Name: Gene-terapia inspirou Polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de Origami de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda uma técnica de revestimento com policações para proteger nanoestruturas de DNA origami contra degradação enzimática. O método utiliza quitosana e PEI linear para aumentar a estabilidade e facilitar aplicações terapêuticas.

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Este projeto recebeu financiamento da Horizonte 2020 investigação e inovação programa do União Europeia sob concessão acordo n. º 686647. TEM imagens foram gravadas em um Morgagni operado em 80 kV na instalação de EM de Viena Biocenter núcleo instalações GmbH (VBCF). Gostaríamos de agradecer Tadija Kekic para obter assistência na concepção gráfica e Elisa De LIano para projetar o nanostructure de wireframe.

1. preparar a solução de estoque Polycation
<ol><li>Solução LPEI<ol>
<li>Adicionar 10 mg de LPEI em um copo de vidro que contém &lt; 10 mL de H2O.</li>
		<li>Para dissolver completamente LPEI, adicione HCl (32%) até atingir pH 2,0.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7,0 pela adição de NaOH (10 M).</li>
		<li>Ajuste o volume para a concentração final de 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtra a solução estoque de LPEI através de uma membrana de 0,22 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução-mãe de quitosana<ol>
<li>Dissolver 16,6 mg de lactato de chitosan oligosaccharide (Mw ~ 5 kDa, composição de oligossacarídeo de 60%, deacetiladas de quitina em 90%) em 1 mL de ácido acético (10%) meios aquosos para preparar uma solução com uma concentração de 10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificação de DNA Origami nanoestruturas
<ol><li>Mix 100 µ l da amostra de origami do DNA (em 5 mM Tris, EDTA 1 mM, 5 mM NaCl buffer (denotado como TB) incluindo 18 mM MgCl2) com o volume equivalente de 22 mM MgCl2 suplementado TB (100 µ l) em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de tampão de purificação (15% (p/v) 8.000 PEG, 5 mM Tris, 1 mM EDTA e 505 mM NaCl). Misture suavemente por inversão do tubo.</li>
	<li>Gire a amostra a 16.000 × g, à temperatura ambiente (r.t.) por 25 min.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em buffer de 16 mM MgCl2 suplementado TB. Sobrenadante e a pelota contêm fibras descontínuas em excesso e origami de DNA precipitado, respectivamente.</li>
	<li>Incube a amostra para um dia de cada r.t. a 650 rpm em um thermomixer. Esta etapa é para ressuspensão completa de origami de DNA.</li>
</ol>3. eletroforese em Gel de Agarose (idade)
<ol><li>Adicione 1,6 g de agarose e 80 mL de tampão de x TAE 0,5 (20 mM Tris, 0.5 mM EDTA, ácido acético de 10 mM, pH 8) num copo de vidro para preparar um gel de agarose 2%. Microondas por 5 min. Agite o conteúdo do copo para 1 min em um banho de água. Adicione 352 μL de MgCl2 (2,5 M), para preparar o gel com 11 mM MgCl2. Pre-manche o gel com 10 µ l de mancha de gel de DNA.</li>
	<li>Despeje a solução de gel em uma caixa de gel seco e inserir um pente da electroforese do gel. Deixe a solução solidificar no r.t. por 15-30 min.</li>
	<li>Complementar o execução buffer (0,5 x tampão TAE) com 11 mM MgCl2.</li>
	<li>Misturar 10 a 20 µ l da amostra com 20% de 6x do tampão de carregamento (30% (v/v) glicerol, 0,25% (p/v) de bromofenol, 0,25% (p/v) xileno cianol FF) e carregá-lo em poços de gel de agarose.</li>
	<li>Funcione o gel em 70 V no r.t. para 2,5 - 3 h.</li>
	<li>Visualize o gel com um detector de UV.</li>
</ol>4. negativo mancha microscopia eletrônica de transmissão (nsTEM)
<ol><li>Aplica 5 µ l do nanostructure diluído ou o polyplex em uma grade de Cu400 TEM carbono revestido brilho-alta. Deixe absorver por ca. 1 min.</li>
	<li>Escorra o excesso de líquido da borda da grade por um pedaço de papel de filtro.</li>
	<li>Aplicar 5 µ l de solução aquosa de acetato de uranilo um 2% e aguardar 1 min.</li>
	<li>Use a borda do papel de filtro para drenar completamente o excesso de líquido da borda da grade.</li>
	<li>Deixe a grade secar completamente antes de injetá-lo na temperatura.</li>
</ol>5. Polyplex formação
Nota: Exemplo ilustrativo para a preparação de um polyplex compreendendo origami de DNA e quitosana em rácios N/P 0,01-8.
<ol><li>Calcule o número de aminas por polycation usando a fórmula-1 (tabela 1).</li>
	<li>Medir a concentração de origami de DNA purificado utilizando um espectrofotômetro ultra violeta em 260 nm. Use 2 µ l de tampão TB como o espaço em branco para calibrar o aparelho. Calcular o "nmol de fosfato" usando a fórmula-2.</li>
	<li>Prepare-se 15 µ l da estrutura ADN origami, incluindo 1 nmol de fosfato.</li>
	<li>Use a Fórmula-3 para calcular o volume de quitosana, que é necessário para preparar o polyplex no N/P 0,01-8. Por exemplo, para preparar o polyplex em 8 N/P, 1,8 µ l de quitosana (0,8 mg/mL) é necessária (N/P é 8, nmol de fosfato é 1, o peso molecular da quitosana é 5.000 g/mol, a concentração da solução-mãe de quitosana é 0,8 mg/mL e o número de aminas por quitosana é 28). Adicione 13,2 µ l de TB a 1,8 µ l de quitosana (0,8 mg/mL). Adicione 15 µ l de solução de quitosana (0,8 mg/mL) a 15 µ l do origami DNA da etapa 5.3 para obter um ADN origami-quitosana polyplex com 8 NP. O polyplex é formado espontaneamente.</li>
	<li>Repita o passo 5.4 para preparar os polyplexes em diferentes proporções de N/P.</li>
	<li>Execute uma idade conforme descrito no passo 3 (figura 1A). Inclua o origami de DNA nu como controle.</li>
	<li>Imagem o polyplex conforme descrito na etapa 4 (Figura 2). Fórmula-1) número de grupos amina por polycation <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg"> Fórmula-2) mol de fosfato =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg"> Fórmula-3) Volume (µ l) de polycations =<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg">
</li>
</ol>6. desencapsulamento com sulfato de dextrano
<ol><li>Calcule o número de grupos sulfato por sulfato de dextrano, usando a fórmula-4 (tabela 2).</li>
	<li>Calcular o volume de sulfato de dextrano, necessário para a decomplexation do polyplex em um predefinidos A relação P usando fórmula-5. O A / P carga ratio é a proporção entre os grupos sulfato do polyanion (A) para os grupos fosfato (P) do origami DNA. Uma quantidade adicional de sulfato de dextrano é necessária para uma eficiente decomplexation dos polyplexes (por exemplo, 500-1.000). Por exemplo, para decomplex o polyplex preparado na secção 5 (polyplex contém 1 nmol de fosfato) na / P 1.000, 3,6 µ l de dextrano sulfato 40 kDa (50 mg/mL) é necessária (A / P é 1.000, nmol de fosfato é 1, o peso molecular do sulfato de dextrano é 40.000 g/mol a concentração da solução estoque de sulfato de dextrano é 50 mg/mL e número de sulfato 220). Adicionem o polyplex da etapa 5.4 3,6 µ l de sulfato de dextrano (50 mg/mL) e misture bem.</li>
	<li>Se trabalhar com uma quitosana polyplex, adicione NaOH para facilitar o processo de decomplexation. Adicione NaOH para uma concentração final de 10 mM. Ignore este passo para os polyplexes LPEI.</li>
	<li>Execute uma idade conforme descrito no passo 3 (figura 1B). Inclua um origami de DNA nu e polyplex como controle. Fórmula-4) número de grupos sulfato por polyanion = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg"> Fórmula-5) Volume (µ l) de sulfato de dextrano =<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg">
</li>
</ol>7. a estabilidade no sentido de depleção de Mg
<ol><li>Lave 20 µ l de um origami de DNA ou o polyplex correspondente (incluindo 2 nmol fosfato) com 4 x 600 µ l de tampão de Mg-zero (5 mM Tris, EDTA de 1 mM e 30 mM de NaCl) usando a coluna de ultrafiltração (MWCO ~ 3 kDa). Gire a cada lavagem a 14.000 g × no r.t. para 3-5 min.</li>
	<li>Coletar o restante da solução (80 µ l) e incubar a 37 ° C por um dia a 650 rpm em um thermomixer.</li>
	<li>Se testes LPEI polyplex, adicione 2,5 μL de MgCl2 (500 mM) para uma concentração final de 16 mM MgCl2. Em seguida, adicione 7 µ l de dextrano sulfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente a um / 1.000 P) para desvendar o núcleo DNA nanoestruturas (desencapsulamento, consulte a etapa 6). Nota: Ignore esta etapa se trabalhando com quitosana polyplex ou nu origami de DNA.</li>
	<li>Siga nsTEM imagem conforme descrito na etapa 3 (Figura 2).</li>
</ol>8. DNase eu ensaio de titulação de nanoestruturas de Origami de DNA nua
<ol><li>Tubos de DNase eu de buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5mm CaCl2, pH 7,6), 1 µ l de MgCl2 (250 mM), 12 µ l de água em 0,2 mL PCR Mix 3 µ l de nu origami de DNA, incluindo 1 nmol fosfato com 2 µ l de 10x. Adicionar 2 µ l de DNase eu (10x). Ajustar a concentração das ações do DNase eu (10x) para chegar a final DNase concentrações de 0,25-2 U/mL.</li>
	<li>Incube as amostras a 37 ° C, durante 1-2 h em um thermocycler.</li>
	<li>Mergulhe as amostras no gelo e desativar a atividade de antípodas, adicionando 2 µ l de 500mm ditiotreitol (DTT) e 2,5 µ l de EGTA (33 milímetros).</li>
	<li>Analise as amostras usando uma idade conforme descrito na etapa 3.</li>
</ol>9. estabilidade de Polyplexes para DNase eu
<ol><li>Mix 4 µ l de uma polyplex (incluindo 1 nmol de fosfato, preparado em diferentes proporções de N/P) com 1,5 µ l de uma DNase eu tampão (10x), 8 µ l de TB e 1,5 µ l de DNase I (100 U/mL) em um 0,2 mL do PCR do tubo.</li>
	<li>Incube a amostra por 24 h a 37 ° C em um thermocycler.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de proteinase K (20 mg/mL) para digerir o DNase I. incube durante 30 min a 37 ° C em um thermocycler. Nota: em vez de digestão enzimática, desativação química de DNase I por adicionando 1,5 μL de TDT (500 mM) e 2 µ l de EGTA (33 mM) podem ser executada.</li>
	<li>Adicione 3,6 µ l de dextrano sulfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente a um / 1.000 P) para desvendar o núcleo nanoestruturas de DNA.</li>
	<li>Execute a idade conforme descrito na etapa 3 (Figura 3A, Figura 3). Inclua o origami de DNA fresco como controle para medir e comparar as intensidades de banda no gel.</li>
	<li>Impostos especiais de consumo da banda sobre a idade e o origami de DNA por um aperto congelar a coluna de extração baseada no protocolo fornecido pelo fornecedor de extrato.</li>
	<li>Siga nsTEM imagem conforme descrito na etapa 4 (Figura 2).</li>
</ol>10. estabilidade no sentido de soro Fetal bovino (FBS)
<ol><li>Tubos de FBS em 0,2 mL PCR Mix 4 µ l de origami de DNA nu ou seu correspondente polyplex (incluindo 1 nmol de fosfato) com 17 µ l de TB + 10%. Use FBS recém descongelado.</li>
	<li>Incube a amostra em 37 ˚ c em um termociclador por 24 h.</li>
	<li>Mergulhe a amostra em banho de gelo.</li>
	<li>Se testando o polyplex, execute o processo de desencapsulamento adicionando 3,6 µ l de dextrano sulfato-40 kDa (50 mg/mL). Além disso, adicionar NaOH se trabalhando com quitosana polyplexes (consulte a etapa 6.3)</li>
	<li>Execute uma idade conforme descrito na etapa 3. Inclua o origami de DNA fresco como controle para medir e comparar as intensidades de banda no gel.</li>
	<li>Impostos especiais de consumo da banda sobre a idade e extrair o origami de DNA por uma coluna de extração de congelamento de aperto.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de proteinase K (20 mg/mL) para a extraído DNA origami solução (20 µ l) em um tubo PCR de 0,2 mL. Incube durante 30 min a 37 ° C em um thermocycler para digerir proteínas de soro ligadas para as nanoestruturas.</li>
	<li>Lavar a amostra com 5 x 500 µ l de TB, incluindo 16 mM MgCl2 usando a coluna de ultracentrifugação (MWCO ~ 100 kDa) para lavar proteinase K (MW ~ kDa 28,9) afastado. Gire a cada lavagem a 14.000 g × no r.t. para 3-5 min.</li>
	<li>Execute nsTEM imagem como descrito na etapa 4 (Figura 3). Nota: A amostra extraída de gel da etapa 10.6 pode ser usada diretamente para a imagem latente de nsTEM. No entanto, a imagem pode ser muito desafiador devido a ligação de proteínas de soro para as ADN origami nanoestruturas. Portanto, recomenda-se tratamento de proteinase K (etapas 10,7-10,9), para facilitar o processo de geração de imagens.</li>
</ol>11. testando a capacidade de endereçamento da enzima Peroxidase de rábano (HRP)-acrescida de DNA Origami com revestimento com Polycations
<ol><li>Purifica o Self montado biotinilado-NR (biotina-NR) conforme descrito na etapa 2.</li>
	<li>Incubar a 200 µ l de biotina-NR purificado (36 nM, em 16mm suplementado tampão TB) com 200 µ l de conjugado HRP streptavidin (540 nM, em buffer TB). Adicione 4,8 µ l de MgCl2 (500 mM) para uma concentração final de 14 mM. Incubar a r.t. para 12 h a 650 rpm em um thermomixer</li>
	<li>Purifica HRP-acrescida NR (HRP-NR) por um método de purificação de PEG (conforme descrito na etapa 2) para remover as enzimas HRP desacopladas. Ressuspender o precipitado HRP-NR em TB, incluindo 16 mM MgCl2.</li>
	<li>µ L 6.5 mix de HRP-NR purificado (36 nM) com 6,5 µ l de polycations das concentrações variantes para preparar o polyplex em rácios de N/P de 1, 2, 4, 10 e 20 (usando a Fórmula 3).</li>
	<li>Repita as etapas 11.2-11,4 para não-biotinilado NR. Como a enzima HRP pode bind não especìfica para o origami de DNA, o origami de DNA não-biotinilado, que é tratada com enzimas HRP e PEG purificado (semelhante a biotina-NR), servirá como o controle no ensaio.</li>
	<li>Mix de 6,5 µ l de água destilada com 6,5 µ l de polycations de variantes concentrações correspondentes para os rácios definidos de N/P de 1, 2, 4, 10 e 20. Amostras de teses servem como o grupo em branco.</li>
	<li>Adicionar a solução preparada em etapas 11.4-11,6 (12,5 µ l) de uma placa de 96 poços, incluindo 72.5 µ l de tampão HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, NaCl, de 200 mM 0,05% pH de Triton X-100, 1% DMSO, 7,4) e misture bem.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).</li>
	<li>Adicione 5 µ l de H2O2 (12 mM) e misture bem pipetando para cima e para baixo. H2O2 inicia a reação.</li>
	<li>Medir a absorvância a 421 nm mais 4 h com um leitor de placa multimodo (Figura 4A).</li>
</ol>12. teste a capacidade de endereçamento de Aptamers de ligação de hemina (HBA)-acrescida de DNA Origami com revestimento com Polycations
<ol><li>Purifica o HBA acrescida-NR (HBA-NR) conforme descrito na etapa 2. Ressuspender o precipitado HBA-NR em TB suplementado com 6 mM MgCl2 (maior concentração de sal leva para a agregação de HBA-NR).</li>
	<li>Mix 10 µ l de HBA-NR (40 nM) com 10 µ l de polycations, na concentração variando de preparar polyplex dos rácios definidos de N/P de 1, 2, 10 e 20.</li>
	<li>Mix 10 µ l de nu-NR (40 nM) ou água destilada com 10 µ l de polycations em diferentes concentrações correspondentes a rácios N/P de 1, 2, 10 e 20.</li>
	<li>Adicionar a solução de 20 µ l preparado de passos 12.2 e 12.3 à placa de 96 poços, incluindo 60 µ l de tampão HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, NaCl, de 200 mM 0,05% pH de Triton X-100, 1% DMSO, 7,4) e misture bem. Incluem pelo menos uma amostra em branco, substituindo a solução de 20 µ l polyplex ou polycation (a partir de etapas 12.2 e 12.3) com água.</li>
	<li>Adicione 5 µ l de hemina (0,04 mM) seguido de 10 µ l de ATBS (15 mM). Coloque a placa em um agitador orbital por 5 min.</li>
	<li>Adicione 5 µ l de H2O2 (12 mM) e misture bem pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Medir a absorvância a 421 nmover 30 min com o leitor multimodo (Figura 4B).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse relacionados a este relatório.

Na auto-montagem de origami de DNA, as fibras descontínuas são normalmente adicionadas em relação de excesso de 5-10 para o cadafalso. Estas vertentes descontínuas em excesso também ligam para os polycation e forma os polyplexes na faixa de monometer que são mais difíceis de ser separado do ADN origami polyplexes. Daí, um passo fundamental na formação de polyplex é remover as fibras descontínuas em excesso e usar bem purificadas nanoestruturas de origami de DNA.
Outros métodos foram desenvolvidos para estabilizar DNA nanoestruturas, tais como a ciclização de cadeias de ADN através de um clique reação26. Como fibras descontínuas alquino e azida modificado são necessárias para a formação de anéis de single-stranded entrecruzados, esta técnica é limitada para a estabilização de nanoestruturas pequenas tal Catane um DNA, e não é facilmente escalável para maior origami de DNA estrutura, tais como aqueles usados no presente protocolo. Recentemente, Gerling et uml.27 relatou um método para criar ligações covalentes ciclobuteno pirimidina dímero (CPD) títulos entre vizinhos thymidines dentro de nanoestruturas de DNA usando radiação ultravioleta. Embora este método seja selectivo local e escalável, sua eficiência em proteger origami de DNA é muito inferior ao revestimento polycation. Por exemplo, objetos de origami de DNA CPD-estabilizado suportar somente 0,4 U/mL DNase eu por 1h, enquanto os polyplexes foram estáveis na presença de 10 U/mL DNase eu pelo menos um dia.
Em breve, gene-terapia inspirada quitosana e revestimento de LPEI é um baixo custo, um passo e eficiente método de abordar a estabilidade a longo prazo de nanoestruturas de origami de DNA em Mg-esgotada e nuclease mídia avançada. A reversibilidade da formação polyplex facilita sua aplicação em testes de diagnóstico de várias etapa onde a proteção de origami de DNA contra degradação antípodas ou depleção de sal é crucial em uma única etapa, mas pode causar problemas em outras etapas como DNA amplificação. Além disso, revestimento polycation é uma abordagem potencial para melhorar a absorção celular de DNA origami nanoestruturas para drogas-entrega aplicativos28.

DNA é um bloco de construção versátil para a auto-montagem de nanoescala estruturas1programável. O método mais popular para a criação de nanoestruturas de DNA é a técnica de origami de DNA, que se baseia a auto-montagem de um tempo circular, o único ADN encalhado andaime com a ajuda de centenas de menor determinação de forma sintética grampo fios2. Hoje, a criação de nanoestruturas de DNA em quase qualquer geometria e morfologia é facilmente viável. Nanoestruturas de DNA podem ser acrescidas de site-specifically com alta precisão de3,4 e podem ser programadas para sofrer mudanças conformacionais alostérico5,6. Portanto, usar o DNA como material de construção oferece a oportunidade única de criar programáveis e responsivas nanoestruturas projetados para aplicações em biosensing, diagnósticos e entrega da droga. No entanto, nanoestruturas de DNA são suscetíveis a digestão por exo- e endo-nucleases e com base em malha 3D nanoestruturas de origami de DNA geralmente necessitam de buffers de alta salinidade (EG., 5-20 mM Mg+ 2) para manter sua integridade de7,8.
A rápida degradação do DNA por nucleases presentes no sangue e a matriz extracelular é um grande obstáculo à eficiente na vivo entrega de produtos genéticos em células9. Para superar essa limitação, na entrega do gene não-virais, o DNA é misturado com um polímero catiônico em um definido N/P carga ratio (proporção de aminas em polycation para os fosfatos no DNA)10. O complexo de DNA com um polímero catiônico, conhecido como polyplex, protege o DNA da degradação mediada por nuclease e aumenta a sua absorção celular11. Inspirado por avanços de entrega do gene, oligolysine12, oligolysine-polietileno glicol (PEG) copolímeros13, poli (ethylmethacrylate-2-dimetilamino) (PDMAEMA)-com base em polímeros14e vírus capsídeo proteínas15 têm sido utilizados para estabilização de nanoestruturas de origami de DNA.
Recentemente, nós relatamos um método para a proteção de nanoestruturas de origami de DNA em Mg-esgotada e mídia rica nuclease usando a quitosana polissacarídeo catiônico natural e o sintético polyethyleneimine linear (LPEI) foi relatado16. Este artigo é uma adaptação de nossos trabalhos anteriores e descreve o protocolo detalhado para a preparação de polyplexes, sua caracterização, testar a estabilidade de nanoestruturas nuas e protegidas na mídia baixa em sal e rica em nuclease e examinando o endereçamento de enzima - e aptamer-acrescida ADN origami nanoestruturas com revestimento polycation.

<table><tbody><tr><td>10 vezes; Tampão de reação DNase I</td><td>New England Biolab (NEB)</td> <td>B0303</td><td></td></tr><tr><td>ABTS (2&prime;-Azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) sal de diamônio)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>J65535</td><td></td></tr><tr><td>Amicon colunas de ultracentrifugação</td><td>Merck Millipore</td><td>UCF500308, UCF510024</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de oligossacarídeo de quitosana (Mn ~ 4000-6000, > 90% desacetilado, 60%. composição oligossacarídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>523682</td><td></td></tr><tr><td>Fios de grampos específicos do design</td><td>Integrar tecnologias de DNA (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de sulfato de dextrano (Mr ~ 4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75027</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de sulfato de dextrano (Mr ~ 40 kDa)</td><td>Corante de carregamento de gel de DNA Sigma-Aldrich</td><td>42867</td><td></td></tr><tr><td>(6&vezes;)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (livre de RNase)</td> <td>New England Biolab (NEB)</td> <td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N&prime; , N&prime; -ácido tetracético (EGTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) BioUltra, anidro, &ge; 99% (titulação)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns</td><td>Biorad</td><td>7326165</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroixde slution (32% em peso)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>LPEI-25 kDa</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Agente Redutor de Amostras NuPAGE (500 mM ditiotreitol (DTT)))</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol (PEG, MW ~ 8000 Da)</td><td>Carl Roth</td><td>O263.1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, linear, Mn médio 10,000, PDI &le; 1.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090</td><td></td></tr><tr><td>Polietilemina, linear, média Mn 5,000, PDI &le; 1.3</td> Solução de proteinase <td>K de 764582</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(20 mg/ml)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>HRP conjugado com estreptavidina</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>SYBER corante de gel de DNA seguro</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>S33102</td><td></td></tr></tbody></table>

gene-terapia inspirou polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de origami de dna

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

ADN origami nanoestruturas segurar um imenso potencial para ser usado para aplicações biológicas e médicas. No entanto, condições de baixo teor de sal e nucleases em fluidos fisiológicos induzem desnaturação e degradação de DNA nanostructures auto-montados. Na entrega do gene não-virais, degradação enzimática do DNA é superada pelo encapsulamento do DNA carregado negativamente em um shell catiônico. Neste documento, inspirado pelos avanços de entrega do gene, um simples, um passo e metodologia robusta é apresentado para a estabilização do DNA origami nanoestruturas revestindo-os com quitosana e polyethyleneimine linear. O revestimento de polycation protege eficientemente nanoestruturas de origami de DNA em Mg-esgotada e nuclease mídia avançada. Esse método também preserva o endereçamento completo de functionalization e aptamer-enzimáticos de nanoestruturas de DNA.

Foram projetadas três nanoestruturas de origami de DNA de diferentes configurações, incluindo um nanorod (NR), um nanobottle (NB) e um wireframe nanostructure (WN) (os modelos 3D das nanoestruturas são ilustrados na Figura 2). O NR e o NB foram projetados com base em um lattice square e do favo de mel, respectivamente, usar o circunflexo17 e o WN foi criado usando o software de Daedalus18. Um protocolo abrangente para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de DNA tem sido já publicou19,20,21,22. O grampo de forma específica, vertentes foram encomendados, Self montados e adicional baseado em um protocolo descrito por Stahl et al. 23 (etapa 2).
Os polyplexes foram caracterizados pelo ensaio de retardo de gel e nsTEM de imagem. Após misturar o origami de DNA com o polycations, uma mudança na banda nanostructure nua no sentido do cátodo foi observada (Figura 1A). Isto pode ser atribuído para o contrabalançando da carga negativa de fosfato aumentam a grupos com ligação a polycations e o tamanho geral do complexo. Adicionar uma quantidade extra de polianiões tais como sulfato de dextrano pode reverter a formação polyplex. A este respeito, sulfato de dextrano de maior peso molecular (MW ~ 40 kDa) mostrou-se mais eficiente para a decomplexation em relação ao sulfato de dextrano de peso molecular inferior (MW ~ 4 kDa) (Figura 1B).
Enquanto os polyplexes LPEI pela mancha negativa do acetato de uranilo TEM de imagem, era difícil para todas as partículas de imagem. Foi hipotetisado que LPEI pode dificultar o acetato de uranilo de vinculação ao fosfato devido a blindagem apertado de origami de DNA. Portanto, antes da imagem latente de nsTEM, foi adicionada uma quantidade adicional de sulfato de dextrano LEPI polyplexes. O origami de DNA a desvendado nanostructures não mostrou nenhum sinal de defeito nem decomposição. Em contrário, os polyplexes quitosana com êxito foram fotografados sem necessidade de tratamento polyanion (Figura 2).
Todos nus nanoestruturas de DNA (independentemente de suas configurações diferentes) foram desnaturadas completamente após um dia de incubação a 37 ° C, em Mg-zero buffer, como confirmado pela imagem latente de nsTEM. Em contraste, nanoestruturas revestidas com LPEI ou quitosana no N/P≥1 permaneceram intactas. Da mesma forma, DNase eu titulação ensaios mostraram a susceptibilidade de nanoestruturas desprotegidas para digestão enzimática. Enquanto nus nanoestruturas foram completamente digeridas na presença de 1 U/mL DNase, depois de 2 h, a LEPI ou quitosana encapsulado origami de DNA ficou intacta no buffer de Mg-zero suplementado com 10 U/mL DNase eu por um período mínimo de um dia (Figura 2). Maior estabilidade para a digestão de antípodas foi alcançada, aumentando a relação N/P dos polyplexes. Além disso, LPEI protege as DNA de nanoestruturas mais eficiente comparadas a quitosana (Figura 3A, Figura 3C), provavelmente devido à maior densidade de carga do LEPI e, portanto, maior afinidade de ligação para o DNA24 . Não foi observada diferença ao usar LPEI de peso molecular diferente (figura3B).
O endereçamento de grupos funcionais em nanoestruturas de DNA após encapsulamento em um shell de polímero é uma característica importante. Além disso, analisou-se a compatibilidade de revestimento polycation com a enzima peroxidase de rábano (HRP) e hemina-ligação aptamers (HBA) acrescida ADN origami. Três vertentes de grampo biotinilado foram se projetavam da superfície da NR e depois acrescidas com streptavidin HRP conjugado (três enzimas por origami de DNA). O cataliticamente altamente ativo (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') foi escolhido para estes experimentos25. Até 24 fibras descontínuas foram se projetavam da superfície com um vinculador de 5 nm de comprimento NR (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') seguido de PS2. Sequência de M (24 aptamers por origami de DNA). Nenhum obstáculo notável de enzimática ou atividade aptamer foi observada em cima de revestimento origami de DNA HRP - ou HBA-acrescida com LPEI e quitosana na variante N/P rácios (Figura 4A-B)16. No entanto, a cinética de enzima HRP foi drasticamente alterada após a ligação para o origami de DNA (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> Figura 1 : Imagens de idade representativa de formação polyplex e desencapsulamento. (A) o ensaio de turno de mobilidade electrophoretic para NB misturado com quitosana em rácios de N/P de 0,01-8. Cada pista contém 1 nmol NB. A primeira pista é a referência NB. (B) o desencapsulamento de polyplexes por sulfato de dextrano polyanionic (DS). Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> Figura 2 : Micrografias TEM mancha negativa de origami de DNA e os polyplexes. 3D modelo e nsTEM micrografias de nanoestruturas de origami de DNA nus (colunas 1 e 2). micrografias de nsTEM de LPEI os polyplexes (após o desencapsulamento) e quitosana polyplexes (colunas 3 e 4). nsTEM imagens de origami de DNA nu e protegido (polyplex) submetida a depleção de Mg (colunas 5, 6 e 7), a degradação enzimática (colunas 8 e 9), digestão de soro (colunas 10 e 11) para um dia a 37 ° C. LPEI-5 kDa foi usada neste ensaio. Nanoestruturas de DNA nus foram degradadas além da detecção de uma idade na presença de 1 U/mL de DNase ou em TB + 10% FBS após 2 h de incubação a 37 ° C. Barras de escala: 100 nm. Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> Figura 3 : Resultados representativos de DNase eu ensaios da proteção. (A) o DNase eu ensaio da proteção para os polyplexes de WN com kDa LPEI-5, LPEI-10 kDa e LPEI-25 kDa preparado na relação N/P de 2, 4, 8 e 10. As amostras foram submetidas a 10 U/mL DNase por 24 h a 37 ° C. A última faixa é o controle WN. Os polyplexes estava congelada previamente ao seu embarque no gel. (B) a intensidade de banda média normalizada para polyplexes de origamis de DNA com diferentes LPEI extraído de idade imagem-A. Eixo Y representa a intensidade de banda média normalizada. (C) o DNase eu ensaio da proteção de quitosana-WN polyplexes preparados no N/P rácios de 1, 2, 4, 10 e 20. As amostras foram submetidas a 10 U/mL DNase por 24 h a 37 ° C. 6 Lane é o controle polyplex (N/P. 20). A última faixa é o controle WN. Todos os polyplexes quitosana foram decapsulated carregamento prévio no gel. Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> Figura 4: Representante resultados dos ensaios de origami de DNA colorimétrico enzima - e aptamer-acrescida. (A) o ensaio colorimétrico de nanoestruturas acrescida de enzima (HRP-NR) revestidas com quitosana 3,7 h após o início da reação. (B) ensaio colorimétrico de nanoestruturas acrescida de aptamer (HBA-NR) revestidas com quitosana, 6 min após o início da reação. Eixo Y representa a absorvância normalizada. (C) monitorar o doseamento colorimétrico da HRP e HRP-NR ao longo do tempo. Esta figura foi modificada de um publicado anteriormente figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Polímeros Catiônicos</td>
			<td>Quitosana</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peso molecular do polímero (kDa)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peso Molecualr do monômero (g/mol)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de amina por monômero</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de amina por polímero</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Cálculo do número de grupos amina por polycation.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Peso molecular do sulfato de dextrano (kDa)</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peso molecular do monômero (g/mol)</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de sulfato por monômero</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de sulfato por polímero</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2. Cálculo do número de grupos sulfato por polyanion.

Aqui, um protocolo relativo à protecção de nanoestruturas de origami de DNA em Mg-esgotada e nuclease mídia avançada usando quitosana natural polissacarídeo catiônico e revestimentos sintéticos polyethyleneimine linear (LPEI) é apresentado.

Gene-terapia inspirou Polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de Origami de DNA

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

A estabilização biológica das nanoestruturas de DNA é essencial para futuras aplicações in vivo, como a entrega de medicamentos direcionados. No entanto, o DNA é degradado no corpo por várias enzimas. Aqui apresentamos uma técnica de revestimento que protege as nanoestruturas de DNA da degradação enzimática.As principais vantagens são que nosso revestimento compreende compostos não tóxicos que já são usados em organismos vivos e que a funcionalidade da superfície permanece possível. Esta funcionalidade é importante para incorporar sensores moleculares para reconhecimento de alvos e interruptores para liberação de carga de drogas. Os revestimentos de policação aumentam significativamente a absorção celular de estruturas de origami de DNA encapsulado, de modo que este método pode abrir a porta para aplicações de origamis de DNA em diagnósticos e terapêuticas.A captação celular também é necessária para aplicações potenciais de entrega de genes da nanotecnologia de DNA. Considero que o método é bastante simples e pode ser facilmente dominado. Para começar, meça a concentração de origami de DNA purificado.Use dois microliters de tampão de TB como o branco para calibrar o espectrofotômetro ultravioleta. E então meça a concentração de dna origami em 260 nanômetros. Em seguida, calcule as quantidades de fosfatos na solução purificada de origami de DNA, usando a fórmula dois, conforme descrito no manuscrito.Prepare 15 microliters da estrutura de origami de DNA, incluindo um nanomole de fosfato, usando tampão de TB para diluição. Adicione 13,2 microliters à TB a 1,8 microliters de chitosan. E adicione 15 microliters da solução chitosana a 15 microliters do DNA origami para desenvolver um dna origami chitosan polyplex com uma razão N/P de oito.Continue preparando poliplexes de diferentes proporções N/P, utilizando cálculos descritos no manuscrito. Prepare 80 milímetros de tubo para gel de 2%agarose. Adicione 352 microliters de 2,5 cloreto de magnésio molar e, em seguida, pré-manchá-lo com 10 microliters de mancha de gel de DNA.Despeje a solução de gel em uma caixa de gel seco. Insira um pente de eletroforese em gel e deixe solidificar à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. Enquanto isso, suplemente o tampão de corrida com 11 cloreto de magnésio mililitro.Misture de 10 a 20 microlitadores de cada amostra com 20% do buffer de carregamento 6X. Carregue as amostras nos poços de gel de agarose, incluindo um origami de DNA nu como controle. Execute o gel a 70 volts em temperatura ambiente por duas horas e meia a três horas.Em seguida, use um scanner UV para visualizar o gel. Para realizar um ensaio de proteção DNase I, adicione quatro microliters de cada poliplex comparado em diferentes proporções N/P, 1,5 microliters de tampão 10X DNase I, 8 microliters de TB e 1,5 microliters de DNase I a um tubo PCR separado de 2 mililitros. Em seguida, incubar o mesmo a 37 graus celsius em um termociclador por 24 horas.Para digerir DNase I, adicione dois microliters de 20 miligramas por mililitros proteinase K e incubar por 30 minutos a 37 graus celsius em um termociclador. Em seguida, para desvendar as nanoestruturas de DNA do núcleo adicionam 3,6 microlitadores de 50 miligramas por mililitro 40 kilodaltons dextran sulfato. Em seguida, use essas amostras e origami de DNA fresco como controle para realizar eletroforese de gel agarose como descrito anteriormente.Extir esse valor é a banda correspondente a amostras carregadas do gel. Para extrair o origami de DNA, use uma coluna de extração de congelamento de espremer e siga as instruções do fabricante e continue com imagens de microscopia eletrônica de transmissão negativa, conforme descrito no manuscrito. Misture 6,5 microliters de 36 hrp-nr nanomolar purificados com 6,5 microliters de polilaculações de concentrações variadas.Para preparar um poliplex em proporções N/P de uma, duas, quatro, 10 e 20, prepare um grupo em branco misturando 6,5 microliters de água destilada com 6,5 microliters de polilações de várias concentrações correspondentes às relações N/P de uma, duas, quatro, 10 e 20. Em seguida, adicione 12,5 microliters de cada uma dessas soluções preparadas a um poço separado de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 72,5 microliters de tampão HEPES a cada poço e misture.Adicione 10 microliters de 15 mililitros ABTS e depois 5 microliters de um peróxido de hidrogênio de 12 mililitros a cada poço e misture por tubulação para cima e para baixo. Por fim, use um leitor de placas multimoda para medir a absorvência em 421 nanômetros ao longo de quatro horas. Depois de analisar os poliplexes usando um ensaio de retardo de gel, houve uma mudança na nanoestrutura nua em direção ao cátodo, provavelmente devido ao contrabalanciamento da carga negativa de grupos fosfatos ao ligar-se às policações, e o aumento de tamanho do complexo.Quando foi adicionada uma quantidade extra de polianões, como sulfato de dextran, a formação de poliplex foi revertida. O sulfato de dextran de maior peso molecular mostrou-se mais eficiente em comparação com o menor peso molecular. Após analisar os poliplexes usando microscopia eletrônica de transmissão de manchas negativas, micrografos mostraram nanoestruturas de origami de DNA nu, poliplexes lineares de polietilenimina após decapsulação, poliplexes chitosanos, imagens de origami de DNA nu e protegido submetidos à esgotamento do magnésio, degradação enzimática e digestão sérmica.Na presença de DNase I, após duas horas, nanoestruturas nuas foram completamente digeridas, enquanto os polietilenimina linear polyplexes do origami de DNA encapsulado chitosano permaneceram intactos na presença de 10 unidades por mililitro DNase I.Polietilenimina linear polyplexes protegem as nanoestruturas de DNA de forma mais eficiente em comparação com o quitossano. Quando a razão N/P do poliplex é aumentada, a digestão do DNA foi menor. Após a enzima de revestimento, ou após origami de DNA mais funcionalizado, com polietilenimina linear poliplexes e quitosan nas proporções N/P variante, não foi observada nenhuma interferência notável com a atividade enzimática.Por outro lado, a cinética da enzima HRP mudou drasticamente após a ligação ao origami de DNA. É importante começar com estruturas bem purificadas de origami de DNA. Existe um fio estabilizador que também pode se ligar a policações.São difíceis de serem separados dos poliplexos de origami de DNA. Nossas moléculas de revestimento também são usadas em aplicações de terapia genética. Isso significa que as nanoestruturas de DNA podem ser usadas no futuro para alterar o genoma dos organismos vivos.Para a coloração de gel de agarose, geralmente são usadas moléculas que intercalam o DNA e são potencialmente mutagênicas. Por favor, siga as instruções de segurança do seu laboratório ao colorar o DNA.

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Química

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