Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Para melhorar a compreensão da vinculação fator de transcrição-DNA, desenvolvemos um método para medir as constantes de dissociação em larga escala usando, por exemplo, medidas de anisotropia. Esta técnica permite obter curvas de titulação automaticamente completas para determinar a constante de dissociação com alta sensibilidade. Trabalha em solução em equilíbrio, tem rendimento moderado e grande alcance dinâmico.

Aplicamos o HiP-FA para refinar o cenário de afinidade vinculante dos fatores de transcrição. No entanto, o protocolo poderia ser aplicado a outros tipos de eventos vinculantes, como interações proteína-proteína ou proteína-drogas, por exemplo. Aconselho primeiro a realizar múltiplas titulações com os mesmos parceiros de ligação para obter uma estimativa sobre a reprodutibilidade das medidas.

Se disponível, use um sistema automatizado para uma redutibilidade ainda melhor. Para recompor os oligômeros de DNA do DNA de referência, misture sete microlitadores de cada dez milimões di-rotulados para a frente e fios reversos sem rótulo em um tubo. Para o DNA concorrente, misture 20 microlitadores de cada 100 mililitros sem rótulo em dois poços de uma placa PCR de 96 poços.

Em seguida, use uma máquina PCR padrão para aquecer as soluções de DNA a 70 graus Celsius durante os três minutos. Em seguida, reduza a temperatura ambiente à taxa de 0,1 graus Celsius por segundo. Use um forno micro-ondas para derreter 0,5 gramas em 100 mililitros de tampão de ligação.

Adicione água destilada dupla para ajustar o volume final para compensar a possível evaporação. Prepare 10 mililitros de estoque. Para preparar os poços de titulação e calibração de uma placa de 96 poços, transfira duas alíquotas de caldo de gel para um shaker de incubadora de 75 graus Celsius.

Para cada poço de titulação, adicione 1,4 nanomoles de DNA de referência, proteína fator transcrição, em uma concentração final de 20-60 nanomoles, 0,2 mililitro DTT, e o tampão de ligação a 240 microliters do gel derretido. Misture bem invertendo e sacudindo o tubo. Em seguida, pipeta lentamente 200 microliters por poço do gel contendo DNA nos poços de titulação designados de uma placa de 96 poços.

Para cada bem calibração, adicione 5 nanomoles de corante azul do nilo a 240 microliters do gel derretido. Evitando bolhas de ar, lentamente pipeta 200 microliters da solução de gel contendo corante em cinco a seis poços da placa de 96 poços. Coloque o gel em uma superfície perfeitamente horizontal e incubar por dez minutos em temperatura ambiente, e mais 10 minutos a 4 graus Celsius.

Use um leitor de placas multi-bem para verificar a homogeneidade dos níveis de altura do gel em diferentes poços da placa. Para preparar a solução de DNA concorrente, primeiro combine o DNA de referência rotulado, a proteína e o tampão de ligação concentrado três vezes. Em seguida, misture 20 microliters da solução com 40 microliters de cada uma das soluções de DNA concorrentes.

Para cada poço de calibração, combine as quantidades apropriadas de uma das soluções de DNA concorrentes annealed e o buffer de ligação concentrado três vezes contendo 15 milimolares de solução de corante azul do nilo. Por fim, adicione 50 microliters das soluções concorrentes mistas em cima dos géis o mais simultaneamente possível. Para começar a aquisição de imagens, coloque a placa 96 bem no estágio do microscópio.

Em seguida, tome uma série de imagens de pilha de Z de poços até a completa desvinculação da proteína do DNA de referência. Realize o ensaio de titulação de acordo com o manuscrito. Em seguida, use o software HiP-FA para criar curvas de titulação para sequências individuais de concorrentes.

Em seguida, clique no botão de exportação para obter a constante de dissociação e concentração da proteína ativa em cada poço de titulação. Tome cuidado especial ao pipetar as soluções de gel que são viscosas. A pipetação imprecisa pode diminuir a precisão para a determinação das constantes de dissociação.

Neste estudo, o método HiP-FA é aplicado para determinar as preferências de vinculação de DNA de um fator de transcrição com zíper B. Gigante, da rede de genes de segmentação de moscas. A alta semelhança dos PWM's para réplicas que foram preparadas manualmente ou usando técnicas de automação demonstrou a alta reprodutibilidade do método HiP-FA.

A PWM é obtida por este método e outros métodos são globais semelhantes. No entanto, desvios significativos podem ser vistos nas posições dois e sete do motivo central onde mutações podem levar a perda completa de ligação, ou ligação muito mais forte do que as medidas anteriores. Usamos o HiP-FA para gerar refinamentos para as vinculações de dezenas de fatores de transcrição e isso mostra que obtém no final uma melhor previsão de dados.

Acreditamos que sua medida de alta precisão pode ser muito útil para entender melhor a ligação TF-DNA para todo o sistema ou para todos os tipos de interações.