Níveis de Giberelina celular visualização usando a energia de ressonância de Förster NlsGPS1 transferir Biosensor (FRET)

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de desenvolvimento da planta sobre a distribuição de fitohormones regulatórios de crescimento. Usando biosensores FRET geneticamente codificados, por exemplo, nlsGPS1 que detecta gibberellins, é possível medir a distribuição dinâmica de compostos importantes em tecidos arabidopsis na solução celular. Geralmente, indivíduos novos nessa matéria lutarão, porque analisar biosensores FRET envolve imagem racionmétrica que aumentou o ruído e etapas analíticas adicionais em comparação com a imagem métrica de intenção.

Comece semeando aproximadamente 20 sementes de Arabidopsis esterilizadas em placas quadradas de 1/2 Murashige e Skoog ou MS. Sele as placas com fita cirúrgica de poros e enrole-as com papel alumínio por um a três dias de incubação a quatro graus Celsius para estratificação. Para imagens radiculares, transfira as placas para uma câmara de crescimento em uma orientação vertical por três dias sob as condições indicadas.

Para hipocotyl de crescimento escuro, transfira as placas para a câmara de crescimento para um pulso de luz de uma a quatro horas para sincronizar a germinação. Em seguida, enrole as placas com papel alumínio e coloque-as na câmara de crescimento em uma orientação vertical por três dias. Para medições de estado constantes, adicione 50 microlitros de solução simulada a um slide de microscópio limpo e coloque suavemente três sensores de percepção de gibberellin localizados nucleares um ou nlsGPS1 expressando mudas no slide.

Em seguida, localque uma gota de uma graxa de vácuo em cada canto de um deslizamento de cobertura limpa e coloque suavemente para cobrir o deslizamento sobre as mudas. Adicione cuidadosamente uma solução simulada extra para remover quaisquer bolhas de ar conforme necessário. Antes do tratamento de gibberellin quatro ou GA4, use uma seringa de 20 mililitros cheia de graxa a vácuo e equipada com uma ponta de pipeta modificada de 200 microliter com uma abertura de um milímetro de diâmetro para desenhar uma camada uniforme de três centímetros e meio de comprimento por dois centímetros e meio de largura em um slide de vidro limpo.

Adicione 50 microliters de solução simulada ao centro do retângulo e use fórceps limpos para levantar as mudas de nisGPS1 expressando na parte inferior de seus cotilledons para transferência cuidadosa para a solução simulada. Coloque um deslizamento de tampa manchado com graxa de vácuo como apenas demonstrado no centro do retângulo de graxa de vácuo e encha cuidadosamente o reservatório com uma solução simulada extra sem perturbar as mudas. Em seguida, adquira imagens das mudas em um microscópio confocal equipado com lasers apropriados para cfp emocionante e YFP para realizar imagens de transferência de energia de ressonância forster.

Para o tratamento do GA4, remova o slide do estágio do microscópio e configure um temporizador por 20 minutos. Remova imediatamente a solução simulada do lado direito do deslizamento de cobertura, adicionando 17 microliters de um líquido MS de um quarto de MS complementados com um micro molar GA4 para o lado esquerdo do deslizamento de tampa até que toda a solução simulada tenha sido substituída. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro de volta para o estágio do microscópio e espere mais 10 minutos antes de adquirir a imagem de tratamento GA4 após.

Para configurar um curso de tempo para um tecido de interesse, adicione 200 microliters de solução simulada ao centro do canal de perfusão de um slide pegajoso ibidi, e coloque suavemente as mudas nlsGPS1 na solução simulada como demonstrado. Use fórceps para colocar suavemente um deslizamento de cobertura sobre as mudas usando a parte traseira dos fórceps para pressionar suavemente nas bordas externas do deslizamento da tampa até formar uma ligação forte com o material pegajoso na periferia do escorregador pegajoso. Em seguida, use dois conectores Luer de cotovelo de 0,8 milímetros de diâmetro interno e uma peça de tubo de silicone de 0,8 milímetros de diâmetro interno para conectar o escorregador pegajoso a uma seringa de 20 milímetros cheia de solução simulada e conectar o slide a um recipiente de saída para coletar a solução de saída.

Deprimir suavemente o êmbolo para dispensar solução suficiente para a câmara para garantir que não haja bolhas de ar e, em seguida, carregue a seringa em uma bomba de seringa programável. Em seguida, inicie a bomba para iniciar o curso de tempo. Para tratamentos GA4 durante o curso de tempo, pausar a bomba para parar a perfusão e substituir o tampão simulado contendo seringa por uma seringa cheia de um quarto de ms líquido suplementado com GA4.

Para análise de imagens 3D, importe os arquivos para o programa de software de análise de imagens IMARIS e abra o assistente de superfícies. Defina a subtração de fundo para três mícrons e o limiar seja padrão. Durante a segmentação dos núcleos tome cuidado para não incluir os muitos núcleos com fluorescência fraca, pois a ração sinal-ruído do objeto com níveis próximos de fundo de sinal será muito baixa para análise de imagem ratiométrica.

Em seguida, mascarar os canais de emissão CFP e FRET com base nas superfícies criadas usando a emissão de YFP. Use a extensão da razão de intensidade média XT para calcular uma proporção de emissão aceitadora de excitação de doadores dividida pela emissão de doadores entre os valores médios de intensidade das superfícies individuais nos dois canais. Para colorir as superfícies individuais com a razão de emissão nlsGPS1, selecione a codificação de cores com estatísticas e defina a razão de intensidade média como o tipo de estatística.

De acordo com o ícone estatístico, exporte as proporções de valores individuais da tabela e copie e cole os valores em uma planilha para representação gráfica dos dados. Na raiz arabidopsis, o gradiente da razão de emissão nlsGPS1 é indicativo de baixos níveis de GA4 nas zonas meristemáticas e de divisão e altos níveis de GA na zona de alongamento tardio. Em contraste, um gradiente de razão de emissão não é observado em raízes não-respostas nlsGPS1, sugerindo que o gradiente elógeno GA4 não é um artefato.

Um gradiente de razão de emissão nlsGPS1 também é formado em hipocotyls de crescidos escuros com baixos níveis nos cotilledons e no gancho típico e altos níveis na região basal rapidamente alongada do hipocotílo. Em contraste, um gradiente de razão de emissão não é observado nos hipocotilos não respondidos do NLSGPS1. Além disso, o GA4 fornecido exogenously acumula-se preferencialmente na zona de alongamento em comparação com a zona de divisão da raiz arabidopsis indicando que o NLSGPS1 pode ser usado para estudar a padronização de GA endógeno e exógeno.

Além disso, a análise do curso de tempo das mudas DOZ4 tratadas com NLSGPS1, revela um acúmulo mais rápido de GA4 exógeno na alongamento raiz, em comparação com a zona de divisão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar pixels saturados durante a imagem quantitativa para manter os parâmetros de imagem constantes e minimizar os problemas de deriva e mudança focal durante a perfusão da amostra. Seguindo este procedimento, métodos elaborados, como raízes de imagem crescendo em dispositivos de profusão de controle do tipo de chip raiz podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como os gradientes de GA mudam nas pontas raiz arabidopsis crescendo a diferentes taxas ou em resposta ao estresse Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo do crescimento vegetal para explorar a distribuição dinâmica dos gibberellins em tecidos e órgãos arabidopsis adicionais.