada amostra de proteína a ser dividido em gel de 6 bandas, como exemplificado na Figura 3.</li>
	<li>Corrigir o gel com uma solução de fixação (30% etanol + 7,5% de ácido acético por 20 min) e, em seguida, adicionar a solução de coloração (R-250 Coomassie azul por 45 min.). Adicionar a solução de descoloração (30% etanol + 7,5% ácido acético até bandas aparecem) antes de excisão das bandas de proteínas com um bisturi limpo.</li>
	<li>Corte cada banda extirpada antes da sua introdução em tubos de 500 µ l. Uma superfície de vidro limpo é garantida para evitar a contaminação com queratina (5% solução de SDS em água deionizada pode ser usada para limpar superfícies).</li>
	<li>Lave as fatias do gel 3 vezes em 200 µ l de 25mm bicarbonato de amônio por 20 min a 37 ° C, seguido de uma lavagem em 25mm bicarbonato de amônio e acetonitrila (50% v/v). Desidrata-se os pedaços de gel com 200 µ l de acetonitrilo 100% por 10 min.</li>
	<li>Incube cada pedaço de gel com 10 mM DTT (ditiotreitol) em 25mm bicarbonato de amônio por 45 min a 56 ° C (200 µ l), seguido por iodoacetamide 55mm em 25mm bicarbonato de amônio (200 µ l) por 35 min no escuro no RT</li>
	<li>Para parar a alquilação, incubar cada pedaço de gel com 200 µ l de 10mm TDT em 25mm bicarbonato de amónio para 10 min a RT. Wash os pedaços de gel em 200 µ l de 25mm bicarbonato de amônio e desidratam com 200 µ l de acetonitrilo 100% por 10 min.</li>
	<li>Digeri as proteínas durante a noite a 37 ° C, com mistura de tripsina/Lys-C de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Extrair os peptídeos resultantes de pedaços de gel, adicionando 50 μL de acetonitrilo 50% por 15 min e, em seguida, 50 μL de 5% de ácido fórmico por 15 min e finalmente, 50 μL de acetonitrilo 100% por 15 min. piscina e secar cada fração em tubos de baixa absorção para limitar a adsorção de peptídeos e perda de amostra. Armazene as amostras a-80 ° C até posterior análise.</li>
</ol>8. proteína extração e na solução de digestão (protocolo 2)
<ol><li>Realize a lise celular (2 x 106 células) com 150 µ l da lise seguintes:<ol>
<li>Ureia de 7 M, 2m tioureia, 40 mM Tris e 4% CHAPS, completadas com inibidores de protease (mini completo, livre de EDTA inibidor da protease cocktail).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneizar as soluções durante 30 min à RT com um thermoshaker. Centrifugar a 13.800 x g por 20 min RT e manter o sobrenadante.</li>
	<li>Remova contaminantes com um kit de limpeza 2D:<ol>
<li>O kit contém solução precipitant, solução dessensibilizador co, tampão de lavagem e lavagem de aditivo.</li>
		<li>Adicione 300 µ l de solução precipitant e misture bem. Incube no gelo por 15 min. Adicionar 300 µ l de solução dessensibilizador co. Centrifuga os tubos (pelo menos) a 12.000 x g por 5 min. Um pequeno sedimento deve ser visível. Avançar rapidamente para a próxima etapa para evitar ressuspensão ou dispersão da pelota. Remova o sobrenadante sem perturbar o sedimento.</li>
		<li>Centrifuga os tubos novamente com o cap-dobradiça e pelota virada para fora para trazer qualquer líquido restante para o fundo do tubo. Um breve pulso é suficiente. Não deve haver nenhuma visível restante líquido nos tubos.</li>
		<li>Sem perturbar o sedimento, adicione 40 µ l de solução dessensibilizador co. Sente-se no gelo por 5 min. centrifugar por 5 min, em seguida, remova e descarte a lavagem, deixe o tubo. Adicione 25 µ l de água deionizada. Tubo de vórtice cada durante 5-10 s. A pelota deve dispersar, mas não se dissolvem na água.</li>
		<li>Adicione 1 mL de tampão de lavagem (pre-refrigerado pelo menos 1 h a-20 ° C) e 5 µ l de aditivo de lavagem. Vórtice até a pelota é totalmente disperso. Incubar os tubos a-20 ° C durante pelo menos 30 min. Vortex para 20-30 s cada 10min Nota: Os tubos podem ser armazenados a-20 º C por até 1 semana com degradação proteica mínima ou modificação.</li>
		<li>Centrifuga os tubos (pelo menos) a 12.000 × g por 5 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante. Um sedimento branco deve ser visível. Permita a pelota para muito por não mais que 5 min (se a pelota é muito seca, vai ser difícil Ressuspender).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda o pellet de proteína em 300 µ l de bicarbonato de Amônio ureia e 0,1 M 8 M. Vórtice fortemente por 1 min. Determine a concentração de proteína usando um ensaio colorimétrico.</li>
</ol>9. em solução de digestão (protocolo 2)
<ol><li>Reduzir as pontes dissulfeto adicionando 5,1 µ l de uma solução aquosa de 700 mM DTT (concentração final 12,5 mM) para as proteínas ressuspensa de passo 8.4 e incubar a 37 ° C por 30 min com um thermoshaker. Alkylate resíduos de cisteína, adicionando 20,3 µ l de uma solução aquosa de iodoacetamide de 700 mM (concentração final 40 mM) e incubados a 25° C por 30 min no escuro com uma thermoshaker.</li>
	<li>Adicione 990 µ l de bicarbonato de amônio 0,1 M para a amostra. Adicione um volume correspondente de tripsina/Lys-C mix (substrato: relação 1: 100 w/w). Incube a 37° C durante a noite com um thermoshaker.</li>
</ol>10. limpar cartucho (protocolo 2)
<ol><li>Molhe um cartucho com 1 coluna do volume (1 mL) de metanol. Limpe o cartucho com 1 coluna do volume (1 mL) de água de acetonitrilo/HPLC-grau de 80% e descartar o escoamento. Equilibrar o cartucho com 4 coluna-volumes (4 mL) de água de 0,1% de ácido fórmico/HPLC-grau e descartar o escoamento.</li>
	<li>Acidificar com amostras com 90 µ l de água de pH 2-3 (verifique o pH com um indicador de pH) ou 10% de ácido fórmico. Carregar as amostras acidificadas e coletar o escoamento. Recarrega o escoamento (contendo os peptídeos não-retida). Lave o cartucho com coluna-volume 6 (6 mL) de água de ácido fórmico/HPLC-nível de 0,1%.</li>
	<li>Eluir peptides do cartucho com 1 coluna-volumes (1 mL) de água de acetonitrilo/HPLC-grau fórmico acid/50% 0,1%. Transfira para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Concentre a amostra utilizando um concentrador de vácuo (150 x g, vácuo a 160 mBar).</li>
</ol>11. fracionamento por isoeléctrica (protocolo 2)
Nota: Peptídeos são separados de acordo com seus pontos isoeléctrico usando um fracionador de fora-gel em uma faixa de 13 cm, cobrindo uma faixa de pH de 3 a 10. Usamos o seguinte protocolo fornecido pelo fornecedor (resumido a seguir):
<ol><li>Preparar as seguintes soluções: solução um (600 µ l de solução de glicerol, 60 µ l de tampão OFFGEL, 4,34 mL de água ultrapura) e solução B (1,776 mL da solução A) e 444 µ l de água ultrapura.</li>
	<li>Monte as tiras IPG, quadros e eletrodos de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Resuspenda a amostra com 1,8 mL de solução B. Adicione 40 µ l da solução B em cada poço. Carrega 150 µ l de amostra em cada poço.</li>
	<li>Selecione o método padrão para peptídeos: OG12PE00 (método de padrão OFFGEL de peptídeos para uso com um Kit de Res de baixa de OFFGEL 3100, frames de 12-poços de 3-10, pH. Espere até que esse método tenha sido concluído (~ 20 h). Recolha as frações em tubos corretamente etiquetados.</li>
</ol>12. limpar Harvard aparelho coluna reversa C18 Post-IEF (protocolo 2)
<ol><li>Progressivamente, adicionar alguns μL em vez de 1% TFA em água deionizada a cada fração para acidificar a amostra. Seleção usando papel de pH o pH é de cerca de 3 ou abaixo.</li>
	<li>Preparar as seguintes soluções: solução 1 (5 mL de acetonitrilo, 10 µ l de ácido fórmico, 4,99 mL de água ultrapura) e a solução 2 (0,5 mL de acetonitrilo, 10 µ l de ácido fórmico, 9,49 mL de água ultrapura).</li>
	<li>Pre-molhado a coluna de rotação com 150 µ l de solução 1. Centrífuga para 90 s em 750 x g e descarte o escoamento. Lave a coluna de rotação com 150 µ l de solução 2. Centrífuga para 90 s em 750 x g e descarte o escoamento.</li>
	<li>Passe a fração através da coluna. Centrífuga para 90 s em 750 x g e descarte o escoamento. Lavar com 150 µ l de solução 2. Centrífuga para 90 s em 750 x g e descarte o escoamento.</li>
	<li>Eluir a fração com 50 μL de solução 1. Centrífuga para 90 s em 750 g de x. Repita estes passos mais uma vez.</li>
	<li>Seco-fração usando um concentrador de vácuo (150 x g, vácuo 160 mBar) e armazenar a-80 ° C</li>
</ol>13. análise de dados Proteomic e bioinformática18
<ol><li>Analisar os dados obtidos por um nano-LC-MS/MS massa espectrômetro usando software de quantificação, como MaxQuant (versão 1.5.2.8) e o motor de busca de Andrômeda.</li>
	<li>Definir taxa falsa da descoberta (FDR) a 1% para proteínas e peptídeos e um comprimento mínimo de 7 aminoácidos. Definir a especificidade da enzima como C-terminal para Arg e Lys. Permitir que 2 decotes perdidas em títulos de prolina. Selecione carbamidomethylation de cisteína como uma modificação fixa e N-terminal da proteína acetilação e metionina oxidação como variáveis modificações.</li>
	<li>Além disso, analise os dados com o software de análise estatística. Realizar uma análise de enriquecimento funcional usando o software FunRich (www.funrich.org/). Realizar uma análise de enriquecimento de ontologia do gene utilizando software de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Porque proteomics é uma poderosa ferramenta para estudar a expressão de diferentes proteínas de uma célula inteira ou compartimentos subcelulares, otimização do protocolo de lise celular e digestão de proteínas tem sido abordadas por um número de estudos. Existem três classes principais de métodos, que incluem em-gel digestão (digestão de proteínas em gel de poliacrilamida matriz)17, digestão em solução18 e de preparação de amostra auxiliado por filtro19</...

Os macrófagos são células do sistema imune inatas envolvido com uma série de funções fisiológicas, variando das respostas de patógenos infecciosos a homeostase do tecido, incluindo a remoção de pilhas apoptotic e remodelação da matriz extracelular1. Estas células são caracterizadas por uma forte plasticidade fenotípica2 , que se traduz em um muitos Estados possíveis de ativação, que também são chamados de polarizações. A descrição molecular precisa destas várias polarizações é uma prioridade no campo do macrófago biologia3. Foi proposto para classificar estas polarizações usando a chamados dicotomia M1/M2, em que M1 representa pro-inflamatórios e M2 representa macrófagos anti-inflamatórios. Este modelo se encaixa bem em diversas situações patológicas, como infecções agudas, alergia e obesidade4. No entanto, em tecidos cronicamente inflamados e câncer, foi demonstrado que esta classificação é incapaz de compreender o amplo repertório fenotípico que macrófagos presentes em certos ambientes celulares5,6, 7. o consenso atual é que polarização macrófago é melhor descrita usando um modelo multidimensional para integrar sinais específicos microenvironmental8. Esta conclusão foi confirmada através da análise de transcriptomic de macrófagos humanos, mostrando que o modelo M1/M2 é ineficiente em descrever as polarizações obtidos9.
O estudo apresentado tem como objetivo proporcionar um protocolo para obter assinaturas de proteomic de várias polarizações em macrófagos humanos. Descrevemos como diferenciar os macrófagos humanos em ambientes de vários níveis de oxigênio e obter peptídeos o proteome macrófago toda para realizar uma rótulo livre de quantificação. Esta quantificação permite a comparação dos níveis de expressão de várias proteínas. Como pesquisas sobre células-tronco tem revelado a importância de oxigênio como um parâmetro chave ambiental10, procuramos entender como esse parâmetro de tecido pode influenciar a polarização do macrófago em seres humanos. A pressão parcial de oxigênio foi encontrada para o intervalo de 3 a 20% (de pressão atmosférica total) no corpo humano, onde 20% corresponde mais ou menos o que é comumente usado em uma incubadora de cultura celular (o valor exato é de cerca de 18,6%, tendo a presença de água em conta).
Trabalhos anteriores tem mostrado que alveolar diferem dos macrófagos intersticiais de funcionais e morfológico ponto de vistas11 e que essas diferenças são provavelmente parcialmente devido aos níveis de oxigênio diferentes a que estão expostos12. Além disso, os macrófagos da medula óssea-derivado mostram uma habilidade aumentada para phagocytize bactérias quando expostos a um ambiente de oxigênio baixo12. O efeito oposto foi encontrado por macrófagos humanos diferenciadas THP113, mas estes resultados suportam a ideia de que o oxigênio é um regulador da biologia do macrófago e que é necessário clarificar este papel a nível molecular em macrófagos humanos. Em um estudo anterior, nós aplicamos uma abordagem proteômica para solucionar esses problemas. Medindo os níveis de expressão de milhares de proteínas simultaneamente, nós destacou o impacto do oxigênio na polarização e forneceu uma lista de novos marcadores moleculares. Também fomos capazes de relacionar esses achados para algumas funções de macrófagos. Em particular, nós encontramos que a taxa de fagocitose das células apoptóticas foi aumentada em macrófagos IL4/IL13-polarizada, que estava relacionado com o upregulation de ALOX15, como revelado pela análise proteômica14. No presente estudo, descrevemos como executar tal análise.

<table><tbody><tr><td>Estação de trabalho de hipóxia</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico (FA)</td> <td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie blue</td><td>Biorad</td><td>1.610.436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo, E.Coli (LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>kit de limpeza 2D</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 médio, suplemento glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (NEAA) 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>coluna de aparelhos Harvard Reverse C18 micro coluna de rotação</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>coluna de separação MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gama (INF & gama;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (clone T&Uuml; K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de Tubo MACSmix</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Trifluoroacético (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Tripsina/Lys-C</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Mini Completo, Inibidor de Protease sem EDTA coquetel</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Gradiente de Densidade ( Histopaque 1077)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro Humano do plasma AB masculino humano (SAB)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro bovino (BSA) 30%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 20%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Tioureia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio Micro BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico estéril de 5 mL</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 cartuchos de fase reversa, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Os macrófagos são células do sistema imune inatas envolvido com uma série de funções fisiológicas, variando das respostas de patógenos infecciosos a homeostase do tecido. As várias funções dessas células estão relacionadas aos seus Estados de ativação, que é também chamado de polarização. A descrição molecular precisa destas várias polarizações é uma prioridade no campo da biologia do macrófago. Atualmente é reconhecido que uma abordagem multidimensional é necessária para descrever como a polarização é controlada por sinais ambientais. Neste relatório, descrevemos um protocolo projetado para obter a assinatura de proteomic de várias polarizações em macrófagos humanos. Este protocolo é baseado em uma rótulo livre quantificação da expressão da proteína de macrófago obtido de fracionada em gel e conteúdo de lise celular Lys C/tripsina-digerido. Nós também fornecemos um protocolo baseado na solução de digestão e isoeléctrico focando fracionamento para usar como uma alternativa. Porque a concentração de oxigênio é um parâmetro ambiental relevante nos tecidos, usamos este protocolo para explorar a composição atmosférica como ou um ambiente de baixo oxigênio afeta a classificação de polarização de macrófagos.

A partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) obtidas através da centrifugação diferencial, o protocolo permite a obtenção de uma população de CD14+ monócitos com uma pureza avaliou mais de 98% por citometria de fluxo (Figura 1). Estes monócitos secundariamente são diferenciados em direção a várias polarizações (Figura 2). Quando um fracionamento em gel é escolhido, a migração em geles de SDS-page é ada...

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Assim, esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do macrófago, como como caracterizar o estado de ativação em vários ambientes no nível da proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela proporciona a oportunidade de obter uma expressão diferente de muitas proteínas em macrófagos humanos usando o método de quantificação sem rótulos. Demonstrando o procedimento serão Marie Malier e Magali Court do meu laboratório.Para começar, adicione 15 mililitros de solução de separação celular gradiente de densidade em cada um dos dois tubos de centrifugação de 50 mililitros para que a solução possa aquecer à temperatura ambiente antes de receber o LRSC. Isso é essencial, pois a densidade depende da temperatura. Esvazie o LRSC em um tubo de centrifugação de 50 mililitros.Adicione 1x PBS até 50 mililitros e misture. Em seguida, muito lentamente, adicione 25 mililitros da mistura em cima de 15 mililitros de solução de gradiente de densidade equilibrada. Tenha cuidado para não misturar as fases durante esta etapa.O sangue deve ser adicionado na solução gradiente de densidade sem qualquer perturbação desta fase. Centrifugar ambos os tubos de centrifugação por 25 minutos a 700 G sem quebras. No final da centrifugação gradiente de densidade, as camadas de baixo para cima são os eritrócitos e granulócitos, formando a pelota, a fase de solução de gradiente de densidade, uma camada de PBMCs e o plasma diluído.Com uma pipeta, passe pela fase plasmática sem aspirar. Em seguida, colete a camada PBMC em um novo tubo de centrífugação de 50 mililitros. Adicione até 50 mililitros de 1x PBS aos PBMCs como uma configuração de lavagem e centrífuga por 10 minutos a 300 G.Aspire o supernasce e suspenda a pelota em 40 mililitros de meio macrófago.Depois de colocar os PBMCs em uma câmara de Malassez, transfira a quantidade de PBMCs necessários para conduzir o experimento para um tubo de centrifugação. Centrifugar as células por 10 minutos a 300 G.Aspire o supernascer e suspenda a pelota em 80 microliters do buffer de classificação por 10 milhões de PBMCs. Em seguida, adicione 20 microliters de microesferas CD14 por 10 milhões de PBMCs.Misture bem e incubar por 15 minutos a 4 graus Celsius sob agitação constante. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão de classificação por 10 milhões de PBMCs como etapa de lavagem e centrífuga como antes. Em seguida, aspire o supernascer e suspenda novamente a pelota em 500 microliters de tampão de classificação por 100 milhões de PBMCs.Agora, coloque uma coluna no campo magnético do separador. Prepare a coluna enxaguando-a com três mililitros de tampão de classificação. Aplique a suspensão do celular na coluna.Em seguida, colete o fluxo através de células não rotuladas para posterior coloração, se necessário. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de classificação. Tenha cuidado para não secar sua coluna.Em seguida, coloque um tubo de coleta sob a coluna e remova-o do separador. Após a lavagem, pipeta cinco mililitros de tampão de classificação na coluna. Imediatamente limpe as células magneticamente rotuladas empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.Por fim, repita esses passos com uma nova coluna antes de emplacar os monócitos e realizar a polarização do macrófago, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha os monócitos e os macrófagos em um ambiente controlado pelo oxigênio para realizar a análise de condições hipoxicas. Use uma estação de trabalho de hipóxia para manter as células sob a pressão parcial de oxigênio desejada durante o experimento.Ao trabalhar sob baixa pressão de oxigênio, é importante preparar todas as mídias e tampões de lavagem sob a estação, e esperar o suficiente para obter a pressão parcial correta no líquido. Realize a lise celular em um tampão sob um capô adaptado. Carregue o equivalente a proteína de 300.000 células para cada amostra em géis de acrilamida de 4-12%bis-tris.Controle a duração da migração eletroforética para permitir que cada amostra de proteína se divida em seis bandas de gel, como mostrado aqui. Após fixação e coloração conforme descrito no protocolo de texto, extirpar as bandas de proteína com um bisturi limpo. Pique cada banda excisada antes de colocá-los em tubos de 500 microliter.Agora, lave as fatias de gel três vezes em 200 microlitadores de 25 mililitros de amônio bicarbonato por 20 minutos a 37 graus Celsius, descartando o bicarbonato de amônio entre cada passo. Siga-o com uma lavagem em 25 milimônios de bicarbonato de amônio e acetonitrilo. Em seguida, desidratar as peças de gel com 200 microliters de 100% acetonitrilo por 10 minutos.Incubar cada peça de gel com 10 mililitros DTT e 25 milimônios bicarbonato de amônio por 45 minutos a 56 graus Celsius. Em seguida, descarte o DTT e incubar a peça de gel com iodoacetamida de 55 milimônios em 25 milimônios bicarbonato de amônio por 35 minutos no escuro à temperatura ambiente. Para parar a alquilação, descarte a solução usada e incuba cada peça de gel com 200 microlitres de 10 mililitros DTT em 25 mililitros de amônio bicarbonato por 10 minutos à temperatura ambiente.Lave as peças de gel em 200 microliters de 25 milimônios bicarbonato de amônio. Em seguida, desidratar com 200 microliters de 100% acetonitrilo por 10 minutos. Digerir as proteínas durante a noite a 37 graus Celsius com Trypsin/Lys-C Mix de acordo com as instruções do fabricante.Extrair os peptídeos resultantes de peças de gel adicionando 50 microlitadores de 50% de acetonitrilo por 15 minutos em tubos de baixa absorção. Depois de adicionar 50 microliters de ácido fórmico de 5% por 15 minutos, adicione 50 microliters de 100% acetonitrilo por 15 minutos. Puxe e seque cada fração em tubos de baixa absorção para limitar a absorção de peptídeos e perda de amostra.Armazene as amostras a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada conforme detalhado no protocolo de texto. Mostrada aqui é a pureza representativa avaliada pela citometria de fluxo após a seleção de contas magnéticas de monócitos positivos CD14. Imagens de contraste de fase de macrófagos humanos diferenciados mostram heterogeneidade de morfologias obtidas para duas polarizações diferentes após nove dias de cultura.Um exemplo de digestão off-gel usando géis de página SDS manchados de prata é mostrado. A avaliação da proteína a partir da lise celular e após a digestão em solução mostra a ausência de degradação durante a lise e a eficiência da digestão. Mostrado aqui é um exemplo de um espectro de dissociação induzido por colisão de um peptídeo encontrado na relação massa-carga de 597,29 no espectro MS com uma carga elétrica de dois positivos.A partir deste espectro, a sequência correspondente foi determinada. O resultado final após a análise é um mapa de calor representando o agrupamento hierárquico de todos os estados de polarização usando proteínas expressas diferencialmente. A análise revela um conjunto de proteínas super-expressas em todas as polarizações na condição de oxigênio de 3%.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que você tem que decidir primeiro que tipo de fracionamento você realizará em novas amostras para adaptar seu protocolo de acordo. A abordagem proteômica que utiliza este trabalho é complementar às abordagens genômicas que têm sido utilizadas nos últimos anos no campo dos estudos de polarização da biologia macrófago. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que o pesquisador no campo da imunologia explore os diversos estados de ativação de células imunes em humanos e também em outros mamíferos.Não se esqueça que trabalhar com DTT pode ser perigoso, então você precisa trabalhar sob um capô adaptado para fazer este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Os macrófagos são as células-chave envolvidas na patogenicidade do hospedeiro. Os macrófagos apresentam diversidade fenotípica e funcional que pode ser analisada e detectada por análise proteômica. Este artigo descreve como realizar eletroforese 2D de culturas primárias de macrófagos humanos diferenciados em fenótipo M1 ou M2.

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

A reprogramação metabólica é uma característica e pré-requisito para a polarização de macrófagos M1 e M2. Este manuscrito descreve um ensaio para a medição de parâmetros fundamentais de glicólise e função mitocondrial em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos. Esta ferramenta pode ser aplicada para investigar como fatores específicos afetam o metabolismo e o fenótipo do macrófago.

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Este protocolo fornece um método para estudar a infecção por Mycobacterium tuberculosis em macrófagos m1 ou M2 polarizados humanos baseados na diferenciação de monócitos periféricos-sanguíneos para células semelhantes a macrófagos que são infectados com a cepa virulenta H37Rv, e analisado com citometria de fluxo usando um painel de 10 cores, incluindo a expressão de marcadores M1/M2 selecionados.

Polarização de Células e Análises Derivadas de Monócitos Humanos M1 e M2 com Citometria de Fluxo sobre Infecção por Mycobacterium tuberculosis

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar o potencial imunomodulador das superfícies de implantes in vitro, visando melhorar a confiabilidade e reprodutibilidade dos protocolos atuais e promover novas pesquisas. Perfis de citocinas secretoras, expressão de mRNA e marcadores de superfície celular foram monitorados usando macrófagos derivados de monócitos sanguíneos para investigar a polarização de macrófagos cultivados em titânio.

Polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos M1 e M2 em superfícies de implantes 

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Aprenda análise proteômica de macrófagos humanos em ambientes com baixo oxigênio usando quantificação sem rótulo. Este método permite caracterizar estados de ativação celular e padrões de expressão proteica em condições hipóxicas.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

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