Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Este método pode ajudar a entender questões-chave no campo de migração de células imunes, como como o citoesqueleto envia forças de cisalhamento e como ligantes integrin e quimiocinas afetam a migração induzida pelo fluxo de leucócitos. A principal vantagem dessa técnica é que é um novo tipo de ensaio migratório que é fácil para iniciantes realizarem. Ele usa apenas equipamentos e reagentes disponíveis comercialmente, bem como software livre.

Embora este método possa fornecer informações sobre células marginais da zona B, ele também pode ser aplicado a outras células imunes, como células T ativadas. No dia anterior ao experimento, descongele uma alíquota do ICAM-1, e dilui-o na PBS para uma concentração final de cinco microgramas por mililitro. Em seguida, adicione 30 microliters de ICAM-1 às câmaras desejadas de um slide de fluxo.

Coloque o slide em uma câmara úmida, e coloque-o a quatro graus Celsius para incubar durante a noite. No dia seguinte, lave a câmara adicionando 100 microliters de PBS a um poço e, em seguida, retirando 100 microliters do outro poço da câmara. Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de bloqueio a uma câmara e incubar o slide em uma câmara úmida à temperatura ambiente por 90 minutos.

Em seguida, lave a câmara adicionando 100 microliters de PBS a um poço, retirando-a do outro poço, e, em seguida, adicione 100 microliters de tampão de migração à câmara. O slide está pronto para usar. Guarde-o em uma câmara úmida à temperatura ambiente até o experimento.

Primeiro, conecte uma bomba de fluido e conecte a unidade fluidica. Em seguida, ligue o software da bomba. Em seguida, lave a tubulação uma vez com cinco a dez mililitros de tampão de migração.

Isso vai levar cerca de um minuto. Em seguida, adicione 11,7 mililitros de tampão de migração igualmente aos dois reservatórios e remova as bolhas de ar. Agora, aperte a tubulação cerca de 10 centímetros da peça do conector, e coloque a unidade fluida na câmara de incubação aquecida no microscópio.

No software, defina a opção slide para micro-slide VI 0.4 e a opção de tubulação para branco. Além disso, defina o estresse de tesoura desejado para cerca de quatro dynes por centímetro quadrado e o tempo de imagem para 30 minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo desejada e o estresse da cisalhamento inserindo os valores no software da bomba.

Em seguida, pré-aqueça a câmara de incubação de microscópio, a unidade fluidica e as alíquotas de buffer de migração a 37 graus Celsius. Uma vez quente, teste a bomba fluida, garantindo que o tampão migratório flua para frente e para trás nos reservatórios e que não haja bolhas de ar no sistema. Primeiro, isole os leucócitos e purifique as células marginais da zona B, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Em seguida, limpe a parte inferior do slide com um tecido umedecido com etanol. Adicione 30 microliters da suspensão celular em um poço da câmara e retire 30 microliters do buffer de migração armazenado do outro poço. Cubra o slide e incuba-o por 30 minutos para permitir que as células se conectem.

Em seguida, adicione lentamente o buffer de migração pré-aquecido a cada poço do slide até que um menisco positivo saia do poço. Remova as bolhas de ar com a ponta da pipeta. É importante manter a consistência com fatores que afetam a adesão celular, por isso mantenha os buffers e as células a 37 graus, e evite usar força excessiva ao canalizar o tampão para dentro da câmara.

Aperte o slide até o estágio do microscópio e remova o lado não marcado da tubulação fluida da peça do conector. Em seguida, encha o final da tubulação com tampão de migração até que um menisco positivo sem bolhas de ar saia do final. Vire a extremidade da tubulação e insira-a no poço superior da câmara de fluxo.

Mantendo a tubulação presa, repita o procedimento para a extremidade marcada da tubulação. Agora, mude o sistema de imagem para o modo Live e selecione um campo de visão que está no meio do slide. Aqui, defina o foco nas células e, em seguida, desfoque ligeiramente para melhorar o contorno preto das células e produzir um interior branco.

O fundo preto e o centro branco serão mais fáceis de usar no programa de rastreamento automatizado. Configure o programa de sequência de imagens para gravar uma imagem a cada cinco segundos durante 30 minutos usando um objetivo seco de 10x. Então, comece a gravar.

Retire o grampo da tubulação e ligue a bomba. Isso fará com que as células não aderentes se lavem e as células aderentes comecem a migrar. No final do programa de imagem, rotule e salve o filme.

Se usar um inibidor ou um modificador da migração celular, ele pode ser adicionado às células da suspensão celular antes de colocá-las no slide ou no tampão de migração na unidade fluidica. Para iniciar a análise automática da faixa de migração, abra o programa ImageJ. Copie o arquivo MTrack2_kt Java para a pasta ImageJ Plugins.

No menu Plugins, selecione Compilar e Executar. Em seguida, reinicie ImageJ e o plugin deve aparecer no menu Plugins. Abra a pilha de imagens do filme de migração celular no ImageJ, e processe as imagens como mostrado aqui, a fim de converter o vídeo de quadros de cores em imagens de alto contraste mostrando as células como objetos pretos em um fundo branco.

Em seguida, afie as imagens duas vezes, despeckle as imagens e, em seguida, converta as imagens em oito bits. No menu Imagem, vá para o submenu Ajustar brilho/contraste e coloque o controle deslizante Contraste em contraste máximo. Isso fará com que as células apareçam como objetos brancos em um fundo preto.

Em seguida, volte ao submenu Ajuste limiar para garantir que as células apareçam como objetos pretos em um fundo branco. Agora, execute o plugin automático de rastreamento de células MTrack2 kt. Na tela de opções, defina o tamanho da partícula mínimo para um pixel e o tamanho da partícula máximo para 30 pixels.

Defina o valor de velocidade para 10 pixels, embora as células da zona B marginal geralmente não excedam dois pixels em quadros sucessivos que têm cinco segundos de diferença. As faixas de celular estão agora prontas para análise usando a Ferramenta ibidi Chemotaxis. Esses dois campos mostram os caminhos de migração de células marginais da zona B que foram semeadas em slides revestidos de ICAM-1.

As células foram rastreadas automaticamente com o MTrack2 usando os métodos descritos neste artigo. À esquerda, as células eram imagens sob condições estáticas, e nas células direitas eram expostas a um fluxo de cisalhamento de quatro dynes por centímetro quadrado. As faixas de células individuais podem ser importadas para a Ferramenta ibidi Chemotaxis para gerar plots de faixa de cada filme.

Aqui, as faixas de células individuais são coloridas de vermelho para indicar que eles terminaram rio abaixo de seu ponto de origem ou preto se eles acabaram rio acima. A análise de faixas celulares de quatro filmes individuais para fluxo e nenhuma condição de fluxo é mostrada aqui. Isso inclui o índice médio de migração direcional, velocidade celular, retidão do caminho e a distância final em linha reta para ambas as condições.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imaginar a migração direcional das células da zona B marginal em direção ao fluxo de cisalhamento e como rastrear automaticamente as células. Durante esse procedimento, outros métodos como a microscopia DE TIRF podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como o citoesqueleto e os integrins respondem ao estresse da cisalhamento?