Proteína quinase C-delta inibidor do Peptide formulação utilizando nanopartículas de ouro
9 de março de 2019
Anteriormente nós usamos um híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro para entregar por via intravenosa um peptídeo sintético, inibidor da proteína quinase C-delta, que reduziu a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão. Aqui nós mostramos o protocolo detalhado da formulação da droga. Outros peptídeos intracelulares podem ser formulados da mesma forma.
Nosso sistema único de entrega de drogas, que usa partículas de ouro de 20 nanômetros em dois peptídeos curtos específicos, pode estabilizar nanopartículas de ouro em solução fisiológica e melhorar sua absorção celular, e assim, efetivamente fornecer peptídeos ou outras drogas em células. Nosso híbrido de peptídeo GNP é fácil de sintetizar e estável. Usando o híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro como portadores de drogas, podemos transferir drogas de peptídeos para as células de forma eficaz e em abundância.
Tratamos a lesão isquemia-reperfusão nos pulmões com nosso híbrido GNP/PKCi. O GNP traz peptídeos inibidores PKC para o citoplasma. Este método de entrega foi capaz de reduzir lesões pulmonares mais graves usando uma dose menor de PKCi do que outros métodos de entrega.
Para iniciar este procedimento, recupere os peptídeos de um congelador a menos 20 graus Celsius, e descongele-os à temperatura ambiente. Use uma micro escala para pesar 0,01 gramas de cada peptídeo descongelado e transfira cada peptídeo para um tubo cônico separado de 50 mililitros. Adicione 18,74 mililitros de água deionizada ao tubo P2 e 16,93 mililitros de água deionizada ao tubo P4.
Adicione 8,21 mililitros de 50% de acetonitrila diluídos em água deionizada ao tubo inibidor do delta PKC. Vórtice as soluções de peptídeos brevemente. Em seguida, coloque os tubos em um sonicator a 40 mega-hertz por cinco minutos.
Depois disso, transfira as soluções para um armário de biossegurança. É fundamental colocar o tubo cônico de 50 mL em um sonicator por cinco minutos. Se esta etapa for ignorada, o GNP/PKCi formará agregações.
Transfira um mililitro de cada solução de peptídeo para seu novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 19 mililitros de água deionizada aos tubos contendo P2 e P4. E adicione 19 mililitros de 50% de acetonitrila ao tubo contendo inibidor delta PKC. Adicione 475 mililitros da solução P2, 25 microliters da solução P4, 500 microliters da solução inibidora delta PKC a um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, adicione nove mililitros de uma solução GNP de 20 nanômetros ao mesmo tubo. Remova a solução combinada do armário de biossegurança e enrole o tubo em papel alumínio. Coloque o tubo em um agitador durante a noite.
No dia seguinte, devolva as amostras ao armário de biossegurança. Transfira uma alíquota mililitro da solução GNP/PKCi em micro tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os micro tubos a uma micro centrífuga a 15294 vezes g e a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Transfira os micro tubos de volta para o armário de biossegurança e remova o supernêgente de cada tubo, garantindo que a pelota GNP não seja perturbada. Resuspenda cada pelota no solvente desejado de acordo com a concentração necessária. Para avaliar a solubilidade híbrida GNP/PKCi, despeje 0,5 mililitros da solução GNP/PKCi em um cuvette de acréscimo.
Coloque o cuvette em um espectrômetro UV-Vis e teste o pico de absorção. Neste estudo, o inibidor de proteína quinase C-delta é conjugado com nanopartículas de ouro para formar um híbrido GNP/PKCi. Deve-se tomar cuidado com a avaliação das propriedades biofísicas do híbrido, pois as nanopartículas de ouro tendem a se agregar em um solvente.
Quando as nanopartículas se agregam, a cor da solução mudará de rosa para roxo. As amostras são analisadas com um espectrofotômetro UV-Vis que é capaz de detectar com alto grau de sensibilidade. Se o híbrido não for agregado, o pico de uma absorção deve ser de 525 nanômetros.
Se o PIB for agregado, o pico de absorção será deslocado para a direita. Como se pode ver, quando os agregados se formaram, a densidade óptica delta diminui. Ao formular os híbridos de peptídeos GNP, é importante lembrar que a proporção de peptídeos para a solução GNP deve ser de um a nove.
Esta fórmula GNP/PKCi pode ser usada para lesão de reperfusão de isquemia em sistemas de órgãos diferentes do pulmão. Qualquer peptídeo pode se ligar ao PIB se esses peptídeos tiverem um resíduo de cisteína no N-terminus. Isso significa que o híbrido de peptídeo GNP pode ser usado para transportar outras drogas de peptídeos para a célula.
Peptídeos criados racionalmente são uma nova tecnologia que pode trazer interação proteína-proteína específica dentro dessas células. Esta técnica, desenvolvida aqui, pode ser usada para a entrega de novos medicamentos peptídeos ou para versões modificadas de medicamentos existentes.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo sistema de liberação de fármacos que utiliza híbridos de nanopartículas de ouro e peptídeos para entregar inibidores da proteína quinase C-delta de forma eficaz, reduzindo lesões pulmonares agudas induzidas pela isquemia-reperfusão. O método aumenta a captação celular e a estabilidade dos peptídeos, permitindo um tratamento eficaz com doses menores.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Sistemas de liberação de fármacos
- Nanotecnologia
- Tratamento da lesão pulmonar aguda
Antecedentes
- As nanopartículas de ouro podem estabilizar peptídeos em soluções fisiológicas.
- Fármacos baseados em peptídeos frequentemente enfrentam desafios na entrega celular.
- A lesão por isquemia-reperfusão é uma causa significativa de dano pulmonar.
- Métodos eficazes de entrega de fármacos podem melhorar os resultados do tratamento.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema de liberação de fármacos estável e eficaz utilizando híbridos de nanopartículas de ouro e peptídeos.
- Demonstrar a eficácia desse sistema no tratamento de lesão pulmonar.
- Fornecer um protocolo detalhado para a síntese da formulação farmacêutica.
Métodos Utilizados
- Síntese de híbridos de nanopartículas de ouro e peptídeos.
- Administração intravenosa do híbrido para direcionamento às células pulmonares.
- Avaliação da captação celular e da estabilidade em condições fisiológicas.
- Avaliação da eficácia do tratamento em modelos de lesão por isquemia-reperfusão.
Resultados Principais
- O híbrido GNP/PKCi entregou eficazmente fármacos peptídicos nas células.
- Dosagens mais baixas de PKCi resultaram em lesão pulmonar reduzida em comparação com outros métodos.
- O sistema demonstrou alta estabilidade e facilidade de síntese.
- A captação celular aprimorada foi confirmada por meio de análise experimental.
Conclusões
- O híbrido de nanopartícula de ouro e peptídeo é um sistema de entrega de fármacos promissor.
- Este método pode melhorar significativamente o tratamento da lesão pulmonar aguda.
- Pesquisas futuras podem expandir sua aplicação a outros medicamentos baseados em peptídeos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Híbridos de nanopartículas de ouro (GNP) com peptídeos oferecem uma plataforma modular para a entrega intracelular de inibidores baseados em peptídeos, abordando desafios-chave relacionados à estabilidade e à captação celular. Esta tecnologia permite a entrega precisa de peptídeos projetados racionalmente, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos. Sua adaptabilidade a diferentes cargas peptídicas posiciona-a como uma capacidade reutilizável para pesquisas translacionais em toda a carteira de projetos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação funcional de alvos intracelulares utilizando inibidores peptídicos.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao garantir a entrega eficiente de moléculas candidatas ao citoplasma.
- Facilita a confiança preditiva no engajamento do alvo por meio de avaliações quantitativas da captação e da estabilidade.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece uma plataforma padronizada para a preparação de conjugados peptídeo-GNP com propriedades físico-químicas reproduzíveis.
- Permite a avaliação quantitativa da agregação de nanopartículas e da entrega de peptídeos utilizando espectrofotometria UV-Vis.
- Permite a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma para diferentes sequências peptídicas com resíduos de cisteína no terminal N.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Demonstra a entrega e eficácia in vivo em modelos de lesão orgânica, apoiando a continuidade translacional.
- Permite adaptação para outros sistemas orgânicos e terapêuticas baseadas em peptídeos, conforme suportado pela compatibilidade físico-química.
- Reduz o risco biológico ao permitir doses mais baixas e minimizar efeitos fora do alvo em comparação com vetores tradicionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa formulação híbrida de peptídeo com nanopartículas de ouro (GNP) integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, permitindo a entrega intracelular robusta e a caracterização quantitativa de terapêuticas peptídicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da entrega intracelular eficiente de peptídeos funcionais.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis da estabilidade de nanopartículas e da conjugação de peptídeos.
- Análises: Utiliza espectrofotometria UV-Vis para detecção sensível de agregação e eficiência de entrega.
- Pesquisa Translacional: Demonstra aplicabilidade in vivo e adaptabilidade a múltiplos sistemas orgânicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma de entrega generalizável para uma variedade de candidatos a fármacos baseados em peptídeos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos intracelulares e em estudos mecanicistas.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de entrega de peptídeos e melhora a reprodutibilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Permite decisões de avanço ou interrupção ajustadas ao risco, fornecendo entrega robusta e análises quantitativas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização de terapêuticos peptídicos com entrega aprimorada e risco reduzido de alvos fora do alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em síntese de nanopartículas e química de conjugação de peptídeos.
- Requer acesso a instrumentação analítica, como espectrofotômetros UV-Vis para avaliação de agregação.
- Exige padronização entre equipes das razões peptídeo-GNP e das condições de solvente.
- Adaptável a peptídeos com resíduos de cisteína em sua extremidade N-terminal, garantindo ampla aplicabilidade.
- O risco de agregação deve ser controlado mediante rigorosa adesão ao protocolo e monitoramento físico-químico.
