Name: Extração e análise de própolis verde de Taiwan (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprenda a extrair própolis verde de Taiwan usando etanol como solvente e caracterize sua atividade antibacteriana. Este protocolo confiável permite determinar a qualidade do produto natural de forma reprodutível.

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Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.

1. preparação de compostos extraídos de etanol
<ol><li>Pesar 10 g de própolis verde taiwanesa congelado, que foi recolhida de colmeias em Taiwan, de maio a julho, e triturá-lo usando o moedor de especiarias. Confirme que pedaços inteiros da própolis verde de Taiwan são moídas em um pó fino sem quaisquer partículas grandes.</li>
	<li>Adicione 100 mL de diferentes concentrações de etanol (60%, 70%, 80%, 95% e 99,5%) e água para separar os frascos e misturar cada concentração com 10 g de própolis de chão.</li>
	<li>Incubar a 25 ° C e agitar o frasco a 250 rpm por 48 h.</li>
	<li>Filtre os extratos de etanol por papel de filtro com um tamanho de poro de 25 μm.</li>
	<li>Reconstitua os filtrados para seu volume original (100 mL) com etanol a 95% usando um balão volumétrico.</li>
	<li>Armazenar os extratos de etanol a-20 ° C. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>2. preparação dos extratos de etanol para HPLC
<ol><li>Concentre-se 10 mL de etanol extractos por evaporação a vácuo a 40 ° C por 15 min.</li>
	<li>Asse a matéria seca a 45 ° C por 24 h.</li>
	<li>Reconstitua a matéria seca com 10 mL de etanol a 95%.</li>
	<li>Filtro de 1 mL de etanol extrai usando um filtro de seringa estéril com um tamanho de poro de 0,45 µm.</li>
	<li>Filtrar novamente os extratos de etanol usando um filtro de seringa estéril com um tamanho de poros de 0,22 µm. O filtrado é coletado e pode ser analisado diretamente usando HPLC.</li>
</ol>3. análise de conteúdo Propolin usando HPLC
<ol><li>
Estabelecimento de curvas padrão de propolins
	<ol>
<li>Prepare 1 L de fase móvel de solução de metanol: água 88.8:11.2 (v/v).</li>
		<li>Preparar diluições em série de propolin padrão concentrações (C, D, F e G) (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL e 125 mg/mL, respectivamente) usando a solução de fase móvel como solvente.</li>
		<li>Injete 20 µ l de propolin concentrações padrão na coluna de fase reversa, sequencialmente, resultantes da concentração baixa para a alta concentração.</li>
		<li>Defina a coluna HPLC a 30 ° C e a taxa de fluxo de 1 mL/min.</li>
		<li>Definir o comprimento de onda do detector UV para 280 nm e o tempo de gravador para 20 min.</li>
		<li>Analisar os padrões de pelo menos 3 x.</li>
		<li>Plotar a resposta de medição (eixo y) contra a (eixo x) concentração usando cálculo folha software e criar uma curva padrão com a equação e o valor de R-quadrado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de extrato em etanol s
	<ol>
<li>Injete 20 µ l de etanol extratos obtidos da etapa 2.5 na coluna de fase reversa.</li>
		<li>Defina a coluna HPLC a 30 ° C e a taxa de fluxo de 1 mL/min.</li>
		<li>Definir o comprimento de onda do detector UV para 280 nm e o tempo de gravador para 20 min.</li>
		<li>Analisar os padrões de pelo menos 3 x.</li>
		<li>Calcule a concentração de propolin no extrato etanol, usando a equação para a curva padrão obtida passo 3.1.7 que usa a área do pico para cada propolin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mínima concentração inibitória mínima análise concentração bactericida
Nota: O método de como é usado para avaliar a eficácia antibacteriana de propolins etanol-extraído da própolis verde taiwanesa.
<ol><li>
Preparação de organismos de teste
	<ol>
<li>Descongelar as cepas bacterianas, Staphylococcus aureus e Escherichia coli e em seguida, a cultura-los em caldo tryptic soy e caldo nutriente, respectivamente, a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Passagem do S. aureus usando caldo tryptic soy e Escherichia coli usando caldo nutriente para duas gerações e, em seguida, calcular unidades formadoras de colônia por contagem de colónias individuais em uma placa de ágar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de etanol extratos para testes de atividade antibacteriana
	<ol>
<li>Concentre-se os extratos de etanol obtidos passo 1.5 por evaporação a vácuo a 40 ° C por 15 min.</li>
		<li>Reconstituir a matéria seca com dimetilsulfóxido (DMSO) e ajustar a concentração do extrato de 12,8 mg/mL.</li>
		<li>Fazer uma diluição serial (concentrações: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 e 640 µ g/mL) de etanol extrai usando o caldo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Testes de concentração inibitória mínima
	<ol>
<li>Adicione 10 µ l de etanol diluído extratos desde 0.156 até 640.0 µ g/mL em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Usando caldo, ajustar o volume a 100 µ l e manter 5% DMSO em todas as diluições.</li>
		<li>Inocule a 100 µ l de cultura bacteriana (1 x 106/mL) na placa de 96 poços.</li>
		<li>Inóculo de cultura contendo diferentes concentrações de etanol extrai a 37 ° C por 48 h.</li>
		<li>Analisar o crescimento bacteriano, de acordo com a turbidez e usando a densidade óptica (leitor de microplacas) em 590 nm para determinar a concentração inibitória mínima (CIM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Concentração bactericida mínima testes de
	<ol>
<li>Semear 10 µ l de cultura líquida de cada poço de teste de MIC que não exibiu nenhum crescimento em uma placa de ágar.</li>
		<li>Incube a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Determine a atividade bactericida, identificando a menor concentração que revelou não visível crescimento bacteriano. A concentração que elimina completamente o crescimento celular é considerada a concentração bacteriana mínima (MBC).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Zabaiou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+propolis+extracts%3A+Something+new+from+an+ancient+product%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).</li>
<li>Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propolis%3A+Recent+advances+in+chemistry+and+plant+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin.</a> Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).</li>
<li>Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botanical+origin+and+chemical+composition+of+Brazilian+propolis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).</li>
<li>Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+prenylflavanones+from+Taiwanese+propolis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis.</a> Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).</li>
<li>Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+radical+scavenging+activity%2C+cytotoxic+effects+and+apoptosis+induction+in+human+melanoma+cells+by+Taiwanese+propolis+from+different+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).</li>
<li>Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+human+melanoma+cells+induced+by+the+novel+compounds+propolin+A+and+propolin+B+from+Taiwanese+propolis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis.</a> Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).</li>
<li>Huang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propolin+G%2C+a+prenylflavanone%2C+isolated+from+Taiwanese+propolis%2C+induces+caspase-dependent+apoptosis+in+brain+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).</li>
<li>Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+of+propolins+from+Taiwanese+green+propolis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+and+Drug+Analysis%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis.</a> Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).</li>
<li>Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+and+antimicrobial+activity+of+European+propolis%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis.</a> Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).</li>
<li>Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+effect+on+Brazilian+propolis+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity.</a> Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).</li>
<li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Taiwanese+propolis+collected+from+different+locations+and+seasons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).</li>
<li>Grange, J. M., Davey, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+properties+of+propolis+%28bee+glue%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibacterial properties of propolis (bee glue).</a> Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).</li>
<li>Kujumgiev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial%2C+antifungal+and+antiviral+activity+of+propolis+from+different+geographic+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins.</a> Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).</li>
<li>Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+ethanol+extract+of+propolis+and+antibiotics+in+the+growth+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Research%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus.</a> Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).</li>
<li>Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+and+DPPH+free+radical-scavenging+activities+of+the+ethanol+extract+of+propolis+collected+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+and+Drug+Analysis%22%5BJournal%5D)">Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan.</a> Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).</li>
<li>Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+some+commercial+extracts+of+propolis+prepared+with+different+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+Research%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents.</a> Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).</li>
<li>Cunha, I. B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+the+yield+and+composition+of+Brazilian+propolis+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Brazilian+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts.</a> Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).</li>
<li>Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+properties+of+propolis+with+ethanol+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Extraction properties of propolis with ethanol concentration.</a> Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).</li>
<li>Park, Y. K., Ikegaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+water+and+ethanolic+extracts+of+propolis+and+evaluation+of+the+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).</li>
<li>Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propolis+oil+extract%3A+quality+analysis+and+evaluation+of+its+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Research%22%5BJournal%5D)">Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity.</a> Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).</li>
<li>Machado, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+and+biological+activity+of+extracts+obtained+by+supercritical+extraction+and+ethanolic+extraction+of+brown%2C+green+and+red+propolis+derived+from+different+geographic+regions+in+brazil%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil.</a> PLoS One. 11 (1), e0145954(2016).</li>
<li>Monroy, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brazilian+green+propolis+extracts+obtained+by+conventional+processes+and+by+processes+at+high+pressure+with+supercritical+carbon+dioxide%2C+ethanol+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Supercritical+Fluids%22%5BJournal%5D)">Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water.</a> The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).</li>
<li>Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+spectrophotometric+method+for+quantification+of+prenylated+flavanones+in+pacific+propolis+from+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan.</a> Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).</li>
<li>Chen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taiwanese+green+propolis+ethanol+extract+delays+the+progression+of+type+2+diabetes+mellitus+in+rats+treated+with+streptozotocin%2Fhigh-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet.</a> Nutrients. 10 (4), e503(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Um estudo relatou que a maceração, utilizando diferentes concentrações de etanol, poderia ser usada para extração de Própolis brasileira17; no entanto, o processo foi demorado17. Demorou pelo menos 10 dias para extrair os compostos bioativos, tais como conteúdo fenólico, de Própolis brasileira17. Alternativamente, extração de etanol em combinação com aquecimento a 37 ° C, 50 ° C ou 70 ° C durante 30 min foi proposta para a extração de Própolis brasil...

Própolis é uma mistura de resina natural produzida pela espécie de abelha Apis mellifera. A própolis tem sido amplamente utilizada desde os tempos antigos em medicamentos de folk. Recentemente, um estudo relatou que a Própolis é benéfico para a prevenção de infecções microbianas e inflamação1. Numerosos estudos têm demonstrado que os principais compostos bioativos na própolis são ésteres de ácidos fenólicos, flavonoides, composição p-cumarínico ácidos e ácidos de diterpenic2,3. Até à data, foram identificados 10 derivados de flavanone composição da própolis verde taiwanesa através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)4,5,6,7. O mais abundante entre estes é propolins C, D, F e G5,7. Os efeitos biológicos consideráveis da própolis verde taiwaneses estão correlacionados com seu alto teor de propolins8.
As concentrações de compostos bioativos em Própolis variam muito, dependendo da época e a localização geográfica do que a Própolis é obtida. Própolis Europeu contém principalmente os flavonoides agliconas e fenólicos ácidos9. Os principais compostos bioativos em Própolis do Brasil são de composição p-cumarínico ácidos, tais como o artepillin C10. Um estudo demonstrou que a temporada é um fator crítico na determinação do teor total de propolin em Taiwan própolis verde11. O conteúdo de propolin em Taiwan própolis verde é mais alto no verão (maio - julho) e menor no inverno11. A propriedade anti-bacteriana da própolis tem sido amplamente considerada como um indicador de atividade biológica. Geralmente, as amostras de Própolis coletadas de várias regiões têm exibiu uma propriedade antibacteriana semelhante; por exemplo, é geralmente eficaz contra quase todas as bactérias gram-positivas e exibe um efeito antibacteriano limitado contra bactérias Gram-negativas10,12,13. Interações sinérgicas entre os flavonoides na Própolis foram demonstradas para ter um efeito antibacteriano14. Da mesma forma, própolis verde taiwanesa foi relatado para ter um efeito antimicrobiano contra bactérias gram-positivas,15. Além disso, um estudo identificou também um efeito antimicrobiano de interações de propolins em Taiwan própolis verde8.
A caracterização dos compostos bioativos na Própolis é difícil porque sua composição química pode variar de acordo com sua fonte de origem. Portanto, é necessário estabelecer um método viável e repetível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa. No entanto, nenhum procedimento padrão foi estabelecido para extração de própolis verde taiwanesa e posterior análise funcional. Foram propostos vários métodos que vària aplicam solventes orgânicos e inorgânicos por Própolis extração16,17,18,19,20. Porque a Própolis é uma mistura lipofílica, estudos têm demonstrado que extração orgânica é melhor do que a extração inorgânicos8,18,19. A concentração total de propolin em Taiwan própolis verde e suas propriedades antibacterianas são indicadores da qualidade da própolis verde taiwanesa. Assim, o objetivo deste estudo é apresentar um protocolo para usando o etanol como solvente para extrair e caracterizar as propriedades antibacterianas da própolis verde taiwanesa.

<table><tbody><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Whatman no. 4 papel de filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1004125</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>fase reversa RP-18 coluna</td><td>Phenomenex Inc.</td><td>00G-0234-E0</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>BCRC 10780</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>BCRC 10675</td><td></td></tr><tr><td>caldo tríptico de soja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>caldo nutriente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70122</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>moedor</td> <td>de especiariasLeitor de microplacas Waring</td><td>WSG60K</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>EMAX PLUS</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sistema</td><td>Agilent</td><td>1200 Series</td><td></td></tr><tr><td>evaporação a vácuo</td><td>B&Uuml; CHI</td><td>Rotavapor R-215</td><td></td></tr></tbody></table>

extração e análise de própolis verde de taiwan

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Própolis verde taiwanesa é rico em flavonoides, composição e apresenta uma ampla gama de atividades biológicas, tais como antioxidante, antibacteriano e uns anticâncer. Os compostos bioativos da própolis verde taiwanesa são propolins, ou seja, C, D, F e G. A concentração de propolins em Taiwan própolis verde varia de acordo com a época e a localização geográfica. Assim, é fundamental estabelecer um procedimento padrão e repetível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa. Aqui, apresentamos um protocolo que usa etanol extração, cromatografia líquida de alto desempenho e uma análise da atividade antibacteriana para caracterizar a qualidade da própolis verde taiwanesa. Esse método indica que as extrações de etanol 95% e 99,5% alcançar o rendimento máximo de matéria seca de própolis verde taiwanesa, produzindo, assim, as concentrações mais elevadas de propolins que têm propriedades antibacterianas. De acordo com esses achados, o presente protocolo é considerado confiável e reproduzível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa.

Positivos dados representativos para a extração de etanol são apresentados na tabela 1. O rendimento de matéria seca de própolis verde taiwanesa foi positivamente associado com a concentração de etanol. Os extratos de etanol 95% e 99,5% tinham matéria seca mais elevada rendimento de própolis verde de Taiwan. O rendimento de matéria seca mais baixo de própolis verde taiwanesa ocorreu quando a água foi usada como o solvente de extração. Estes resultados indicam que um solve...

Apresentamos um protocolo para usar etanol como solvente para extrair e caracterizar taiwanesa própolis verde que apresenta atividade antibacteriana.

Extração e análise de própolis verde de Taiwan

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Aqui, apresentamos o protocolo para o uso do etanol como solvente para extrair e caracterizar própolis verde taiwanesa que inibe a atividade antibacteriana. Este protocolo é um método confiável e repetível para determinar a qualidade da própolis verde taiwanesa. O procedimento de demonstração será Chun'Ting Chen e Yi'Hsuan Chien, doutorandos do meu laboratório.Para começar, pese 100 gramas de própolis verde taiwanesa. Usando um moedor de especiarias, triture a própolis certificando-se de que os pedaços são moídas em um pó fino sem partículas grandes. Coloque cinco frascos e adicione 100 mililitros de várias concentrações de etanol na água para cada um.Misture 10 gramas de própolis moída na solução de etanol em cada frasco, e incubar a 25 graus Celsius com agitação a 250 RPM por 48 horas. Depois disso, use papel filtro com um tamanho de poros de 25 micrômetros para filtrar os extratos de etanol. Usando um frasco volumoso, reconstitua os filtrados ao seu volume original de 100 mililitros com 95% de etanol.Armazene os extratos reconstituídos a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para uso. Quando estiver pronto para preparar os extratos para HPLC, use a evaporação do vácuo para concentrar 10 mililitros de cada extrato a 40 graus Celsius por 10 minutos. Asse a matéria seca a 45 graus Celsius por 24 horas.Em seguida, reconstituir cada amostra de matéria seca com 10 mililitros de 95% de etanol. Utilizando um filtro de seringa com um tamanho de poros de 0,22 micrômetros, refiltre cada extrato e colete o filtrado para análise direta com o HPLC. Para começar a estabelecer uma curva padrão, prepare um litro da solução de metanol de fase móvel para água em uma proporção de 88,8 a 11,2.Usando a solução de fase móvel como solvente, prepare diluições seriais das concentrações padrão propolin, conforme descrito no protocolo de texto. Injete 20 microliters de cada concentração padrão nas colunas de fase inversa sequencialmente da menor concentração para a mais alta. Em seguida, defina a coluna HPLC para 30 graus Celsius, defina o comprimento de renúncia do detector UV para 280 nanômetros, e a taxa de fluxo para um mililitro por minuto, e o tempo do gravador para 20 minutos.Analise os padrões pelo menos três vezes. Depois disso, use o software da folha de cálculo para conectar a resposta de medição contra a concentração resultando em uma curva padrão com uma equação determinada e valor R-quadrado. Para começar a analisar os extratos, injete 20 microliters de cada extrato na coluna de fase inversa.Defina a coluna HPLC a uma temperatura de 30 graus Celsius, e uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Defina o comprimento do detector UV para 280 nanômetros, e o tempo do gravador para 20 minutos. Analise os extratos pelo menos três vezes.Em seguida, use a curva padrão para determinar a concentração de propolin em cada extrato de etanol. Após a preparação dos organismos de teste e extratos de etanol, adicione 10 microlitadores de extrato de etanol diluído, variando de 0,156 a 640 microgramas por mililitro nos poços de uma placa de poço de 96. Use caldo para ajustar o volume em cada poço para 100 microliters, certificando-se de manter 5% DMSO em todas as diluições.Em seguida, inocular 100 microliters de cultura bacteriana em cada poço da placa 96. Cultura a 37 graus Celsius por 48 horas. Use um leitor de microplacos a 590 nanômetros para analisar o crescimento bacteriano de acordo com a turbidez e determinar a concentração inibitória mínima.Depois disso, inocular 10 microliters de cultura líquida de cada poço que exibiu crescimento em uma placa de ágar. Incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. Identifique a menor concentração que não revelou crescimento bacteriano visível para determinar a atividade bacteriana.A concentração que eliminou completamente o crescimento celular é considerada a concentração bacteriana mínima. Neste estudo, a própolis verde taiwanesa é extraída com etanol. O rendimento da matéria seca parece ser mais alto quando uma alta concentração de etanol é usada, e menor quando a água é usada.Esses resultados indicam que um solvente orgânico tem melhor desempenho durante essa extração, e que o rendimento está positivamente associado à concentração de etanol. Da mesma forma, a concentração de propolins parece estar positivamente associada à concentração de etanol durante a extração, com o maior rendimento de propolins sendo obtido nos extratos de 95% e 99,5% de etanol. Os efeitos antibacterianos dos extratos de etanol contra o Aureus S e e coli são então investigados.A concentração mínima média inibitória para S aureus parece estar entre 10 e 20 microgramas por mililitro e a concentração bacteriana média parece ser de 20 microgramas por mililitro. Os extratos de água, no entanto, não apresentaram nenhum efeito antibacteriano contra s aureus. Nenhum efeito antibacteriano é observado para E coli ao usar os extratos de água ou etanol.Um dos principais procedimentos experimentais é evitar a uniformidade da própolis verde taiwanesa durante a moagem.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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