Name: Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a técnica de Flash NanoPrecipitation para encapsular compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas usando misturadores CIJ. Este método escalável oferece uma plataforma versátil para sistemas de liberação de fármacos.

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Este trabalho foi financiado por fundos da Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), o Bill e Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) e o nacional Science Foundation pós-graduação bolsa de pesquisa (DGE-1656466) atribuído a K.D.R.

Os autores não têm nada para divulgar.

O encapsulamento de compostos hidrofóbicos, como vitamina E, como na etapa 1 do protocolo, tem sido extensivamente descrito9,14,28. Relativamente monodisperso partículas são produzidas porque a escala de tempo para a mistura é menor do que a escala de tempo para a agregação e o crescimento das partículas. Especificamente, a solução solvente/antisolvent mista rapidamente se torna homogênea, que permite a nucleação ocorra uniformemente. Montagem do copolímero em bloco para a superfície da partícula então estérico que interrompe a partícula crescimento5. Desde o tempo de mistura na câmara (turbulência) é uma função das taxas de fluxo de entrada para a CIJ ou o MIVM, há uma taxa de entrada, que ocorre após a transição para a mistura turbulenta, onde o tamanho de partícula é essencialmente constante13. Isto fornece robustez adicional ao processo como alguns lotes de variação na vazão de entrada (ou seja, velocidade de depressão de seringa) pode ser tolerada sem impacto significativo para o tamanho final da NP, como pode ser visto da Figura 3. Velocidades de entrada mais lenta ou irregular podem resultar em partículas maiores ou mais polydisperse distribuições, como visto no exemplo de falha de ignição. FNP também foi estendido para encapsular compostos hidrofílicos em nanopartículas por inverso NanoPrecipitation Flash. Estes invertido nanopartículas pode então ser usados para criar micropartículas ou ser revestido com PEG para criar nanopartículas dispersáveis em água25. Os princípios subjacentes de montagem permanecem os mesmos, embora haja a complexidade adicional de reticulação, o núcleo da partícula. Isto é necessário para a estabilização da partícula em um ambiente aquoso. Em geral, uma proporção de 1:1 carga em comparação com o bloco de poliácida é suficiente, embora as interações ionic podem ser promovidas pelo ajuste do pH através da adição de uma base de19. Neste protocolo, tem sido descrito apenas o primeiro passo de processo para NPs de forma invertida.
Além de mistura rápida, formulação bem sucedida pela FNP ou iFNP é limitada aos casos onde várias condições podem ser met9,14. Primeiro, todo fluxo de entradas deve ser miscível. Enquanto emulsões têm sido usados para produzir o NPs, FNP requer uma fase de solução uniforme na batedeira. Em segundo lugar, o componente do núcleo deve ser quase insolúvel no solventes condições na batedeira (para a CIJ, uma mistura 50/50 por volume) para conduzir a nucleação rápida. Caso contrário, uma parcela significativa permanecerá desencapsulada ou irá precipitar após diluição mais com antisolvent. O MIVM pode permitir maior teor de antisolvent na câmara de mistura para limitações de solubilidade material de núcleo de endereço. Muitas vezes é útil gerar curvas de supersaturação de dados de solubilidade em função da composição solvente para orientar o processo de projeto9. A Figura 6 mostra as curvas representativas para dois compostos. Baixa supersaturação nos méritos de condições câmara misturadora operando em diferentes composições, tipicamente usando o MIVM. Maior supersaturação favorece a nucleação do componente núcleo sobre crescimento de partícula, mas uma incompatibilidade no tempo de montagem de material do núcleo e o estabilizador pode resultar em grandes agregados da terapêutica. D'Addio e Prud'homme tem revisto a aplicação de tais curvas de supersaturação em detalhe9. Finalmente, o BCP molecularmente deve ser dissolvido no fluxo de solvente e o fluxo de antisolvent deve ser seletivo para um quarteirão. O BCP deve ser suficientemente anfifílica para fornecer tanto um solvophobic motor do bloco recolhido para ancorar o estabilizador na superfície de partículas e para o bloco de solvated conferir estabilidade estérica para a partícula. Solventes diferentes dos descritos no protocolo podem ser utilizados enquanto se encontram essas restrições.
Prática com operação manual seringa pode melhorar a taxa de sucesso durante a triagem. Conforme observado acima, operação acima a transição para condições de mistura homogêneas, turbulentas, não significa que pequenas variações na taxa de fluxo são toleradas no processo28. Escala-se para resultados de bomba, controlada por computador fluxos em ganhos ainda maiores em consistência devido as taxas de fluxo de entrada pode ser reproduzido. Em qualquer momento durante o pós-processamento das partículas, inspeção visual ou DLS análise pode indicar a presença de grandes agregados, que pode ser devido à instabilidade incidental de poeira ou partículas. Quando necessário, o fluxo pode ser filtrado com um tamanho de poro de filtro apropriado. Na ausência de agregados, achamos que menos de 5% em massa é normalmente perdida quando nanopartículas PEG-revestido de filtragem se o tamanho do filtro nominal é maior do que a distribuição de tamanho de partícula. Quando a filtragem de agregados, determinação experimental da massa perdida durante o processo é necessária. Quantificação da perda de massa pode ser realizada de duas maneiras. A massa de sólidos totais em um determinado volume pode ser determinada por análise térmica química antes e depois da filtragem para identificar a extensão da mudança (consulte a seção de Informações suplementares 2). Alternativamente, as partículas podem ser recuperados (por exemplo, por liofilização) e dissolvido em um solvente bom. A concentração do material do núcleo pode então ser medida diretamente por uma técnica apropriada como espectrofotometria ultravioleta-visível ou cromatografia.
Para a FNP, o residual 10 vol % solvente orgânico (por exemplo, THF) deve ser retirado a dispersão aquosa. Isso pode ser feito por destilação por evaporação14,29, diálise30ou de31,de filtração tangencial fluxo32. Considerações práticas para cada etapa de processamento são descritas nas citações fornecidas. Para diálise, membranas típicas são kDa 3,5 ou 6-8 kDa cortes, embora maiores opções estão disponíveis. Este corte de peso molecular é suficiente para a remoção do solvente quando diálise para 24h usando várias mudanças de banho. O uso de filtração tangencial fluxo implica um processo de desenvolvimento como deve ter cuidado para evitar a indução de agregação devido à polarização de concentração na superfície da membrana. Nós achamos que reduzindo a composição de solvente orgânica abaixo de um valor dependente do sistema, geralmente 2-10 vol %, elimina a agregação na superfície da membrana. Após o processamento, a concentração de nanopartículas é prontamente determinada por análise térmica química (consulte a seção de Informações suplementares 2). Muitas vezes é desejável para transportar ou armazenar partículas em uma forma altamente estável. Dispersões aquosas podem simplesmente ser congeladas rapidamente usando uma mistura de gelo seco/acetona e em seguida, armazenado a-80 ° C. Alternativamente, pós secos podem ser obtidos por liofilização33,34 ou spray de secagem24. Frequentemente, um crioprotetor deve ser adicionado para reduzir a agregação de nanopartículas durante o congelamento ou secagem. Açúcares (sacarose, trealose, etc.), poly(ethylene glycol) ou ciclodextrinas podem ser rastreadas para eficácia sobre uma escala das concentrações por tamanho de monitoramento por DLS35,36,37,, 38. Problemas comuns de estabilidade NP durante processamento estão muitas vezes relacionados à solubilidade ou fase de separação no núcleo resultando em rearranjo em direção um estado de energia mais baixo em condições onde a mobilidade é maior. Uso dos materiais do núcleo co, estabilizadores alternativos ou composição solução externa modificada pode ajudar a melhorar a estabilidade14,16,17,39,40, 41.
Conforme observado acima, o MIVM permite maior teor de antisolvent na câmara de mistura quando necessário para alcançado alta supersaturação. Também pode permitir que a segregação física das espécies em mais de duas correntes quando restrições de reatividade ou solubilidade exigirem-lo. Um exemplo é a formação de nanopartículas de proteína estabilizada zein do antibiótico clofazimina24. A clofazimina hidrofóbica é introduzida em um fluxo de acetona; Zein é introduzida em um fluxo de 60% etanol aquoso; caseína, que complexos com zein, é trazida com um fluxo tampão aquosa, e o fluxo de quarto é buffer adicional para aumentar a taxa de água, a acetona e etanol. Dois córregos solventes são necessários desde clofazimina e zein não são solúveis em um solvente comum. Este processo não poderia ser feito em um misturador CIJ dois-jato. Esta formulação estabilizada proteína também demonstra que a FNP não é limitado aos estabilizadores do BCP. Partículas de Janus foram produzidas sem estabilizador42 e uma gama de estabilizadores de baixo custo tem sido demonstrada para aplicações oral24. Notavelmente, copolímeros como metilcelulose hidroxipropil podem ser usados no lugar de copolímeros de bloco24. Materiais do núcleo podem ser feitos mais hidrofóbicas por um número de técnicas. Emparelhamento hidrofóbico íon tem sido aplicada para encapsular uma ampla gama de compostos que têm solubilidade intermediária43,44,45. Exemplos extremamente hidrofóbicos tem sido gerado e então encapsulado46. Ácidos nucleicos foram encapsulados por complexação com lipídios catiônicos47. Importante, esses estudos têm demonstrado que a FNP pode produzir uma gama de produtos químicos de superfície de partícula. Têm sido utilizados estabilizadores mais, mistos, contendo uma fração do BCP que tenha sido modificado com um ligante direcionamento na extremidade da cadeia. Isso permite um controle preciso sobre o conteúdo do ligante na superfície, desde que a composição da partícula reflete o fluxo de entrada composição23,48. Da mesma forma, é possível incorporar vários componentes principais, bem como, incluindo corantes e nanopartículas inorgânicas3,8.
NanoPrecipitation flash é uma abordagem dimensionável de nanopartículas poliméricas, compostas por um núcleo hidrofílico ou um hidrofóbico. Se os critérios enumerados acima, geralmente mais 95% do material do núcleo é encapsulado em alta fração de massa na partícula. Os três exemplos aqui apresentados foram realizados em escala de bancada, exigindo alguns miligramas de material e cerca de 0,5 mL em cada fluxo de entrada. Isto permite a seleção rápida de condições de partícula para otimização de formulação. Aumentar de formulações de chumbo para maiores tamanhos de lote é uma questão de execução do processo por mais tempo, que pode ser facilmente realizado com o uso de bombas de seringa ou controladores de fluxo. Por outro lado, a aumentar de volume adição nanoprecipitation enfrenta desafios bem documentados em manutenção suficiente micromixing no ponto de adição e contabilizar o efeito da alteração de geometria do navio49. Este é um grande obstáculo, uma vez que é crucial para a fabricação de partículas de forma consistente para atender requisitos de FDA50. Microfluídica técnicas podem também produzir nanopartículas uniformes, pode ser reproduzidas, mas apenas permitir a produção na faixa de miligrama. Por exemplo, Karnik et al relataram taxas de produção de 0,25 mg/min. para uma liberação de drogas estudo51. Escala-se mais geralmente envolve paralelização no alto custo12de capital. Com a FNP, é simples de produzir 1 grama de nanopartículas em 600 mg/min com uma bomba de seringa e alguns acessórios para ligar o misturador nas entradas. Consequentemente, a FNP representa tanto uma ferramenta de triagem de laboratório acessível-escala, bem como uma abordagem dimensionável para produção de NP para trabalho translacional.

Desde a década de 1990, tem havido um aumento constante no número de ensaios clínicos empregando nanomateriais1,2. O crescente interesse reflete a promessa de nanomateriais para melhorar a biodisponibilidade de fármacos hidrofóbicos e habilitar o direcionamento preferencial dentro do corpo3. Nanopartículas poliméricas (referidas como nanopartículas ou NPs aqui) representam uma parte crescente desta classe de materiais2. O NPs tem atraído interesse porque eles têm propriedades altamente sintonizáveis como tamanho, composição e superfície functionalization4. Quando aplicado à administração de drogas pouco solúveis, NPs frequentemente têm um núcleo-estrutura onde a terapêutica é encapsulada no núcleo hidrofóbico e o shell é composto por uma escova de polímeros hidrofílicos. Uma maneira simples para gerar essa estrutura emprega um copolímero de diblock anfifílica (BCP) que consiste de um bloco hidrofóbico degradável, que faz parte do núcleo das partículas, e bloquear um poly(ethylene glycol) hidrofílico (PEG), que constitui o pincel de polímero e transmite o impedimento estérico4,5.
Nanoprecipitation é uma técnica comum de fabricação de nanopartículas poliméricas porque é simples e não de energia intensiva6. Em sua forma mais simples, nanoprecipitation envolve a adição com uma pipeta de componentes de NP em um solvente orgânico como a acetona, para um volume adicional de água mexido. A mudança de solvente de uma solução aquosa diluída resultados para a precipitação do componente núcleo insolúvel. O estabilizador monta nesta superfície crescente da partícula, dirigido por adsorção do bloco hidrofóbico recolhido8,7,9,10. Uma distribuição granulométrica uniforme é obtida quando o solvente e a água misturam rapidamente para formar uma solução homogênea. Que mistura é mais lenta que a nucleação e montagem dos resultados de componentes em uma maior, mais população de partículas polydisperse. Embora prontamente acessível para um teste simples, a abordagem do lote mexido resulta em grande variabilidade devido à inconsistência de mistura e não é passível de aumentar6,11. Microfluídica têm emergido como uma outra avenida para produção de NP que pode ser executada continuamente. Este meio de produção foi recentemente revisado por Ding et al 11 . Uma abordagem comum usa fluxo laminar com foco para reduzir a escala de comprimento de solvente para valores de submícron. Mistura do antisolvent ocorre por difusão, portanto, dimensões de pequeno fluxo são cruciais para garantir o uniforme de partículas11,12. Paralelização de múltiplas câmaras microfluidic para aumentar é problemática para volumes de grande produção.
As condições de mistura rápidas que favorecem nanoprecipitation uniforme em microfluídica, alternadamente, podem ser produzidas em confinados, escoamentos turbulentos. Flash NanoPrecipitation (FNP) emprega especiais mistura geometrias para alcançar essas condições sob maior caudal volumétrico que possível com microfluídica. Fluxos de entrada Introduza uma câmara de mistura em condições turbulentas que levam à geração de vórtices, lamelas de solvente/anti-co-solventes formam a escala de comprimento de difusão11,13. Assim, a mistura uniforme em uma escala de tempo mais curta do que a nucleação e crescimento da terapêutica é alcançado. A geometria confinada do mixer não permite fluxo ignorando da região onde ocorre dissipação de energia turbulenta, e o mesmo processo histórico13de experiências de todo o sistema. Nucleação ocorre uniformemente na câmara de mistura e crescimento de partícula continua até interrompida pela Assembleia do BCP sobre a superfície de9,14. O fluxo misto contendo partículas estáveis pode então ser diluído com antisolvent adicional para suprimir Ostwald amadurecimento do partículas15,16,17.
Um misturador colidindo confinados do jato (CIJ) é o mais simples projeto de misturador para FNP e permite a mistura de dois fluxos de forma escalável e contínuo, como mostrado na figura 1A13. Um mixer de entrada multi vórtice (MIVM) foi desenvolvido para permitir até quatro entradas de fluxo diferentes e ainda alcançar a rápida micromixing necessário para a formação de partículas uniformes, como mostrado na figura 1B18. FNP permite o rastreio de formulação simples que pode ser facilmente traduzido para produção em escala comercial. Devido à natureza contínua do processo, tamanhos de lotes maiores não exigem novos navios, mas prefiro mais tempos de execução, permitindo a simples tradução para produção em escala quilograma no mesmo comboio equipamentos.
Hidrofílicos compostos como peptídeos e proteínas ('biológicos') também podem ser encapsulados em um processo denominado inverso Flash NanoPrecipitation (iFNP). A técnica requer uma anfifílica BCP onde um quarteirão é hidrofóbico e o outro é um poliácida19. A etapa inicial envolve a mistura rápida de um fluxo de dimetil sulfóxido (DMSO) contendo o biológico e o BCP contra um solvente lipofílico como diclorometano ou clorofórmio. Isso resulta na formação de partículas estabilizado com o pincel de bloco hidrofóbicas. Aqui, tal uma arquitetura vai ser denominada um NP 'invertida'. O núcleo contém a poliácida, que é então ionically quitosana usando um cátion multivalentes. Isto estabiliza as partículas para a transformação em um ambiente aquoso, sob a forma de micropartículas ou nanopartículas PEG-revestido por técnicas que têm sido relatadas na literatura19,20,21.
Este protocolo pode ser empregado para a produção de lab-escala de poliméricas núcleo-casca nanopartículas encapsulando compostos hidrofóbicos ou hidrofílicos. As subseções do protocolo fornecem instruções sobre o uso de ambas as classes de misturador - a CIJ e o MIVM. O leitor deve ser capaz de adaptar o protocolo para componentes principais romance e gerar reproducibly nanopartículas de um tamanho desejado usando o misturador apropriado para as entradas de fluxo. Três formulações de exemplo usando a FNP e iFNP são apresentadas abaixo. Dois empregam o misturador da CIJ e requer o MIVM15,22. A primeira formulação demonstra o encapsulamento de um modelo hidrofóbico composto pela FNP. A segunda formulação demonstra o encapsulamento de um modelo hidrófilo composto por iFNP em um misturador CIJ. A formulação final fornece um exemplo de encapsulamento de proteína por iFNP usando um MIVM. O protocolo para esta formulação terceiro descreve o uso de um MIVM em pequena escala, de mão, denominado o 'μMIVM'. O projeto de misturador é menor para permitir o rastreio de formulação simplificada, mas o comportamento de dimensionamento é bem compreendido e a batedeira não é um dispositivo de microfluidic22. A seção final do protocolo inclui algumas notas sobre escala de formulações de chumbo identificadas na triagem. Estas formulações são destinadas a fornecer pontos de acesso para o processo de aprendizagem e consequentemente usar não-degradáveis poli (estireno)-com base em polímeros. Estabilizadores alternativos têm sido descritos na literatura, com um número de opções comerciais biocompatível disponível14,23,24.

<table><tbody><tr><td>Misturador de jatos de impacto confinado</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Consulte informações suplementares para desenhos de engenharia. Texto de revisão para validação do novo misturador</td></tr><tr><td>Luer fitting</td><td>Idex Health & Ciência</td><td>P-604</td><td>Monte na entrada do misturador CIJ ou MIVM com roscas correspondentes</td></tr><tr><td>Encaixe de plugue</td><td>Idex Health & Ciência</td><td>P-309</td><td>Monte nos lados do misturador CIJ (ponto de acesso de vedação da perfuração)</td></tr> <tr><td>Encaixe de saída - CIJ</td><td>Idex Health & Ciência</td><td>P-205</td><td>Monte com ponteira e tubulação na saída da câmara CIJ</td></tr><tr><td>Virola de saída - CIJ</td><td>Idex Health & Ciência</td><td>P-200</td><td>Montar com encaixe de saída (extremidade grande nivelada com tubulação)</td></tr><tr><td>Tubulação de saída - CIJ</td><td>Idex Health & Ciência</td><td>1517</td><td>Use cortador de tubos para extremidades limpas. Certifique-se de que a tubulação extra não entre na câmara de mistura</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-4</td><td>Use THF sem estabilizador para evitar os limites de solubilidade do BHT. Os peróxidos podem interferir em algumas aplicações.</td></tr><tr><td>Seringa de referência padrão (3 ml)</td><td>VWR</td><td>53548-017</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina E (&alfa;-tocoferol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90669-50G-F</td><td>Armazene</td></tr><tr><td>poli(estireno-b-etilenoglicol) frio, PS1.6k-b-PEG5k</td><td>Polymer Source</td><td>P13141-SEO</td><td>Outros tamanhos de bloco aceitáveis dependendo da aplicação</td></tr><tr><td>poli(estireno)1.8k</td><td>Fonte de Polímero</td><td>P2275-S</td><td>Exemplo de material de núcleo hidrofóbico</td></tr><tr><td>Frasco de cintilação</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de plástico Luer-slip, 1ml (100 pk)</td><td>National</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Maltodextrina DE 4-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>419672-100G</td><td></td></tr><tr><td>poli(ácido estireno-b-acrílico), PS5k-b-PAA4.8k</td><td>Fonte de polímero</td><td>P5917-SAA</td><td>Outros tamanhos de bloco aceitáveis dependendo da aplicação</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>Dihdiriato de cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-25G</td><td>Higroscópico.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de clara de ovo de galinha (Ovalbumina, OVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-1G</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Consulte informações suplementares para desenhos de engenharia. Texto de revisão para validação do novo</td></tr><tr><td>mixer Encaixe de tomada - MIVM</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-942</td><td>Combinação com tubulação</td></tr><tr><td>de saída de ponteira - MIVM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Adequado para identificação da ponteira.</td></tr><tr><td>O-ring (MIVM)</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>Encomendar a granel - peça consumível. Garantir a compatibilidade com solventes se estiver a utilizar uma fonte alternativa.</td></tr><tr><td>Suporte para batedeira</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Ver Markwalter & Prud'homme for design.17</td></tr></tbody></table>

flash nanoprecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

A formulação de um composto terapêutico em nanopartículas (NPs) pode lhes conferem propriedades únicas. Para drogas pouco solúveis em água, formulações de NP podem melhorar a biodisponibilidade e modificar a distribuição de drogas dentro do corpo. Para drogas hidrofílicas como peptídeos ou proteínas, encapsulamento dentro NPs também pode fornecer proteção contra os mecanismos naturais de apuramento. Existem algumas técnicas para a produção de polímero NPs que são escaláveis. Flash NanoPrecipitation (FNP) é um processo que usa engenharia mistura geometrias para produzir NPs com distribuições de tamanho estreito e tamanhos ajustáveis entre 30 e 400 nm. Este protocolo fornece instruções sobre a produção em escala laboratorial de nanopartículas poliméricas de núcleo-casca de um tamanho de destino usando a FNP. O protocolo pode ser implementado para encapsular compostos hidrofílicos ou hidrofóbicos, com apenas pequenas modificações. A técnica pode ser facilmente empregada em laboratório em escala miligrama para formulações de tela. Sucessos de chumbo diretamente podem ser escalados a escala grama e quilograma. Como um processo contínuo, escala envolve mais mistura tempo de processo executado em vez de tradução de novos navios de processo. Produzido pela FNP o NPs são altamente carregado com terapêutica, apresentam um pincel denso de polímero estabilizador e têm uma reprodutibilidade de tamanho de ± 6%.

Rastreio de formulações de NP com a FNP é rápido e requer pequenas quantidades de material (da ordem de 1-10 mg). O protocolo FNP para encapsular compostos hidrofóbicos, como vitamina E (etapa 1) resulta em uma dispersão de NP estável, clara ou levemente opalescente. Difusão dinâmica da luz (DLS) fornece um meio robusto para caracterizar o tamanho de partícula. Como mostrado na Figura 3, o processo produz NPs com uma baixa polidispersividade de forma reproduzível. O índice de polidispersividade típico (PDI) é inferior a 0,20, indicando uma população de monodisperso relativamente. O PDI é obtido a partir da função de autocorrelação e geralmente é implementado no software do instrumento. É uma proporção do segundo para o primeiro momento, onde os valores de 0.1 geralmente são obtidos por monodisperso partículas26. Para a vitamina E quatro/PS-b-PEG formulação repetições relatado, o valor foi de 0,12 ± 0,02 e o diâmetro médio foi de 107 ± 7 nm. Um típico "misfire" devido a qualquer depressão desigual das seringas ou velocidade mais lenta de depressão também é relatado na Figura 3. A polidispersividade não foi afetada, mas o tamanho era um pouco maior (135 nm). Incluindo neste exemplo, as novas métricas para tamanho de partícula são 113 ± 14 nm. Uma falha resulta em períodos de tempo, onde a câmara contém apenas um tipo de fluxo único. É importante que o fluxo inteiro experimenta a mesma história de processo e volumes relativas dos fluxos orgânicos e aquosos dentro do misturador. Sem um estabilizador, uma solução opaca com agregados visíveis é produzida. A função de autocorrelação DLS para esta amostra é não-monotônicas e não decadência sem problemas, como visto em baixo-relevo a Figura 3 .
Controle de tamanho de partícula por FNP é demonstrado na Figura 4, onde variando os montantes relativos do material do núcleo – poly(styrene)1,8 k neste caso – e PS -b-PEG estabilizador resultou em tamanhos de partículas que variaram entre 49-152 nm. Estes tamanhos de partículas foram gerados com fluxos THF contendo uma concentração de massa total do núcleo e estabilizador de 20 mg/mL, onde 25%, 50% ou 75% da massa foi o material do núcleo poly(styrene). A polidispersividade das nanopartículas foi sempre inferior a 0,15. Ampla discussão de efeitos de parâmetro no tamanho de partícula, produzido pela FNP pode ser encontrado na literatura10. O carregamento pode ser ajustado mantendo constante do volume de solvente e variando os volumes relativos das soluções estoque núcleo e estabilizador. Da mesma forma, a concentração em massa total pode ser variada através da elaboração de soluções estoque em valores diferentes de 10 mg/mL. Sob certas condições, é possível observar uma população micelle vazio por DLS27. Isto não tem qualquer efeito prejudicial, além de ampliar a distribuição de tamanho de partículas medido. Quando os tamanhos são semelhantes, isto pode manifestar-se como um único pico amplo ao invés de dois picos separados.
O misturador CIJ a mesma também pode ser usado para encapsular compostos hidrófilos por iFNP, como exemplificado na etapa 2 do protocolo. As partículas produzidas na formulação relatada são em torno de 65 nm, com uma baixa polidispersividade de 0,08. A distribuição de tamanho pode ser vista na Figura 5A (linhas tracejadas). O efeito de reticulação os resíduos de ácido carboxílico PAA na estabilidade da partícula é demonstrado pela análise DLS em um solvente forte como DMSO, conforme mostrado na Figura 5B. A função de autocorrelação para partículas bem-quitosana deve começar perto de um valor de 1 e gota agudamente a 0 em um momento característico que está relacionado com o tamanho de partícula (linha contínua). Partículas que incham extensivamente ou dissolvem não são quitosana e mostram sinal mínimo autocorrelação (linha pontilhada). Para iFNP, ensaios falhados se manifestar de maneiras semelhantes conforme descrito por FNP acima. Agregados visíveis podem ser vistos ou forma de função de autocorrelação DLS pobre pode ser observada. O MIVM pode ser usado para a FNP ou iFNP quando mais de dois fluxos de entrada são necessários devido a restrições de sistema, tais como a solubilidade ou incompatibilidade química. Uma versão em escala reduzida do MIVM (o μMIVM), com stand mixer é mostrada na Figura 2. Tal como acontece com a CIJ, este misturador pode ser usado para encapsular compostos hidrofóbico ou hidrofílico22. Na etapa 3, um protocolo para o encapsulamento de uma proteína hidrofílico, óvulos, por iFNP foi descrito. A distribuição de tamanho de partícula é mostrada na Figura 5A (linha contínua). O tamanho é de cerca de 125 nm com um PDI de 0,16. Um protocolo geral para o funcionamento da bomba de seringa em escalas maiores é fornecido na etapa 4.
<img alt="Diagrama de mistura solvente-antissolvente, configuração de têmpera, resulta em ilustração de nanopartículas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: montagem do misturador e fluxo interno padrão esquemas. Misturador de jatos (CIJ) (A) os confinados colide com seringas anexadas está posicionado acima do banho de têmpera. Não imaginava são uma barra de agitação no frasco de banho de têmpera e uma placa de agitação. A geometria de mistura é retratada na visualização expandida mostrando as entradas de fluxo de dois que interfere no centro da câmara. (B) um vórtice de entrada multi mixer (o μMIVM) é mostrada com seringas de vidro e posicionado no stand acima de um banho de retardamento. A placa móvel e o mecânico para ter sido cortado da foto. A vista expandida mostra a câmara de vórtice e os canais de entrada esquematicamente. (C) A representação esquemática do núcleo-casca NPs produzido pela FNP. As esferas vermelhas representam a terapêutica que, combinado com o bloco de polímero recolhido azul, compõem o núcleo de NP. O bloco de polímero amarelo forma a camada de pincel transmitir estabilização estérica para o NPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de configuração do reômetro com componentes rotulados para misturar geometria em testes de materiais." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: μMIVM terminologia e componentes para montagem. O μMIVM requer um stand mixer para permitir uniforme depressão de seringas de quatro. Neste caso, as alturas de êmbolo de seringa todos devem ser uniformes para assegurar uma mistura consistente. Alternativamente pode ser operado usando bombas de seringa. O stand mixer com componentes rotulados é mostrado à esquerda da figura. À direita está o misturador desmontado com o anel-o no lugar do disco mistura de geometria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de intensidade normalizada vs diâmetro NP; inserção de tempo de correlação; resultados da análise de partículas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Distribuição de nanopartículas poliméricas contendo um núcleo de vitamina E de tamanho de partícula e estabilizada por PS -b-PEG. Difusão dinâmica da luz (DLS) fornece distribuições de tamanho de intensidade-tornada mais pesada que indicam a distribuição de diâmetro de NP. As curvas são a média de três vias análises para cada julgamento e tem sido redimensionadas para produzir alturas de pico máximo idêntico. As quatro repetições (linhas sólidas) indicam a alta reprodutibilidade do método (desvio padrão = 7 nm). Também está incluído um falhanço representativo (linha tracejada), tais como a velocidade mais lenta de seringa ou depressão desigual de duas seringas, que resulta em maior diâmetro de partícula. O desvio padrão do tamanho do NP, incluindo a falha de ignição foi 14 nm. (Inserir) Sem o PS -b-PEG estabilizador, formam-se grandes agregados de mícron-escala (ou gotas, no caso de um óleo de vitamina E). A função de autocorrelação DLS de uma corrida sem o estabilizador (linha pontilhada) é mostrada junto com uma representante autocorrelação de nanopartículas idêntico (linha contínua). A função de autocorrelação mostra um número de escalas de tempo característicos para a amostra de controle, indicando uma população polydisperse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Distribuição de tamanho de nanopartículas; gráfico; intensidade normalizada vs diâmetro NP para porcentagens de núcleo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: controle de tamanho de partícula por FNP através de variando relativos rácios do núcleo material para estabilizador. As distribuições de tamanho de intensidade ponderada de três formulações com um núcleo de poly(styrene) estabilizaram por PS -b-PEG são retratados. A concentração em massa total em THF foi de 20 mg/mL e o antisolvent era água. As formulações foram preparadas em um misturador da CIJ. A fração da massa composta de material do núcleo é listada na legenda. Por exemplo, amostra de 25% continha 5 mg/mL poly(styrene) e 15 mg/mL PS -b-PEG. Os tamanhos médios de 25% (linha contínua), 50% (linha tracejada) e cargas de núcleo de 75% (linha de traço misto) foram 49 nm, 96 nm e 152 nm, respectivamente. Todos os valores PDI foram inferiores a 0,15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise do diâmetro NP; gráfico (A), estudo do tempo de correlação; gráfico (B), espalhamento dinâmico de luz." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: caracterização de NPs invertido em um misturador CIJ ou μMIVM. (A) DLS curvas são a média de três vias análises para cada formulação. Linha tracejada indica a distribuição de tamanho de partículas de MD 3 k feita na batedeira CIJ, enquanto a linha sólida é a distribuição de tamanho de partículas de óvulos no μMIVM. (B) a força de reticulação pode ser avaliada por DLS usando DMSO como o diluente. A função de autocorrelação DLS indica a força da reticulação através o valor inicial de autocorrelação e a observação de uma transição perfeita para um valor de zero. Linha tracejada mostra a função de autocorrelação para uma partícula com nenhum agente reticulante mostrando um fraco sinal inicial e um tempo de decaimento amplo. A linha sólida retrata a autocorrelação após a adição de um agente reticulante forte (no caso, tetraetilenopentamina), que mostra um forte sinal inicial e um calendário definido decadência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de supersaturação vs. solvente orgânico; peptídeo B, análise de solubilidade de boscalide, dados científicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: supersaturação, S, em função das relações de mistura relativas de solvente orgânico para água. (A) comparação de maior supersaturação atingível para (○) boscalide, um pesticida e (■) do peptide B, um peptídeo modelo sete-resíduo. O fluxo orgânico contém boscalide em uma concentração de 230 mg/mL e peptídeo B em 200 mg/mL, suas concentrações de saturação. Há uma máxima supersaturação que depende de cada ingrediente farmacêutico ativo (API) / solvente sistema. (B) quando a concentração de boscalide no fluxo orgânico é diminuída 20 vezes, as condições em que são alcançados supersaturação e nanoprecipitation tornar-se limitado. Esta figura é reproduzida com permissão da Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Flash NanoPrecipitation (FNP) é uma abordagem dimensionável para produzir nanopartículas poliméricas de núcleo-casca. Formulações de laboratório-escala para o encapsulamento de hidrofóbico ou hidrofílico terapêuticas são descritas.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

As técnicas de nanoprecipitação flash, ou FNP demonstradas aqui oferecem uma plataforma escalável e simples para encapsular compostos hidrofóbicos ou hidrofílicos dentro de nanopartículas poliméricas. Para clareza, a técnica usada para encapsular biológicos é chamada de nanoprecipitação flash inversa, ou IFNP. Os princípios subjacentes são inalterados, mas a estrutura das nanopartículas resultantes é diferente.Geralmente, novos usuários precisam de prática para operar consistentemente as seringas de entrada ao fazer manualmente pequenos lotes de nanopartículas. Volumes maiores podem ser produzidos com bombas de seringa controladas por computador. Nosso protocolo também fornece detalhes sobre o pós-processamento de soluções de nanopartículas, o que muitas vezes é fundamental para a aplicação bem-sucedida de uma formulação.Antes de iniciar o processo, verifique os encaixes do misturador CIJ e certifique-se de que a tubulação de saída não está amassada. Em seguida, encha duas seringas de borracha luer livres de polipropileno de cinco mililitros com dois a três mililitros de acetona, ou outro solvente de limpeza. Coloque as seringas nos adaptadores de entrada e coloque a montagem sobre um recipiente de resíduos.Deprimi os êmbolos para enviar o solvente através da câmara de mistura ao longo de alguns segundos. Em seguida, remova as seringas e seque a mistura com um fluxo de gás nitrogênio. Em seguida, para começar a preparar o fluxo de entrada solvente, pipeta 0,25 mililitros de uma solução de 10 miligramas por mililitro de vitamina E, em tetrahidrofurano livre de estabilizador, em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro.Em seguida, pipeta 0,25 mililitros de uma solução de 10 miligramas por mililitro de um estabilizador copolímero de bloco em THF no mesmo tubo. Vórtice a mistura por cinco a dez segundos, e depois centrífuga-a a mil G por cinco a dez segundos para recuperar a adesão líquida à tampa. Prepare um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro contendo 0,525 mililitros de água deionizada como anti-solvente.Em seguida, pipeta quatro mililitros de água deionizada em um frasco de cintilação de 20 mililitros para fazer o banho de saciar. Coloque uma pequena barra de mexida no frasco. Coloque a batedeira CIJ limpa sobre o banho de saciar em um rack ou bloco de tubo de ensaio em uma placa de mexida.Comece a mexer o banho de saciar em cerca de 75% da velocidade máxima possível. Em seguida, coloque uma agulha de ponta sem corte em uma seringa de borracha livre de polipropileno de um mililitro, e elabore o anti-solvente. Expulse cuidadosamente bolhas de ar da seringa e, em seguida, remova e descarte a agulha.Ajuste o êmbolo para que o líquido chegue apenas ao fim da seringa. Em seguida, conecte a seringa a uma das entradas do CIJ. Desenhe a mistura de solvente em uma segunda seringa da mesma forma e anexe-a à outra entrada.Para formar as nanopartículas, pressione simultaneamente ambos os êmbolos com um movimento uniforme suave em menos de 0,5 segundos. É fundamental deprimir as seringas rapidamente, uniformemente e suavemente. Você não deve de repente atacar as seringas, mas deve começar o movimento já em contato com os topos das seringas.Em seguida, coloque a batedeira CIJ sobre o recipiente de resíduos, sem remover as seringas para garantir que o volume de ressarcação não escorra para a dispersão. Retire a barra de mexida do frasco de cintilação e tampe-a. Em seguida, remova e descarte as seringas solventes e anti-solventes.Limpe a batedeira antes do próximo teste de nanoprecipitação. Para preparar uma amostra para análise dinâmica de dispersão de luz, pipeta 100 microliters da dispersão em uma cuvette. Adicione 900 microliters de solvente de banho de saciar e misture bem por pipetar antes de iniciar a análise da amostra.Para começar a montar o micro MIVM, coloque o O-ring no disco de geometria de mistura. Alinhe os orifícios no disco de mistura com os pinos no disco superior e encaixe-os juntos, tomando cuidado para não deslocar o o-anel. Solte o encaixe da tubulação de saída no receptor inferior e, em seguida, enrosque os discos conectados no receptor.Coloque uma chave inglesa nos pinos do disco superior e aperte o conjunto. Aperte o encaixe da tubulação de saída para que ele fique firmemente contra a face inferior do disco de geometria de mistura. Certifique-se de que os encaixes da seringa no disco superior estão aconchegantes.Levante a placa móvel no suporte da batedeira para mantê-la fora do caminho, em seguida, coloque a batedeira montada no suporte, com a tubulação de saída roscada através da placa de suporte. Em seguida, coloque um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 5,25 mililitros de clorofórmio como o banho de saciamento sob a tubulação de saída. Em seguida, desenhe 0,75 mililitros de solução A, que é uma solução de cinco miligramas por mililitro de ovalbumina em sulfóxido de dimetil em 10% de água em volume, em um mililitro de gás apertado Luer travar seringa com uma agulha de ponta sem corte.Expulse cuidadosamente bolhas de ar, remova a agulha e forja a solução até o final do encaixe Luer. Conecte a seringa a uma entrada de misturador. Repita este processo com 0,75 mililitros cada uma da solução B, que é de seis miligramas por mililitro de estabilizador copolímero de bloco em DMSO, e solução C, que é THF.Conecte as seringas às entradas da batedeira no sentido horário, em ordem alfabética. Prepare uma seringa apertada de gás de 2,5 mililitros contendo 1,85 mililitros de solução D, que é clorofórmio, e conecte-a à quarta entrada. Confirme que não há diferença significativa nas alturas da seringa.Em seguida, segure cuidadosamente a carcaça de rolamento em cada lado da placa móvel, e lentamente abaixe a placa até que ela mal esteja descansando uniformemente em cima das seringas. Para gerar as nanopartículas, deprimir a placa de forma constante e suave em cerca de 0,5 a um segundo. Em seguida, remova e tampe o tubo de banho.Desmonte e limpe a batedeira quando estiver pronto. Para trabalhar com volumes maiores, carregue as soluções em seringas apertadas a gás e conecte tubos de politefluoroetileno com encaixes Luer às seringas. Prime as soluções para as extremidades da tubulação.Fixar as seringas em bombas de seringa e fixar a tubulação às entradas de batedeiras apropriadas. Coloque um pequeno frasco de resíduos sob a tubulação de saída para coletar o volume da inicialização. Prepare o banho de saciar e mantenha-o por perto.Simultaneamente, inicie as bombas e deixe que cerca de cinco mililitros de efluentes fluam para o frasco de resíduos. Então, comece a coletar as nanopartículas no banho de saciar, como de costume. Uma placa de mexida pode ser usada para misturar o banho de saciar, se desejar.Quatro réplicas de FNP de nanopartículas poliméricas com núcleo hidrofóbico, preparadas na batedeira CIJ, apresentaram alta replicabilidade, e eram relativamente monodispersas, com um diâmetro médio de 107 nanômetros. Um erro representativo da depressão da seringa lenta ou desigual, produziu partículas ligeiramente maiores, enquanto a polidispersidade não foi afetada neste exemplo, erros de fogo podem resultar em distribuições mais polidisperses. A função de auto-correlação DLS decaiu suavemente para uma amostra representativa de nanopartículas poliméricas.Essa decadência suave não foi observada quando a formulação foi tentada sem o estabilizador copolímero do bloco, que produziu gotículas de óleo em escala de míccro. A quantidade relativa de material central para estabilizador controlava o tamanho das partículas, como mostrado aqui, em nanopartículas com um núcleo de poliestireno. O PDI ficou abaixo de 0,15 em cada formulação.Nanopartículas com núcleos hidrofílicos produzidos pela IFNP. Partículas com núcleo maltodextrina, preparadas na batedeira CIJ, tinham cerca de 65 nanômetros de diâmetro, e tinham um IDD de 0,08. As partículas com núcleo ovalbumin preparado no micro MIVM tinham cerca de 125 nanômetros de diâmetro, e tinham um IDB de 0,16.FNP e IFNP são ferramentas poderosas para processar moléculas e nanopartículas. Antes de executar qualquer técnica, certifique-se de considerar as solubilidades de cada componente em todos os solventes, ou misturas de solventes, para garantir alta super saturação durante a mistura. A técnica básica é simples, mas dominar os passos da depressão da seringa requer alguma prática.Se você tiver problemas com isso, considere usar uma configuração de bomba de seringa como a mostrada neste vídeo para melhorar a consistência. Para moléculas hidrofílicas carregadas, ou moléculas com solubilidade intermediária, fNP pode ser combinado com emparelhamento de íons hidrofóbicos para permitir um encapsulamento eficiente. FNP também pode ser usado para encapsular múltiplos compostos no mesmo núcleo de nanopartículas.Consulte o texto e outros recursos da literatura para saber como remover melhor solventes orgânicos das dispersões de nanopartículas na aplicação desejada. Há também uma gama de técnicas para estabilizar nanopartículas durante o armazenamento.

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