Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido
December 19th, 2018
Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.
Assim, este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a capacidade dos ligantes estrogênicos de regular o receptor de estrogênio alfa e os mecanismos dos moduladores seletivos do receptor de estrogênio. A principal vantagem dessa técnica é que é um método simples. Demonstra o receptor de estrogênio dependente do ligagênio alfa, atividade de dimerização de domínio nas células.
Demonstrando o procedimento será Tanner Jefferson, um estudante de pós-doutorado do nosso grupo. Este método usa três plasmídeos diferentes para detectar a atividade de dimerização de domínio de ligação do receptor de estrogênio nas células. pG5-Luc é o repórter de luciferase plasmid para detectar a eficácia da atividade de dimerização.
pBIND mouse estrogen receptor alpha EF é um fator de transcrição galactose-responsivo fator de transcrição GAL4 DNA vinculando-se a um principal mouse fundido estrogen alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmid que se liga ao elemento responsivo GAL4 no repórter pG5-Luc. pACT mouse estrogen receptor alpha EF é um vírus herpes simplex transativando proteína segmento VP16 ativação domínio fundido mouse estrogen receptor alfa ligante e expressão de domínio de ligação plasmid que não se liga diretamente ao repórter pG5-Luc. Quando o ligante adequado está presente, as proteínas derivadas do receptor de estrogênio do rato pBIND alfa EF e do receptor de estrogênio do rato pACT alfa EF plasmids se ligam através do domínio de ligação de ligas de ligação alfa do receptor de estrogênio.
A eficiência da dimerização é determinada pela atividade da luciferase. O passo mais importante é controlar a atividade do receptor de estrogênio alfa EF do rato pBIND. A atividade do receptor de estrogênio derivado do pBIND, o domínio alfa ligante alfa em cada ligante sem o receptor de estrogênio pACT alfa EF plasmid deve ser avaliado antes de analisar a atividade de dimerização do domínio de ligação do receptor de estrogênio dependente do ligante dependente do ligante.
Comece adicionando as combinações plasmidas apropriadas em dois tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro por combinação. Prepare as duas combinações da mistura de DNA. O primeiro tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos pACT vazios.
O segundo tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos EF do receptor pACT-estrogen. Para precipitar o DNA, adicione 1/9 do volume de mistura de DNA de três acetatos de sódio molar e um volume de acetato de sódio molar de 20X de 100% etanol à mistura de DNA em cada tubo e vórtice dos tubos. Armazene as misturas a 20 graus Celsius durante a noite antes de centrifugar em velocidade máxima na manhã seguinte.
Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas invisíveis em 120 microliters de 75% de etanol por tubo, tomando o cuidado de enxaguar qualquer DNA preso ao interior dos tubos. Após uma segunda centrifugação sob as mesmas condições, descarte os sobrenantes e seque o DNA em um concentrador de vácuo por 30 minutos. Para a transfecção, lave as células hepatocelulares hepatocelulares preparadas duas vezes com 0,5 mililitros de PBS de temperatura ambiente por poço por lavagem e alimente as células com 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado com soro bovino fetal inativado de 10% de carvão e dois milimolar de L-glutamina.
Em seguida, suspenda a mistura de DNA plasmídeo seco e reagente de transfecção no volume apropriado de DMEM por número de poços em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um volume igual de médio reagente de transfecção a cada tubo de mistura de DNA plasmídeo suspenso pelo DMEM. Após uma incubação de cinco a dez minutos à temperatura ambiente, adicione 25 microliters de mistura de DNA aos poços experimentais apropriados da placa de cultura celular hepatocelular de 24 poços humanos para uma transfecção de seis horas na incubadora de cultura celular.
E o fim da incubação, substitua o meio de transfecção por 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado por FBS inativado por 10%carvão, dois milimolas L-glutamina, 1%de estreptomicina de penicilina e ligadura por poço e retornar as células à incubadora de cultura celular por mais 16 a 18 horas. Na manhã seguinte, lave as células com um mililitro de PBS por poço e conecte as células de cada poço com 100 microliters de tampão de lise passiva por poço e agitação vigorosa com um misturador de vórtice. Em seguida, congele as células lísatos em nitrogênio líquido.
No dia do ensaio de dupla luciferase, agite os lises em um shaker até que a placa atinja a temperatura ambiente, e transfira 10 microliters de lise para poços individuais de uma placa de plástico branca de 96 poços. Em seguida, leia a atividade luciferase de cada amostra de lisato celular em um leitor de microplacão. O tratamento do receptor de estrogênio pBIND alfa EF e pACT plasmids células transfectadas com 10 nanomolares estradiol estimula a atividade da luciferase, pois o domínio de ligação de ligantes alfa do receptor de estrogênio contém o domínio funcional de transativação dependente de ligante, AF-2.
No entanto, 1 e 10 concentrações de nanomolar, induzem a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrogen pBIND e pACT, sugerindo a viabilidade deste procedimento para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e de estrogen em até um nanomolar de tratamento estradiol. O tratamento com 4-hidroxifeno-tamoxifeno não provoca atividade luciferase no receptor de estrogênio do camundongo pBIND alfa EF e células transfetóides plasmidas pACT, sugerindo que a função AF-2 do receptor de estrogênio alfa não é ativada por este ligante. No entanto, até 10 concentrações de nanomolar, induz a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrógeno pBIND e pACT, sugerindo que este procedimento é viável para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e estrógeno em até 10 nanomolar de tratamento 4-hidroxi-tamoxifen.
A atividade da combinação de pBIND e pACT mouse estrogen receptor alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmídeos com 4-hidroxi-tamoxifen é significativamente maior do que a combinação de pBIND e pACT receptor humano de ligantes alfa ligante de expressão de domínio de ligação plasmídeos. Isso indica que a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato é mais potente do que o domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano. Além disso, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato contendo um domínio F humano é significativamente menor do que a do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do tipo selvagem.
Em contraste, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano contendo um domínio F do mouse é significativamente maior do que a do tipo selvagem do receptor de estrogênio humano domínio de ligação alfa. Isso sugere que o domínio F tem uma influência na atividade de homodimerização do receptor alfa de 4-hidroxifen-tamoxifen dependente da espécie. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de testar a atividade basal do domínio de ligação de DNA GAL4 fundiu o receptor de estrogênio alfa ligante alfa com o seu ligante.
Essa atividade deve ser a mesma que o tratamento do veículo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para analisar a atividade de dimerização do domínio de ligação ao ligante do receptor de estrogênio alfa usando o ensaio de dois híbridos em mamíferos. Esta técnica é projetada para investigar como ligantes estrogênicos regulam o receptor de estrogênio alfa e os mecanismos dos moduladores seletivos do receptor de estrogênio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Biologia Celular
Fundamentos
- O receptor de estrogênio alfa desempenha um papel crucial em vários processos biológicos.
- Entender a dimerização dependente de ligante é essencial para o desenvolvimento de medicamentos.
- Os moduladores seletivos do receptor de estrogênio têm potencial terapêutico.
- Os métodos atuais para estudar essas interações podem ser complexos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método simples para analisar a dimerização do receptor de estrogênio alfa.
- Melhorar a compreensão das interações de ligantes com receptores de estrogênio.
- Facilitar a pesquisa sobre moduladores seletivos do receptor de estrogênio.
Métodos Utilizados
- Ensaio de dois híbridos em mamíferos
- Uso de três plasmídeos para detectar atividade de dimerização
- Plasmídeo reporter pG5-Luc luciferase para detecção de eficácia
- Ensaios baseados em células para demonstrar atividade dependente de ligante
Principais Resultados
- O método demonstra efetivamente a atividade de dimerização nas células.
- Os resultados indicam a influência de ligantes estrogênicos no comportamento do receptor.
- Os dados apoiam a utilidade do ensaio para pesquisas adicionais.
- O procedimento é direto e reproduzível.
Conclusões
- Este método simplifica a análise das interações do receptor de estrogênio.
- Ele fornece insights sobre os mecanismos dos moduladores seletivos do receptor de estrogênio.
- A abordagem pode ser aplicada em vários contextos de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma teams to evaluate ligand-dependent dimerization of estrogen receptor alpha, a key target in endocrine therapy development. By quantifying species-specific differences in ligand-induced homodimerization, it supports target validation and mechanistic de-risking for selective estrogen receptor modulators. The assay provides a cell-based readout that informs early discovery decisions on ligand efficacy and mechanism of action.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring ligand-dependent receptor dimerization as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Enables comparison of ligand efficacy across species or isoforms to clarify target mechanism and de-risk translational assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing ligand-dependent dimerization as a quantitative assay endpoint.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through controlled plasmid transfection and luciferase readout in mammalian cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing ligand effects in human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells, a model relevant to liver metabolism and endocrine disruption.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation by providing a mechanistic assay that can be replicated across cell types and ligand concentrations.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for nuclear receptor modulators where dimerization is a mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced dimerization activity, a key step in clarifying estrogen receptor alpha mechanism.
- Screening: Delivers assay readiness through luciferase-based quantification of dimerization efficiency, enabling compound evaluation in a reproducible format.
- Analytics: Provides quantitative readouts (luciferase activity) that allow comparison of ligand effects across conditions, supporting data-driven prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by testing ligand effects in mammalian cells, informing mechanism-based advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying selective estrogen receptor modulators across multiple ligand series and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around ligand-receptor interactions.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined plasmid transfection and luciferase assay workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic data on ligand efficacy, reducing late-stage biological risk in endocrine therapy programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dimerization activity, supporting capital-efficient advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mammalian cell transfection, and luciferase reporter assays.
- Dependent on transfection efficiency and luciferase detection instrumentation in a cell culture facility.
- Necessitates standardization across teams for plasmid preparation, ligand dosing, and lysis procedures to ensure reproducibility.
- Must account for cell-type-specific differences in basal activity and ligand response when adapting the model system.
- Limited by the need to control for basal receptor activity, as agonistic ligands can elevate background signals and obscure dimerization-specific readouts.
