Name: Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Aprenda a usar Ustilago maydis como cavalo de Troia para entrega in situ de proteínas em milho. Este método permite estudar funções proteicas e progressão de infecção em folhas, espigas e tasselos.

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Os autores gostaria de agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand para fornecer material de espaço e a planta do laboratório. O trabalho original sobre o método de cavalo de Troia foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de Leopoldina e projeto NSF IOS13-39229. O trabalho apresentado neste artigo foi apoiado por SFB924 (projetos A14 e B14) da DFG.

1. construção de um cavalo de Troia maydis U.
Nota: Veja a Figura 1.
<ol><li>Amplifica um gene de interesse do milho do cDNA usando as primeiras demão gene-específico e uma correcção DNA polimerase. Clonar o principal produto do PCR e transformar a construção em Escherichia coli , seguindo as instruções do fornecedor do plasmídeo. Verifique se o gene correto da sequência de interesse pelo prior de sequenciamento Sanger usar para as próximas etapas da clonagem. Nota: Especificações de PCR precisam ser otimizado devido às especificidades de sequência da primeira demão e condições de reação ideal DNA polimerase.</li>
	<li>Desenho de primers para amplificar o milho gene de interesse sem a sequência de codificação um peptídeo sinal (SP).</li>
	<li>Estender o 5´ final do primer reverso com o motivo RSIATA e um Ncoeu corte local (tabela 1).</li>
	<li>Amplifica o milho gene de interesse com uma correcção DNA polimerase usando a construção PCR gerada em 1.1, como o modelo PCR.</li>
	<li>Duplo-digerir o produto do PCR e do plasmídeo de transformação U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha15, com Xbaeu e Nco I. purificar o produto do PCR digerido e plasmídeo.</li>
	<li>Ligar o produto do PCR digerido no p123-Ppit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha modeloUmusando T4 DNA ligase, seguindo as instruções do manufacturer´s. Transformar o produto de ligadura em Escherichia coli e verifique se o gene correto da sequência de interesse por Sanger sequenciamento.</li>
	<li>Linearizar a p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -gene de interesse-mCherry-Ha com a enzima de restrição Sspeu e transformação de DNA para o solopathogenic U. maydis Coe SG20016. Isolar o U. maydis transformants pela seleção carboxin e confirmar transformants isolados por Southern blot análise16. Nota: Para cada proteína de interesse, pelo menos três independentes U. maydis transformants deve ser isolado e analisado para estimar os efeitos de fenótipo de mutações aleatórias de fundo.</li>
</ol>2. meios de cultura
<ol><li>Preparar YEPSlight líquido médio16: extracto de levedura de 1,0% (p/v), 0,4% (p/v)-Bacto peptona e 0,4% (p/v) de sacarose. Dissolver todos os componentes em ddH2O e autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.</li>
	<li>Preparar batata-dextrose-ágar (ágar-PD)20: 3,9% (p/v) de batata dextrose agar e 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Misturar todos os componentes diretamente na garrafa para autoclave e adicione O ddH2mais uma barra de agitação magnética. Autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.</li>
	<li>Preparar o PD-carvão ágar20: 3,9% (p/v) batata dextrose ágar-ágar, carvão de 1% (p/v) e 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Misturar todos os componentes diretamente na garrafa para autoclave e adicione O ddH2mais uma barra de agitação magnética. Autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.</li>
</ol>3. planta de infecção
<ol><li>Executar análise de milho divisão celular em resposta ao cavalo de Troia, entregado a proteína (por exemplo, à base de microscopia célula contando) previamente. U. maydisinduzida proliferação celular milho e formação de tumor subsequentes começa em torno de 4-5 dias pós infecção. As avaliações quantitativas doença dependem do tecido e devem ser realizadas de 6 a 14 dias pós infecção. Nota: Diferentes cultivares de milho mostram diferentes níveis de suscetibilidade à infecção U. maydis . Milho cvs W23, A188, sílex de Gaspe, cedo Golden Bantam ou Va35 mostrar sensibilidade para este patógeno e são, portanto, as cultivares adequadas para estudos de cavalo de Troia.</li>
	<li>Preparação do inóculo maydis U.
	<ol>
<li>Inclua a estirpe do progenitor SG200 como controlo negativo em todos os experimentos de cavalo de Troia para estimar os efeitos colaterais sobre a infecção pela cepa transgênica. Aqui, use uma tensão U. maydis , expressando uma versão não-segregada da proteína de interesse, como controlo negativo. No entanto, por razões de exequibilidade (por exemplo, maiores seleções), a cepa progenitora pode ser a escolha mais fácil de controlar.</li>
		<li>Antes de iniciar o experimento, estime o que equivale de cultura de infecção é necessários. Tenha em mente que a infecção de cada planta requer 1-1,5 mL de suspensão de U. maydis depende do tipo de tecido de milho. Nota: Aproximadamente 1 mL de uma cultura da noite é suficiente para a diluição de uma OD600 de 0,2 em 20 mL de meio deluz YEPS, e 25 mL de uma cultura de U. maydis com uma OD600 de 0.8-1.0 são suficientes para a infecção de plantas de 13-16.</li>
		<li>Zero U. maydis de agar um PD da placa usando uma pipeta Pasteur estéril, inocular em 5 mL de meio deluz YEPS e deixar a cultura crescer a 28 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 16 h.</li>
		<li>Antes da infecção, examine a cultura de inoculação de U. maydis por microscopia de luz padrão para crescimento adequado e contaminação bacteriana na ampliação de X 400. Nota: Em uma cultura adequada, apenas o fungo em forma de charuto é visível (Figura 2).</li>
		<li>Misture 900 µ l de fresco YEPSluz com 100 µ l da cultura durante a noite e medir o OD600 usando meio deluz YEPS como um espaço em branco na análise Espectrofotômetro.</li>
		<li>Diluir a cultura durante a noite com meio deluz YEPS fresco para uma OD600 de 0.2 e deixar a cultura crescer a 28 ° C, com agitação constante a 200 rpm até atingir a fase de crescimento de log mid indicada por overdose600 nm de 0.8-1.0. Nota: U. maydis células duplicar a cada 2 h sob essas condições, assim, o desejado de OD600 é alcançado após 4-5 h de cultivo.</li>
		<li>Recolher as células em OD600 de 0.8-1.0 por fiação a 3.000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o centrifugado uma vez com o ddH2O. Para este efeito, adicionar um volume de cultura de DDQ2O, rotação com 3000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células cuidadosamente em ddH2O usando uma pipeta de vidro de 20 mL, ajustando assim o OD final600 3.0 (para um ensaio de cavalo de Troia) ou 1.0 (para classificação da doença).</li>
	</ol></li>
	<li>Verificação do cavalo de Troia: em planta de secreção da proteína do milho fusão
	<ol>
<li>Infectar plântulas de milho com um cavalo de Troia cepa17.</li>
		<li>Realize imagens microscópicas de mudas infectadas em 2-3 dias pós infecção usando um microscópio confocal de varredura a laser. Para este fim, excisar um pedaço retangular da folha 1 cm abaixo do ponto de injeção, colocar a amostra numa lâmina de microscópio e adicionar uma gota de DDQ2O. Para visualizar a proteína de fusão de mCherry, excitar o espécime em λ = 561 nm e emissão recorde em λ = 580-630 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção de folhas de milho adultas
	<ol>
<li>Cultivar plantas de milho para a fase de folhas adultas (pelo menos quando da folha 7 cresce dentro do caule). Nota: Este estágio é alcançado após quatro semanas após a sementeira sob condições de estufa de 14 h, h do dia/10 de 28 ° C, ritmo de noite de 22 ° C usando CV W23. Duração pode variar com as condições de cultivar e estufa de milho.</li>
		<li>Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.</li>
		<li>Pressione o talo cuidadosamente para localizar o tecido meristema do caule. A base do meristema pode ser distinguida por uma transição de talo mais duro de tecido mais suave.</li>
		<li>Marca a meristema no talo usando uma caneta.</li>
		<li>Injecte 1,5 mL de cultura U. maydis 1 cm acima do tiro meristema ou meristema de inflorescência.</li>
		<li>Taxa de sintomas da doença em 6 e 12 dias pós infecção.</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção de borlas
	<ol>
<li>Cultivar plantas de milho até atingir o estágio de borla. Nota: Um cronograma detalhado sobre o desenvolvimento da antera e pendão em milho CV. W23 foi descrito anteriormente,1819. Borlas, contendo pre-meióticas anteras são altamente suscetíveis à infecção U. maydis ; no milho CV. W23 borlas são do tamanho de 4 a 7 cm.</li>
		<li>Pressione o talo cuidadosamente para localizar a borla no tronco.</li>
		<li>Marca a ponta e a base da borla na haste usando uma caneta.</li>
		<li>Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.</li>
		<li>Injete 1,5 mL do inóculo em torno o pendão. Para assegurar a distribuição igual do inóculo, lentamente coloque 0,5 mL cada na ponta, a parte do meio e a base da borla marcada com a caneta.</li>
		<li>Taxa de sintomas da doença em 10 dias pós infecção.</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção dos ouvidos Nota: o desenvolvimento de tecido de orelha difere em diferentes cultivares de milho e as condições da estufa e devem ser cuidadosamente observado antes da inoculação. Orelhas, começando a superar sedas são altamente suscetíveis à infecção U. maydis .<ol>
<li>Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.</li>
		<li>Injete a agulha de inoculação para o espaço entre as folhas de casca tão profundamente quanto possível, sem ferir o ouvido.</li>
		<li>Lançamento 1,5 mL do inóculo em torno da orelha.</li>
		<li>Remova a seringa e agulha e massagear cuidadosamente o cob para distribuir a solução U. maydis igualmente.</li>
		<li>Taxa de sintomas da doença em 14 dias pós infecção.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmar a viabilidade do inóculo maydis U.
	<ol>
<li>Queda de 10 µ l de inóculo numa placa de ágar carvão PD e incubar a temperatura ambiente por 2 dias. Nota: Se a respectiva cultura U. maydis é capaz de filamentos forma, micélio branco, macio torna-se visível (Figura 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Pesquisa de cultura moderna exige protocolos de análise molecular, a genética e os níveis de proteína. Genética de acessibilidade através de transformação não é disponível ou ineficiente e demorado para a maioria das espécies de culturas como o milho. Além disso, ferramentas genéticas confiáveis tais como sistemas de repórter do promotor são escassas, o que torna difícil para o estudo da função das proteínas in situ com alta resolução spatiotemporal nos sítios de tecidos distintos. Apoplástica proteínas podem se...

O patógeno biotrófica Ustilago maydis é o agente causador da doença obscenidade milho1. Ele infecta todas as partes aéreas de milho, resultando em tumores grandes que contêm esporos melanized, preto. A nível global, U. maydis é estimado para causar uma perda anual de cerca de 2% do rendimento do milho, enquanto tumores são apreciados como uma iguaria gastronômica no México. Infecção da planta é iniciada por um apressório que secreta enzimas de lise de parede celular para penetrar a primeira camada de células epidérmicas de milho. De um local de infecção primária, U. maydis cresce intracelular e intercellularly, invadindo a célula de uma a duas camadas cada dia1,2. Resultados de infecção bem sucedida na hipertrofia da planta que se transforma em tumores visíveis após cinco dias pós infecção1,3,4. Durante todas as fases da infecção, hifas fúngicas invaginate da membrana do citoplasma de planta sem qualquer contacto directo para o anfitrião citoplasma1,2. O espaço de apoplasmic apertado entre as hifas infectante e a membrana plasmática de planta é considerado a hospedeiro/agente patogénico interativas do site, chamada de zona de interação biotrófica. A fim de superar o sistema imune inato de planta, U. maydis segrega uma matriz de proteínas efetoras para a interação biotrófica zona1. Alguns efetores são ocupados por células vegetais, enquanto os outros permanecem no biotrófica interação zona5,6,7,8. Um efetor apoplástica é UmPit2, que interage com proteases apoplástica milho para impedir a libertação da sinalização do peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplástica protease atividade9,10.
Nas últimas décadas, U. maydis tornou-se não apenas um modelo para a genética de fungosas na interação planta-patógeno, mas também uma ferramenta valiosa na biotecnologia devido a um ciclo de vida bem compreendida, fácil acessibilidade genética e expressão heteróloga de secretado proteínas11,12,13. Foram determinados sinais para ambos secreção de proteína convencional e não convencional que permite o controle de modificações do posttranslational14. Recentemente, U. maydis foi empregado como uma ferramenta de cavalo de Troia para estudar pequeno, secretada milho proteínas em situ15. A abordagem de cavalo de Troia foi usada com sucesso para analisar a função da proteína secretada, pequena ZmMAC1 que está envolvido no desenvolvimento da antera. ZmMAC1 induz a divisão periclinal de células pluripotentes e especificação de destino célula do recém-formado células15. Pelo mesmo método, a função biológica do milho associada a danos peptide ZmZIP1 foi revelada. U. maydis segregar o milho que zmzip1 resultou na deficiente formação de tumor10. Assim, o cavalo de Troia abordagem representa uma valiosa rota alternativa à proteína em situ estudos com alta resolução spatiotemporal que faz nem exigem geração de linhas de transformação de milho estável nem infiltração de tecido com heterologously proteínas expressas e purificadas. Em particular, a estratégia do cavalo de Troia permite a secreção de qualquer proteína heteróloga para o apoplasto milho e comparação direta de infectados contra células não infectadas planta dentro do mesmo tecido.
Este protocolo ilustra as principais etapas para a geração de uma estirpe de cavalo de Troia U. maydis para estudar uma proteína de interesse. Além disso inclui informações precisas sobre os procedimentos de infecção de três tipos de tecido diferentes de milho (folhas adultas, borlas e orelhas) com U. maydis, que é um pré-requisito para estudar a função de progressão e proteína de infecção spatiotemporal nestes tecidos alvo. Sem mais especificações são determinado na amplificação de gene milho e microscópicas de imagens técnicas, uma vez que estas etapas são alvo específico e dependente do instrumento. Assim, o presente protocolo é dirigido aos usuários experientes de técnicas padrão de biologia molecular.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 2 mL&nbsp;</td>Agulha hipodérmica <td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>cDNA de milho</td><td></td><td></td><td>de tecido de milho expressando o gene de interrest</td></tr><tr><td>Carvão vegetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> confocal de varredura a laser <td>usa equipamento disponível localmente</td></tr><tr><td>Cubeta (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora-agitadora ajustada para 28 &graus; C, 200 rpm</td><td></td><td></td><td>usam equipamentos disponíveis localmente</td></tr><tr><td>Microscópio óptico com ampliação</td><td></td><td></td> de 400 vezes <td>usam equipamentos disponíveis</td></tr> <tr><td>localmenteNco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>entre em contato com o autor correspondente&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur (vidro, ponta longa)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>pode ser trocada por outros vetores básicos de clonagem como pENTR ou pJET</td></tr><tr><td>Ágar Dextrose de Batata&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr>Caneta <td></td><td></td><td>Sharpie</td><td>usa equipamento disponível localmente</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td>usa equipamento disponível</td></tr> <tr><td>localmenteSsp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

usando o ustilago maydis como um cavalo de troia para em situ entrega de milho proteínas

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Inspirado pelo mito de cavalo de Troia Homer´s, nós produzimos o patógeno milho, Ustilago maydis entregar proteínas secretadas para o apoplasto milho permitindo análise fenotípica em vivo. Este método não se baseia na transformação de milho mas explora recursos secretoras de patógenos e genética microbiana. Neste documento, permite a inspeção de in vivo entregue proteínas secretadas com alta resolução spatiotemporal em diferentes tipos de tecidos e infecção sites. A estratégia do cavalo de Troia pode ser utilizada para complementar transitoriamente milho fenótipos de perda-de-função, caracterizar funcionalmente os domínios da proteína, para analisar os efeitos da proteína alvo, ou estudar a sobredosagem de proteína em jogo, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de proteína no sistema de colheita de milho. Este trabalho contém um protocolo preciso sobre como gerar uma cepa de cavalo de Troia, seguida de protocolos padronizados de infecção para aplicar esse método para três tipos de tecido diferentes de milho.

Construções para experimentos de cavalo de Troia U. maydis são clonadas em plasmídeo p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene de interesse-mCherry-Ha. O milho gene de interesse é fundido a uma repórter de fluorescência de mCherry e um epítopo HA-marca. A expressão da proteína de fusão está sob controle dopit2 U. maydis Um promotor que é especificamente ativado durante a ...

Este trabalho descreve a clonagem de uma estirpe de cavalo de Troia de Ustilago maydis para a entrega no local das proteínas secretadas de milho em três tipos diferentes de tecidos de milho.

Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Investigar processos sobre níveis genéticos e proteicos é crucial na pesquisa de culturas. Nossa abordagem permite a inspeção de proteínas de labirinto secretadas com maior resolução temporal espacial em diferentes lados e tecidos de infecção. O Método Cavalo de Tróia explora recursos automatizados úteis.Contorna as transformações de labirintos demoradas e desafiadoras, e facilita estudos detalhados sobre proteínas secretas dentro do labirinto appelplatz. Informações detalhadas sobre a infecção adequada de folhas de labirinto adicionadas, tassels e ouvido. E mostra o estudo bem sucedido da progressão da infecção e da função proteica no tecido alvo.Demonstrando o procedimento será Isabell Fiedler, estudante de pós-graduação do laboratório. Para começar o experimento, arranhe Eumadous de uma placa de pediatr usando uma pipeta pasteur estéril. Inoculado 5 mililitros de YEPS Light Medium com Eumadous.Cresça a cultura a 28 graus Celsius, com agitação constante a 200 rpm por 16 horas. No dia seguinte misture 900 microliters de yeps light frescos com 100 microliters da cultura da noite para o dia. Meça o OD-600 usando o YEPS Light Medium como um branco na análise do espectrofotômetro.Diluir a cultura da noite para o dia com o fresco YEPS Light Medium para um OD-600 de 2. Deixe a cultura crescer a 28 graus Celsius com agitação constante a 200 rpm, até chegar à fase de crescimento do tronco médio, indicada por um OD-600 de 8 a 1,0. Após a incubação, colde as células girando-as a 3000 vezes chi por 10 minutos.Descarte o supernaspeso. Em seguida, lave a pilette celular uma vez com 1 volume de cultura de DDH2O. Gire as células a 3000 vezes chi por 10 minutos e descarte o supernasce.Em seguida, suspenda cuidadosamente a pilette celular em DDH2O, usando uma pipeta de vidro de 20 mililitros. Ajustando assim o OD-600 TO 3.0 final para um ensaio do Cavalo de Tróia ou 1.0 para classificação de doença. Cultive as plantas do labirinto para um estágio de folhas adultas, onde pelo menos a folha 7 cresce dentro do talo.Em seguida, transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com uma agulha hipodérmica calibre 20 bi um. Pressione o talo cuidadosamente para localizar o tecido da haste do espelho. A base do Tronco Do Espelho pode ser distinguida por uma transição de talo mais duro para tecido mais macio.Marque o tronco do espelho no talo usando uma caneta. Injete 1,5 mililitros de cultura eurómade 1 centímetro acima do Haste do Espelho de Shoot ou da Haste do Espelho de Inflorescência. Uma vez que as plantas do labirinto cheguem ao estágio tassel, pressione o talo cuidadosamente para localizar o tassel na haste.Marque a ponta e a base do tassel na haste usando uma caneta. Transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com uma agulha hipodérmica calibre 20 bi um para injetar um total de 1,5 mililitros do inóculo ao redor da tassel. Para assegurar a distribuição igualitária do inóculo, coloque lentamente 5 mililitros na ponta, no meio e na base do tassel marcado com a caneta.Transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com 20 bitolas bi uma agulha hipodérmica. Injete a agulha de inoculação no espaço entre as folhas da casca o mais profundamente possível sem ferir a orelha e, em seguida, solte 1,5 mililitros do inóculo ao redor da orelha. Em seguida, remova a seringa e a agulha e massageie cuidadosamente a espiga para distribuir a solução eurómes igualmente.Solte 10 microliters de inóculo em uma placa de carvão pd. Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 2 dias. Hyphae secretando ZM Mach1 são cercados por sinal fluorescente e cereja.Em contraste, a hifa não inclinada só mostra sinal fluorescente no citoplasma fúngico. A localização inadequada de tassel ou a distribuição desigual do inóculo podem resultar em tassel não infectado ou apenas infecção parcial do tassel em comparação com a distribuição uniforme. A cepa solo patogênica do Cavalo de Tróia Progenester SG-200, cultivada em carvão PD auger, forma filamentos brancos de fluff na placa, como mostrado.Enquanto a cepa eumadous FB1 requer acasalamento antes da formação de filamentos infecciosos. Após a infecção, a possível resposta de sinais da proteína hepática do Cavalo de Tróia pode ser analisada usando vários métodos, incluindo classificações de doenças ou imagens microscópicas. Para muitos patógenos, a transformação e a secreção são bem compreendidas e podem ser exploradas de forma semelhante.Assim, permitem o estudo do hospedeiro, que não são suscetíveis à transformação.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculação direta de mudas de milho por injeção com clones infecciosos do Vírus do Mosaico do Rabo-de-Raposa Recombinante e do Vírus do Mosaico da Cana-de-Açúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a entrega mediada por Agrobacterium de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico. Ele descreve o processo de infecção por Agrobacterium , disseminação viral sistêmica e mudanças fenotípicas impulsionadas pela interferência de RNA.

Entrega mediada por agrobactérias de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico

Descreve-se o uso de um método de injeção de agulha para inocular plantas de milho e teosinto com o pato patogênico biotrófico Ustilago maydis.  O método de inoculação da injeção de agulha facilita a entrega controlada do patógeno fúngico entre as folhas da planta onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria. Este método é altamente eficiente, permitindo inoculações reprodutíveis com u. maydis.

Um método rápido e eficiente para avaliar a patogenicidade dos maydis ustilago nas linhas de milho e teosinte

Descrevemos uma estratégia de substituição de genes robusta para manipular geneticamente o fungo Ustilago maydis smut. Este protocolo explica como gerar mutantes de deleção para investigar fenótipos de infecção. Ele pode ser estendido para modificar os genes de qualquer forma desejada, por exemplo, através da adição de uma sequência que codifica uma etiqueta de proteína fluorescente.

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

Genes morfogênicos vegetais podem ser usados para melhorar a transformação genética de genótipos recalcitrantes. Descrito aqui está um protocolo de transformação genética mediado pela Agrobacterium(QuickCorn) para três importantes linhas de milho público.

Agrobacterium-Transformação de embrião imaturo mediado de linhas de milho recalcitrante usando genes morfogênicos

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para transfectar transitoriamente milhões de protoplastos de milho para testar grandes bibliotecas de plasmídeos em células do mesofilo do milho.

Transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho

sequenciamento de uma única célula é uma ferramenta cada vez mais popular e acessível para lidar com alterações genômicas em alta resolução. Nós fornecemos um protocolo que utiliza a sequenciação de célula única para identificar alterações no número de cópias em células individuais.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Uma estratégia para gerar mutações em genes de histonas em sua localização endógena em Saccharomyces cerevisiae é apresentada.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

Aqui descrevemos a entrega de microRNA utilizando um vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 em um modelo do rato de uma doença neuromuscular. Uma única administração periférica em camundongos resultou em superexpressão de miRNA sustentada no músculo e neurônios motores, oferecendo uma oportunidade de estudo miRNA função e potencial terapêutico em vivo.

Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

Aprenda a usar Ustilago maydis como cavalo de Troia para entrega in situ de proteínas em milho. Este método permite estudar funções proteicas e progressão de infecção em folhas, espigas e tasselos.

Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas

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