Name: Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a analisar a dimerização do domínio ligante do receptor de estrogênio alfa usando o ensaio de dois híbridos em mamíferos. Este método simples permite estudar moduladores seletivos do receptor de estrogênio em células.

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Os autores agradecer Sueyoshi DRS e Wang no nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) por sua leitura crítica do manuscrito e Tanner Jefferson para realizar procedimentos no vídeo. Este trabalho foi apoiado pela 1ZIAES070065 de institutos nacionais de saúde Grant (para K.S.K) da divisão de pesquisa Intramural do NIEHS.

1. preparação de plasmídeos para o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido
<ol><li>Use os seguintes plasmídeos: pG5-Luc, pBIND-ERαEF e ERαEF-pacto. Nota: Os plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação, em autores e são enviados em papel de filtro. pG5-Luc é o plasmídeo do repórter que contém cinco repetições de GAL4 elementos responsivos fundiram-se com a unidade de expressão do luciferase (Figura 1A). pBIND-ERαEF é o plasmídeo de expressão de proteínas para proteínas GAL4DBD-fundida ERα LBD. pBIND-ERαEF contém uma unidade de expressão Renilla luciferase para normalizar a eficiência de transfeccao (Figura 1B). Pacto-ERαEF é o plasmídeo de expressão de proteínas para as proteínas VP16AD-fundida ERα LBD (Figura 1C). O diagrama da estrutura de proteínas expressas desde o plasmídeo é mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Prepare o DNAs plasmideo.<ol>
<li>Cortar a área do plasmídeo-carregado do papel com uma tesoura limpa e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL. Use luvas e usar uma pinça limpa para pegar o jornal do plasmídeo-carregado. Adicione 100 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8.0) e vórtice bem.</li>
		<li>Adicionar 1 µ l da solução de DNA de plasmídeo da etapa 1.2.1 para competentes de Escherichia coli eritrócitos (ver Tabela de materiais) e mantenha o tubo no gelo por 15 min.</li>
		<li>Células competentes de calor-choque o plasmídeo-adicionado; Incubar os tubos em banho de água a 42 ° C por 30 s e, em seguida, mantê-los no gelo por 2 min.</li>
		<li>Adicione 250 µ l de caldo super ideal com meio de repressão (SOC) catabolite (temperatura ambiente) para os tubos e cultura com agitação a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Placa de 100 µ l da culta E. coli em um prato de caldo de carne (LB) de Luria escaldado com 100 µ g/mL ampicilina (prato de 10 cm de diâmetro) e cultura a 37 ° C durante a noite.</li>
		<li>Escolher uma colônia da placa e adicioná-lo em um tubo de 14 mL contendo 2 mL de caldo fantástico (TB) com ampicilina 100 de µ g/mL. Cultura com agitação a 37 ° C até o meio sumida está nublado.</li>
		<li>Adicione 1 mL do meio de cultura de passo 1.2.6 para um balão de vidro esterilizada 250 mL contendo 50 mL de TB com ampicilina 100 de µ g/mL. Cultura com agitação a 37 ° C durante 20-24 h.</li>
		<li>Transferi o culto Escherichia coli para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar 3.450 x g em temperatura ambiente por 30 min usando o rotor de balanço-balde. Descarte o meio. Salvar a pelota de Escherichia coli a-80 ° C.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de solução de ressuspensão de célula (ver Tabela de materiais) para a e. coli da pelota e suspendê-lo completamente. Adicionar 3 mL de solução de lise celular (ver Tabela de materiais), mistura o tubo suavemente por inversão-10x e mantê-lo no gelo por 5 min (manter o tempo pontual). Adicionar 6 mL de solução de neutralização (ver Tabela de materiais), misturar o tubo firmemente com a batida e em seguida, mantê-lo no gelo por 10 min.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 3.450 x g a 4 ˚ c por 30 min usando o rotor de balanço-balde. Transferir a solução contendo DNA para um novo tubo cónico de 50 mL e adicionar 10 mL de resina de purificação de DNA (ver Tabela de materiais). Suspenda a resina suavemente.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 625 x g por 1 min usando o rotor de balanço-balde. Descartar a solução e manter a resina na parte inferior.</li>
		<li>Adicionar 15 mL da solução de lavagem de coluna (acetato de potássio 80 mM, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA e 55% de etanol) para tubo cónico de 50ml e agitar suavemente para suspender a resina. Repita a etapa 1.2.11. Nota: A solução de lavagem da coluna deve ser preparada usando pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-Tratado de água ou água livre de nuclease.</li>
		<li>Adicionar 5 mL da solução de lavagem da coluna com o tubo cónico de 50 mL e suspender a resina com uma pipeta de 5 mL. Aplique a resina à coluna (consulte Tabela de materiais) que é definido em um tubo de vácuo. Vácuo a coluna até que a resina seque. Adicione 6 mL de solução de lavagem de coluna para a coluna e o vácuo.</li>
		<li>Uma vez que a resina seca visualmente, retire o reservatório da coluna. Transfira a seção inferior da coluna (resina) para um tubo de 1,5 mL. Centrifugue a coluna na velocidade máxima por 2 min usando microcentrifuga secar a resina.</li>
		<li>Transferi a seção inferior da coluna (resina) para um novo tubo de 1,5 mL. Adicionar 300 µ l de água nuclease-livre para a coluna e esperar até que a resina toda encharcada.</li>
		<li>Centrifugue a coluna na velocidade máxima durante 1 min coletar o plasmídeo de DNA contendo solução (200-250 µ l).</li>
		<li>Trate a solução que contém ADN com fenol-clorofórmio (1:1), depois com clorofórmio como segue.<ol>
<li>Adicionar o mesmo volume de fenol-clorofórmio (1:1) para a solução que contém ADN (200-250 µ l), agite bem e centrifugar a velocidade máxima durante 2 min usando microcentrifuga. Recolher a camada superior (solução contendo DNA) e adicioná-lo para um novo tubo de 1,5 mL. Repita este passo 1x.</li>
			<li>Adicione o mesmo volume de clorofórmio à solução contendo DNA (200-250 µ l), agitar bem, centrifugar a velocidade máxima por 1 min. pegue a camada superior (solução contendo DNA) e adicioná-lo para um tubo de 1,5 mL. Nota: Endotoxinas (lipopolissacarídeo) induz a sinalização celular em algumas células. Para evitar tais efeitos imprevisíveis, etapa 1.2.17 é recomendada, que pode reduzir a contaminação de endotoxinas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Precipitar o plasmídeo de DNA utilizando a técnica de precipitação do etanol como segue.<ol>
<li>Adicionar 1/9 do volume de mistura de DNA de acetato de sódio 3M (pH 5,5) e 20 x do volume de acetato de sódio 3M de 100% de etanol à solução contendo DNA. Por exemplo, adicione 27,8 µ l de acetato de sódio 3M e 278 µ l de etanol 100% a 250 µ l da solução de DNA (o volume final é 555.8 µ l).</li>
			<li>Manter a solução a-80 ° C durante 20 minutos pelo menos. Centrifugar a velocidade máxima por 20 min no 4 ˚ c. Descartar a solução e manter a pelota. Adicionar 200 µ l de etanol 75% e lave o interior do tubo. Centrifugar por 20 min a 4 ° C, descartar a solução e manter a pelota. Seca o sedimento de DNA usando um concentrador a vácuo.</li>
			<li>Adicione 100-250 µ l de tampão TE (pH 8.0) para o tubo. Dissolver o sedimento de DNA e verificar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm. Manter a concentração de DNA em torno de 0,5 mg/mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mamífero ensaio do dois-híbrido
<ol><li>Manter as células.<ol>
<li>Cultura de células de HepG2 de carcinoma hepatocelular humano em um 750 mL, frasco de cultura de tecidos de2 175 cm com a mídia essencial mínimo livre de vermelho de fenol (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; inactivadas pelo calor), 2 mM L-glutamina e 1% solução de penicilina-estreptomicina (antibióticos) para manter as células.</li>
		<li>Cultura de células em um 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C até que as células são aproximadamente 90% de Confluencia. Nota: Para reduzir a atividade estrogênica fundo, vermelho de fenol-livre médio deve ser usado para todos os experimentos M2H. Esta etapa deve ser executada dentro de uma câmara de segurança limpa banco biológico. As células devem ser mantidas a cultura de pilha mamífera geral protocolo7a seguir.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare as células para transfeccao. Nota: As seguintes etapas processuais devem ser realizadas dentro da câmara de segurança limpa banco biológico. As células são cultivadas/incubadas em um 5% CO2-incubadora de 37 ° C completados, nesta etapa de cada vez.<ol>
<li>Replate confluentes a 90%, para as placas de 24 poços; Enxagúe as células 1 x com tampão fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Adicionar 7 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para o frasco de cultura e Embeba as células para 1-2 min, mantendo o frasco de cultura em uma bancada limpa, à temperatura ambiente. Remover uma parte da solução do trypsin-EDTA e deixar 1 a 2 mL da solução no frasco de cultura. Incube o frasco de cultura na incubadora para 1-2 min.</li>
		<li>Bata o fundo do frasco para separar as células e verificar as células sob o microscópio. Nota: Se as células ainda estão conectadas para o balão, incubar durante mais 1-2 minutos e, em seguida, repita a etapa 2.2.3.</li>
		<li>Suspender as células em vermelho de fenol-livre MEM suplementado com 10% 1% solução de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e carvão vegetal-despojado FBS (inactivadas pelo calor). Nota: Carvão vegetal-despojado FBS deve ser utilizado para reduzir o efeito do estrógeno endógeno derivado de soro.</li>
		<li>Contar o número de células e células em uma placa de 24 em uma densidade de 1,2 x 105 células/poço de sementes. Atribua três poços para cada ponto de dados (três vias).</li>
		<li>Cultura que das células durante a noite. Vá para a etapa 2.4.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare uma mistura de ADN para transfeccao. Nota: O seguinte plasmídeo DNAs são transfectadas em um poço: 100 ng de pG5-Luc repórter do, 50 ng do plasmídeo de expressão de proteínas da fusão GAL4DBD (pBIND) e 50 ng do plasmídeo de expressão de proteínas da fusão VP16AD (Pacto).<ol>
<li>Para analisar a atividade de dimerização do ligante-dependentes ERα LBD, prepare as combinações a seguir (Figura 3). Combinação (i): pG5-Luc pBIND-hERαEF Pacto e pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + pacto. Combinação (ii): pG5-Luc pBIND-hERαEF pacto-hERαEF e pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + mERαEF-pacto. Combinação (iii): pG5-Luc pBIND pacto-hERαEF e pG5-Luc + pBIND + + pacto-mERαEF. Nota: Combinação (i) representa o nível basal de experimental de humano ERα LBD e mouse ERα LBD, respectivamente. Se o resultado mostra um nível extremamente elevado com ligante sozinho, esse método é inviável para uso com o ligante (por exemplo, dietilestilbestrol [DES]). Combinação (ii) representa os níveis de humano dimerized ERα LBD e mouse dimerized ERα LBD, respectivamente. Combinação (iii) representa controles negativos; Use este conjunto apenas quando a experiência é realizada pela primeira vez avaliar o nível de fundo do sistema.</li>
		<li>Antes de misturar, calcular o total de quantidade de DNA necessária com base no número de poços para transfeccao. Para experimentos conduzidos em triplica e em dados de cinco pontos, misturar o plasmídeo seguir DNAs em tubos de dois 1,5 µ l para combinações (i) e (ii): pG5-Luc, 5 (pontos de dados) x 3 (poços) x 100 ng = 1.500 ng (15 µ l); pBIND-mERαEF, 5 (pontos de dados) x 3 (poços) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l); Pacto (para combinação i) ou pacto-mERαEF (para combinação ii), 5 (pontos de dados) x 3 (poços) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l). Nota: A concentração de cada solução de DNA de plasmídeo é de 0,1 µ g / µ l.</li>
		<li>Precipitar a mistura de DNA utilizando a técnica de precipitação de etanol. Adicionar 1/9 do volume de mistura de DNA de acetato de sódio 3M (pH 5,5) e 20 x do volume de acetato de sódio 3M de 100% de etanol à mistura do DNA. Em seguida, o vórtice do tubo. Nota: por exemplo, adicione 3,4 µ l de acetato de sódio 3M e 34 µ l de etanol 100% para os 30 µ l de mistura de DNA de plasmídeo exemplificada na etapa 2.3.2. Essa etapa ajuda a manter uma condição de transfeccao invariável, e não é necessário executar esta etapa em uma câmara de segurança biológica.</li>
		<li>Manter a mistura durante a noite a-20 ° C. Centrifugar, a velocidade máxima por 20 min a 4 ° C. Descarte a solução (a pelota é invisível). Adicionar 120 µ l de etanol a 75% para o tubo; em seguida, lave o interior do tubo. Centrifugar por 20 min a 4 ° C. Descartar a solução e seque a mistura de DNA usando um concentrador a vácuo durante 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute o transfection. Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em uma bancada limpa ou uma câmara de segurança biológica.<ol>
<li>Na manhã seguinte, lave as células semeadas em uma placa de 24 (da etapa 2.2.6) 2x com 0,5 mL de PBS (temperatura ambiente).</li>
		<li>Adicione carvão quente (37 ° C) fresco livre de vermelho de fenol MEM suplementado com 10%-despojado FBS (inactivadas pelo calor) e 2 mM L-glutamina sem antibióticos a cada poço (média de 0,5 mL/poço). Manter as células em um 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Suspenda a mistura de DNA de plasmídeo secas (da etapa 2.3.4) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) (sem soro, vermelho de fenol-livre, sem glutamina; 13 µ l/poço). Calcule as quantidades de DMEM do número de poços para transfeccao. Nota: 15 poços para combinação de (i) x µ l 13 = 195 µ l e 15 poços para combinação (ii) x µ l 13 = 195 µ l.</li>
		<li>Suspender o reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais; 1,5 µ l/poço) em DMEM (12,5 µ l/poço) em outro tubo de 1,5 mL. Calcule a quantidade de reagente de transfeccao e DMEM do número de poços para transfeccao. Nota: 30 [15 poços para combinação] (i) e 15 poços para combinação (ii) x 1,5 µ l de reagente de transfeccao + 30 x 12,5 µ l de DMEM = 420 µ l.</li>
		<li>Adicione uma quantidade igual do meio de reagente de transfeccao (da etapa 2.4.4) para cada tubo (da etapa 2.4.3). Incube os tubos por 5-10 min à temperatura ambiente. Nota: 200 µ l de meio de reagente de transfeccao + 195 µ l de combinação mistura de DNA (i) = 395 µ l e 200 µ l de meio de reagente de transfeccao + 195 µ l de combinação mistura de DNA (ii) = 395 µ l. É importante adicionar um igual volume de meio de reagente de Transfeccao para os tubos de combinação (i) e (ii). Não é necessário usar o meio nesta etapa.</li>
		<li>Adicione a mistura combinada (da etapa 2.4.5) a cada poço (25 µ l/poço) da placa de 24 poços (da etapa 2.4.2) e incube as celulas para 6 h no 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Remova a placa de 24 o transfeccao. Adicionar carvão quente (37 ° C) fresco livre de vermelho de fenol MEM suplementado com 10%-despojado FBS (inactivadas pelo calor), 2 mM L-glutamina, solução de 1% penicilina-estreptomicina e ligante (suspendido em etanol) (média de 0,5 mL/poço). Cultura de células para 16-18 h no 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Colheita das amostras.<ol>
<li>Enxagúe as células com 1 mL de PBS e, em seguida, adicionar 100 µ l de tampão de Lise passiva 1x (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Agite vigorosamente as placas de 24 poços com um misturador do vortex para separar as células.</li>
		<li>Congelar as placas (lisados celulares) 1x por nitrogênio líquido ou salvá-los a-80 ° C, antes da análise. Imediatamente antes do ensaio, agite vigorosamente as placas num agitador até que estejam à temperatura ambiente. Nota: Este processo impede irregularmente aparecendo valores anômalos de atividade de luciferase.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize um ensaio de dual-luciferase.<ol>
<li>Preparar os reagentes para o sistema dual-luciferase ensaio (ver Tabela de materiais).<ol>
<li>Para fazer o tampão de substrato (LAS) do ensaio de luciferase, adicione todos os buffer de ensaio do luciferase no substrato de ensaio de luciferase que está em um frasco de vidro marrom. Salvar o buffer de LAS a-20 ° C. Nota: O buffer de LAS deve ser aquecido à temperatura ambiente antes do uso.</li>
			<li>Para fazer o buffer de substrato (RLS) Renilla luciferase, misture Renilla luciferase substrato e buffer de Renilla luciferase na proporção de 01:50. Faça RLS frescos de buffer para cada ensaio e usar um tubo preto ou um tubo sombreado por papel alumínio. Calcule a quantidade de buffer de RLS, fazendo uma nova reserva. Nota: O buffer RLS deve ser aquecido à temperatura ambiente antes do uso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Defina os reagentes no leitor de microplacas.<ol>
<li>Lavagem a injeção linhas 2x com etanol a 70%; em seguida, lave as linhas 2 x com água. Nota: Isto é importante para evitar perturbar os resultados do ensaio.</li>
			<li>Conjunto as LAS do buffer para o P-injector linha (primeira injeção) e definir o buffer RLS para a linha M-injector (segunda injeção). Não misture esses buffers. Buffer de RLS inibe a atividade do luciferase.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplicam-se 10 µ l de amostras colhidas (da etapa 2.5.3) para a placa de plástico branca de 96 poços.</li>
		<li>Aplique as seguintes configurações para o leitor de microplacas. Para o P-injector, usar um volume de 50 µ l, um atraso de 2 s e uma velocidade de 50 µ l/s. Para o M-injector, usar um volume de 50 µ l, um atraso de 2 s e uma velocidade de 50 µ l/s. definir um tempo de integração do conjunto s. 15 a temperatura a 25 ° C.</li>
		<li>Execute o leitor de microplacas.</li>
		<li>Registrar os valores da atividade do luciferase (IPValue) e os valores da atividade do luciferase Renilla (IMValue) usando o programa de aquisição de dados (consulte a Tabela de materiais).</li>
		<li>Lave as linhas de injeção após a coleta de dados (consulte a etapa 2.6.2.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar análise de dados.<ol>
<li>Use os valores normalizados (IPValue/IMValue) para análise de dados.</li>
		<li>Defina o valor normalizado de combinação (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pacto] com veículo (ligante de 0 nM) como 1 para o cálculo do nível basal e o homodimerized ERα LBD nível. Os níveis são representados como "Actividade relativa".</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de M2H, incidindo sobre as condições de ensaio para a detecção da atividade de homodimerization de ERα LBD como um exemplo. Em geral, o ensaio M2H não é popular para a avaliação da atividade de dimerização ERα LBD ligand-dependente. Isto é devido a ERα LBD possuindo uma função de ativação transcricional; perturba a atividade dos quais, em alguns casos, os resultados do ensaio M2H. No entanto, como demonstramos aqui, o ensaio M2H pode ser usado para analisar a atividade de dimer...

Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência de aminoácidos ERα é altamente conservada entre as espécies. Por causa da maior homologia entre humanos e mouse ERα, a função destes receptores é pensada como idêntico, e a atividade diferencial de substâncias estrogênicas (por exemplo, tamoxifeno) dessas espécies é causada por diferenças da espécie em metabolismos químicos em vez das diferenças estruturais de ERα. ERα tem altamente conservadas estruturas de domínio que são comuns entre a superfamília do receptor nuclear (NR), designada aos domínios de F. E domínio ou domínio ligand-ligando (LBD) inclui o bolso de vinculação de ligante e a função de ativação transcricional 2, chamado de AF-2. O domínio de F é localizado imediatamente adjacente ao domínio E e é o domínio mais variável entre as NRs. Mesmo entre humanos e mouse ERα, a homologia do domínio de F é significativamente menor do que a outros domínios1. O limite a ligante LBD de ERα aumenta a homodimerization da proteína ERα para vincular o elemento específico de DNA hormona-responsivo diretamente para regular a transcrição do gene do ligante-dependentes (ação clássica de ERα). Cristalográficos estudos revelaram o diferencial de posicionamento da hélice 12 (domínio do núcleo do AF-2) com estradiol (E2) - ou 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) - limite LBD dímeros2,3. O domínio ERα F (45 aminoácidos) conectar diretamente a hélice 12. No entanto, não há nenhuma informação sobre o efeito desta extensão de 45 aminoácidos (domínio de F) da hélice 12 sobre a dimerização ERα LBD. Neste estudo, demonstramos a contribuição do domínio de F para a espécie 4OHT-dependente ERα LBD homodimerization usando um mamífero dois-híbrido (M2H) ensaio.
O ensaio de M2H é um método para demonstrar as interações da proteína-proteína em células de mamíferos introduzindo os DNAs plasmideo diferentes três: dois plasmídeos de expressão de proteínas, que expressam a fusão de domínio (DBD) GAL4 DNA-ligando ERα LBD e VP16AD fusão ERα LBD, e um Plasmídeo do repórter do luciferase fundido GAL4RE expressão. Quando a fusão GAL4DBD ERα LBD e a fusão de VP16AD ERα LBD interagem (fazer um dímero) nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa a expressão do gene do luciferase através da função de transactivation VP16AD-dependente. O nível de homodimerization LBD pode ser avaliado pela atividade do luciferase.
O ensaio da dois-híbrido de levedura (Y2H) é um método alternativo baseado no mesmo princípio que usa fermento como o ambiente de host. Usando o sistema de Y2H de relatórios anteriores demonstraram que F-domínio-truncada humana ERα LBD aumenta o recrutamento de coactivator E2-dependente, concluindo que o domínio de F impede a transcrição mediada por E24. Esse resultado é incompatível com outros relatórios que demonstraram a atividade transcricional atenuada do F-domínio-truncada ERα humana no pilhas mamíferas5,6. Recentemente, nosso estudo, utilizando o sistema M2H, demonstrou que a atividade de recrutamento coactivator E2 dependentes de humanos ERα LBD é diminuída por truncamento de domínio F em células de mamíferos e é consistente com a atividade de transcrição1. Estas observações sugerem que o papel fisiológico da interação da proteína-proteína difere em uma maneira de tipo específico de célula e contexto. O ensaio M2H pode demonstrar a atividade de interação da proteína-proteína no mesmo contexto celular que é usado para determinar a atividade transcricional. Isso fornece uma vantagem do ensaio M2H comparado com o Y2H ou outras análises de interação em vitro da proteína-proteína.
Continua a haver perguntas sobre os mecanismos moleculares da atividade agonista parcial de moduladores de receptor seletivo de estrogênio (SERMs) (por exemplo, 4OHT) para regular a transcrição mediada por ERα. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar o mecanismo da atividade agonista parcial de SERMs em vários tipos de células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>pG5-Luc</td><td>Promega</td><td>E249A</td><td>Componente do Sistema de Dois Híbridos de Mamíferos CheckMate</td></tr><tr><td>pBIND</td><td>Promega</td><td>E245A</td><td>Componente do Sistema de Dois Híbridos de Mamíferos CheckMate</td></tr><tr><td>pACT</td><td>Promega</td><td>E246A</td><td>Componente do Sistema de Dois Híbridos de Mamíferos CheckMate</td></tr> One <tr><td>Shot TOP10 E. coli Quimicamente Competente</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga</td><td>SORVALL</td><td>75006445</td><td></td></tr><tr><td>Baldes de giro</td> Solução de ressuspensão <td>de células de 75006441</td><td></td><td>SORVALL</td></tr><tr><td>(CRA)</td><td>Solução de</td> lise de células Promega <td>A7112</td><td></td></tr><tr><td>(CLA)</td>Solução de neutralização <td>Promega</td><td>A7122</td><td></td></tr><tr><td>(NSA)</td>Solução de lavagem de coluna <td>Promega</td><td>A7131</td><td></td></tr><tr><td>(CWB)</td><td>Promega</td><td>A8102</td><td></td></tr><tr><td>Resina de Purificação de DNA Wizard Midipreps</td><td>Promega</td><td>A7701</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midicolumns</td><td>Promega</td><td>A7651</td><td></td></tr><tr><td>MEM, sem glutamina, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td>Carvão inativado por calor</td></tr><tr><td>:dextran stripping soro fetal bovino</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-119</td><td>DMEM inativado por calor</td></tr><tr><td>, glicose alta, sem glutamina, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>para transfecção</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Passive Lysis 5X Buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla</td><td>Promega</td><td>E1980</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax L leitor de microplacas</td><td>Dispositivos moleculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro Software</td><td>Dispositivos moleculares</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência da proteína ERα é altamente conservada entre as espécies. Acredita-se que a função de humanos e mouse ERαs é idêntico. Vamos demonstrar o efeito diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) no mouse e ERα ligação ligante domínio (LBD) dimerização atividade humana usando o mamíferas dois-híbrido (M2H) ensaio. O ensaio de M2H pode demonstrar a eficiência da atividade homodimerization LBD em células de mamíferos, utilizando o transfection de plasmídeos de expressão duas proteínas (GAL4 DNA-ligando domínio [DBD] fusão LBD e VP16 transactivation domínio [VP16AD] fusão LBD) e um O elemento GAL4-responsivos (GAL4RE) fundido plasmídeo do repórter do luciferase. Quando a fusão GAL4DBD LBD e a fusão de VP16AD LBD fazem um dímero nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa uma expressão de gene do luciferase através da atividade de transcrição dependente de VP16AD. A ativação do luciferase mediada por 4OHT é maior nas células HepG2 que foram transfectadas com plasmídeos de expressão de proteínas de fusão da LBD ERα o rato do que em ERα LBD fusão proteína expressão plasmídeo transfectada células humanas. Este resultado sugere que a eficácia do mouse 4OHT-dependente da atividade de homodimerization ERα LBD é superior a humana ERα LBD. Em geral, a utilização do ensaio M2H não é ideal para a avaliação da actividade de dimerização do receptor nuclear LBD, porque ligantes agonísticos melhorar o nível basal da atividade LBD e que impede a detecção de atividade de dimerização LBD. Encontramos que essa 4OHT não aumentar a atividade basal ERα LBD. Isso é um fator chave para ser capaz de determinar e detectar a atividade de dimerização LBD 4OHT-dependente para com êxito usando o ensaio de M2H. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar a atividade agonista parcial de moduladores de receptor de estrogênio seletivo (por exemplo, 4OHT) em vários tipos de células de mamíferos.

Figura 3 exibe o esquema de respostas possíveis na combinação (i) e células de combinação (ii) do plasmídeo-transfectadas. Os resultados experimentais são mostrados na Figura 4. A atividade de combinação (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pacto) mostra a estimulação por 10 nM E2(Figura 4),porque o ERα LBD contém o domínio funcional dependente de ligante transactivation, AF-2. Agonista (<e...

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Assim, este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a capacidade dos ligantes estrogênicos de regular o receptor de estrogênio alfa e os mecanismos dos moduladores seletivos do receptor de estrogênio. A principal vantagem dessa técnica é que é um método simples. Demonstra o receptor de estrogênio dependente do ligagênio alfa, atividade de dimerização de domínio nas células.Demonstrando o procedimento será Tanner Jefferson, um estudante de pós-doutorado do nosso grupo. Este método usa três plasmídeos diferentes para detectar a atividade de dimerização de domínio de ligação do receptor de estrogênio nas células. pG5-Luc é o repórter de luciferase plasmid para detectar a eficácia da atividade de dimerização.pBIND mouse estrogen receptor alpha EF é um fator de transcrição galactose-responsivo fator de transcrição GAL4 DNA vinculando-se a um principal mouse fundido estrogen alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmid que se liga ao elemento responsivo GAL4 no repórter pG5-Luc. pACT mouse estrogen receptor alpha EF é um vírus herpes simplex transativando proteína segmento VP16 ativação domínio fundido mouse estrogen receptor alfa ligante e expressão de domínio de ligação plasmid que não se liga diretamente ao repórter pG5-Luc. Quando o ligante adequado está presente, as proteínas derivadas do receptor de estrogênio do rato pBIND alfa EF e do receptor de estrogênio do rato pACT alfa EF plasmids se ligam através do domínio de ligação de ligas de ligação alfa do receptor de estrogênio.A eficiência da dimerização é determinada pela atividade da luciferase. O passo mais importante é controlar a atividade do receptor de estrogênio alfa EF do rato pBIND. A atividade do receptor de estrogênio derivado do pBIND, o domínio alfa ligante alfa em cada ligante sem o receptor de estrogênio pACT alfa EF plasmid deve ser avaliado antes de analisar a atividade de dimerização do domínio de ligação do receptor de estrogênio dependente do ligante dependente do ligante.Comece adicionando as combinações plasmidas apropriadas em dois tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro por combinação. Prepare as duas combinações da mistura de DNA. O primeiro tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos pACT vazios.O segundo tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos EF do receptor pACT-estrogen. Para precipitar o DNA, adicione 1/9 do volume de mistura de DNA de três acetatos de sódio molar e um volume de acetato de sódio molar de 20X de 100% etanol à mistura de DNA em cada tubo e vórtice dos tubos. Armazene as misturas a 20 graus Celsius durante a noite antes de centrifugar em velocidade máxima na manhã seguinte.Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas invisíveis em 120 microliters de 75% de etanol por tubo, tomando o cuidado de enxaguar qualquer DNA preso ao interior dos tubos. Após uma segunda centrifugação sob as mesmas condições, descarte os sobrenantes e seque o DNA em um concentrador de vácuo por 30 minutos. Para a transfecção, lave as células hepatocelulares hepatocelulares preparadas duas vezes com 0,5 mililitros de PBS de temperatura ambiente por poço por lavagem e alimente as células com 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado com soro bovino fetal inativado de 10% de carvão e dois milimolar de L-glutamina.Em seguida, suspenda a mistura de DNA plasmídeo seco e reagente de transfecção no volume apropriado de DMEM por número de poços em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um volume igual de médio reagente de transfecção a cada tubo de mistura de DNA plasmídeo suspenso pelo DMEM. Após uma incubação de cinco a dez minutos à temperatura ambiente, adicione 25 microliters de mistura de DNA aos poços experimentais apropriados da placa de cultura celular hepatocelular de 24 poços humanos para uma transfecção de seis horas na incubadora de cultura celular.E o fim da incubação, substitua o meio de transfecção por 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado por FBS inativado por 10%carvão, dois milimolas L-glutamina, 1%de estreptomicina de penicilina e ligadura por poço e retornar as células à incubadora de cultura celular por mais 16 a 18 horas. Na manhã seguinte, lave as células com um mililitro de PBS por poço e conecte as células de cada poço com 100 microliters de tampão de lise passiva por poço e agitação vigorosa com um misturador de vórtice. Em seguida, congele as células lísatos em nitrogênio líquido.No dia do ensaio de dupla luciferase, agite os lises em um shaker até que a placa atinja a temperatura ambiente, e transfira 10 microliters de lise para poços individuais de uma placa de plástico branca de 96 poços. Em seguida, leia a atividade luciferase de cada amostra de lisato celular em um leitor de microplacão. O tratamento do receptor de estrogênio pBIND alfa EF e pACT plasmids células transfectadas com 10 nanomolares estradiol estimula a atividade da luciferase, pois o domínio de ligação de ligantes alfa do receptor de estrogênio contém o domínio funcional de transativação dependente de ligante, AF-2.No entanto, 1 e 10 concentrações de nanomolar, induzem a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrogen pBIND e pACT, sugerindo a viabilidade deste procedimento para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e de estrogen em até um nanomolar de tratamento estradiol. O tratamento com 4-hidroxifeno-tamoxifeno não provoca atividade luciferase no receptor de estrogênio do camundongo pBIND alfa EF e células transfetóides plasmidas pACT, sugerindo que a função AF-2 do receptor de estrogênio alfa não é ativada por este ligante. No entanto, até 10 concentrações de nanomolar, induz a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrógeno pBIND e pACT, sugerindo que este procedimento é viável para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e estrógeno em até 10 nanomolar de tratamento 4-hidroxi-tamoxifen.A atividade da combinação de pBIND e pACT mouse estrogen receptor alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmídeos com 4-hidroxi-tamoxifen é significativamente maior do que a combinação de pBIND e pACT receptor humano de ligantes alfa ligante de expressão de domínio de ligação plasmídeos. Isso indica que a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato é mais potente do que o domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano. Além disso, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato contendo um domínio F humano é significativamente menor do que a do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do tipo selvagem.Em contraste, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano contendo um domínio F do mouse é significativamente maior do que a do tipo selvagem do receptor de estrogênio humano domínio de ligação alfa. Isso sugere que o domínio F tem uma influência na atividade de homodimerização do receptor alfa de 4-hidroxifen-tamoxifen dependente da espécie. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de testar a atividade basal do domínio de ligação de DNA GAL4 fundiu o receptor de estrogênio alfa ligante alfa com o seu ligante.Essa atividade deve ser a mesma que o tratamento do veículo.

detecting-ligand-binding-domain-dimerization-activity-estrogen

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Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido (Vídeo) | JoVE Journal

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

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