Name: Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda técnicas de ensaios de infecção in vitro e in vivo para analisar o efluxo de patógenos intracelulares. Este método permite avaliar a eficiência do efluxo e caracterizar patógenos pós-efluxo em interações hospedeiro-patógeno.

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Os ratos foram tratados com humanidade em conformidade com todas as directrizes do governo apropriado para o cuidado e uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e seu uso foi aprovados para este estudo todo pelo cuidado Animal institucional Universidade de Miami e o Comitê de uso (protocolo 16-053).
1. preparar células para a infecção
<ol><li>Propagar o rato macrófago-como a linha celular 264.7 crus em meios de cultura de tecido DMEM suplementados com 10% de soro fetal bezerro (doravante referido como DMEM/FCS) usando um balão de 125 mL e uma incubadora de cultura de tecidos, mantida a 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>O dia antes da infecção, use uma espátula de célula para remover células de balão de expansão e recolher em um tubo cônico de 15 mL tampa de rosca. Células em 800 x g durante 10 minutos de centrifugação, decante o sobrenadante e suspender o centrifugado em 1 mL de DMEM/FCS (sem antibióticos) e determinar o título usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.</li>
	<li>
Ajustar a concentração de 2 x 106 células/mL e adicionar 0,10 mL (2 x 105 células) para poços de uma placa de cultura de tecido 48-bem. Certifique-se de que a suspensão de eritrócitos cobre toda a superfície do poço.
	<ol>
<li>Células de placa em poços adicionais para uma posterior fonte de mídia condicionadas. Também coloca 0,10 mL de DMEM/FCS em três poços adicionais para servir como um 'nenhuma célula controle'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube durante uma noite em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 °C/5% CO2. No dia seguinte, não retire da incubadora até o inóculo da bactéria é preparado e pronto para uso.</li>
</ol>2. preparação de Listeria monocytogenes (Lm) para infecção
<ol><li>Inocular a 2 mL de infusão de cérebro-coração (BHI) com uma única colônia de uma placa de ágar recém leucostictus (< 2 dias) da Lm e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação em 130 rotações/min.</li>
	<li>No dia seguinte, adicione 0,10 mL de cultura durante a noite para 2ml pré aquecido BHI e continuar a incubar a 37 ° C, com agitação até que a densidade óptica (OD600) é entre 0,4 e 0,6.</li>
	<li>Determine aproximada concentração bacteriana usando uma fórmula de conversão derivados empiricamente. Em nosso laboratório, uma cultura de Lm exponencialmente crescente em BHI é aproximadamente 1.3 x 109 formadoras de unidades (CFU) / OD600. Minimize a quantidade de tempo que culturas bacterianas são expostas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Apenas antes da infecção, ajuste a concentração de 5 x 107 UFC/mL, usando pré-aquecido DMEM/FCS como diluente.</li>
</ol>3. infecção
<ol><li>Trabalhar rapidamente e precisamente, adicionar 20 µ l (1 x 106 UFC; multiplicidade de infecção, MOI = 5) do inóculo a Lm recém-preparado (passo 2.4 acima) para poços inclinando ligeiramente o prato e cuidadosamente, colocando a ponta da pipeta na mídia sobrejacente; Nota: Evite tocar as paredes do poço com a ponta da pipeta.</li>
	<li>Delicadamente pipetar o conteúdo de cada poço para garantir completa a mistura; Não sacuda ou significativamente incline o prato como isso vai se espalhar por Lm as paredes do poço. Retorne o prato de cultura celular para 37 °C/5% CO2 incubadora.</li>
	<li>Prepare uma solução de gentamicina 10 µ g/mL usando mídia condicionadas de poços não infectados como diluente.</li>
	<li>Em 30 minutos pós infecção (mpi), cuidadosamente Adicionar 30 µ l da solução de gentamicina (concentração final 2,5 µ g/mL) e suavemente pipetar o conteúdo do bem como antes e placa de cultura de célula retorno a 37 °C/5% CO2 incubadora.</li>
	<li>Em 60 mpi, colheita poços apropriados para ensaio CFU (60 mpi ponto de tempo) ou análise FCM (como descrito abaixo nas secções 4 e 5, respectivamente).</li>
	<li>Para poços restantes, em vários momentos depois ou colher células como antes, ou, para o ensaio de surgimento de Lm , inteiramente remover mídia do poço e substituir com 150 µ l de mídia condicionada livre de gentamicina.</li>
</ol>4. amostragem, processamento e análise de intracelular e emergente Lm por ensaio CFU
<ol><li>A colheita, incline ligeiramente o prato e remova cuidadosamente a mídia inteira do poço. Adicione a 0,50 mL de água destilada estéril (dsH2O) para o poço. Após 30 s, transferir a água resultante lisada (100) para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice vigorosamente por 10 s.</li>
	<li>Prepare-se 10-1 e 10-2 diluições adicionando ou 4,5 µ l ou 50 µ l de água lisada a 450 µ l de dsH2O e brevemente vórtice para assegurar uma mistura completa.</li>
	<li>Espalhe 50 µ l de 10 a0, 10-1 e/ou 10 amostras de-2 em placas de ágar lisogenia caldo (LB).</li>
	<li>Ensaio para emergentes Lm (passo 3.6 acima), remover 10 µ l da mídia sobreposição e dividi-lo em alíquotas de 2 a 5 µ l: a uma alíquota adicionar 5 µ l de DMEM/FCS e a segunda alíquota adicionar 5 µ l de DMEM/FCS contendo 5 gentamicina µ g/mL. Controle o último distingue entre extracelular Lm (gentamicina sensível) e do ensaio intracelular Lm (gentamicina resistente) no CFU subsequente.</li>
	<li>Depois de 5 min à temperatura ambiente, adicione 90 µ l de dsH2O, vortex vigorosamente durante 10 s e propagação 50 µ l em placas de ágar LB.</li>
	<li>Enumerar a Lm colônias em placas de ágar LB após 2 dias de incubação a 37 ° C.</li>
</ol>5. amostragem, processamento e análise de intracelular e emergente Lm por citometria de fluxo (FCM)
<ol><li>Prepare 264.7 pilhas conforme descrito nos passos 1.1-4. Ajustar as células a 1 x 106 células/mL e adicionar 1 mL (1 x 106 células) para poços de uma placa de cultura de tecido 6-poços.</li>
	<li>Preparar o inóculo da bactéria, conforme descrito no passo 2.1-2.3 e infectar células com volume de inóculo, correspondente a um MOI de 50 (5 x 107 UFC).</li>
	<li>A infecção de post de 1,5 horas (hpi), coletar mídia do primeiro conjunto de poços e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com 500 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) e lugar no gelo até que todos os poços foram processados.</li>
	<li>Para coletar intracelular Lm, adicione 1 mL de dsH2O para o poço e depois de 60 s, transfira a lisado de água resultante para um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com 500 µ l de 4% PFA. Vórtice vigorosamente durante 10 s e lugar no gelo até que todos os poços foram processados. (Processamento de amostra é descrito na etapa 5.8 abaixo).</li>
	<li>Para poços restantes, remova a mídia e substituir com 1 mL de DMEM/FCS com 5 gentamicina µ g/mL para matar extracelular Lm e devolver imediatamente as células para incubadora.</li>
	<li>Depois de 30 min (2 hpi) remover mídia e substituir com DMEM/FCS sem gentamicina.</li>
	<li>Após 2 e 4 h (hpi 4 e 6) tomar a segunda e a terceira vez pontos através da recolha de meios de comunicação e lisados como etapas 5.3 e 5.4.</li>
	<li>Centrifugar tubos a 10.000 x g durante 7 min. remover sobrenadante sem perturbador da pelota.</li>
	<li>Suspender a cada pellet de coloração, o cocktail de 50 µ l de 4% PFA e 15 µ l de faloidina. Incube os tubos no escuro a 4 ° C por 20 min.</li>
	<li>Após a incubação adicione 1 mL de tampão de FACS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo se misturam.</li>
	<li>Gire os tubos a 10.000 x g durante 7 min. remover sobrenadante sem perturbador da pelota.</li>
	<li>Suspender a cada pellet em 400 µ l de tampão de FACS para uso imediato, ou 200 µ l de tampão de FACS e 200 µ l de 4% PFA se armazenando para análise posterior.</li>
	<li>Executar amostras em uma citometria de fluxo e analisar os dados coletados.</li>
</ol>6. amostragem, processamento e análise de colonização Lm e respostas de Host no fígado
<ol><li>Prepare o Lm para infecção, conforme descrito no passo 2.1-2.3.</li>
	<li>Calcule a quantidade necessária de subcultura para desejado título de 3 x 106 UFC/mL.</li>
	<li>Apenas antes da infecção, dilua a quantidade de bactérias calculadas com pré-aquecido Hank está equilibrado sal solução (HBSS) em um volume final de 1 mL. Este é o inóculo de entrada que é injetado o mouse.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de insulina 100U G½ 28, desenhar 100 µ l (3 x 105 UFC) de inóculo entrado e remover quaisquer bolhas de ar visível.</li>
	<li>Coloque o mouse (linhagem C57BL/6; os machos entre 6 e 12 semanas de idade) em apoio de exploração e utilizar água quente (não mais do que 45 ° C) para dilatar a veia da cauda e, em seguida, injetar o inóculo de entrada para a veia.</li>
	<li>10-2 e 10-3 diluições do inóculo entrada nas chapas de 10bcm LB ágar da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C para determinar a dose de entrada real.</li>
	<li>Em 18 hpi, humanamente eutanásia mouse (CO2 asfixia seguida por deslocamento cervical) e usando o peritônio do mouse abrir corte de tesoura estéril para coletar o lóbulo frontal do fígado usando pares separados de pinças e tesouras para fora e dentro de o mouse. Coloque o fígado em um prato de Petri no gelo de 6cm.</li>
	<li>Corte o fígado em cubos pequenos e coloque num frasco de vidro com uma barra de agitação magnética. Adicione 2 mL de colagenase 2 mg/mL D reconstituído em DMEM sem FCS. Incube frascos a 37 ° C em um agitador magnético para min 30−45. Uma vez que o tecido é homogeneizado, adicione 3 mL de DMEM/FCS para inactivar a colagenase.</li>
	<li>Filtre as células através de um filtro de célula de 70 µm para um tubo cônico, adicionando mais DMEM/FCS, se necessário.</li>
	<li>Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C por 10 min de Pelotas, remover o sobrenadante e suspender centrifugado em 500 µ l de tampão ACK para lisar células vermelhas do sangue.</li>
	<li>Incube as células à temperatura ambiente por 5 min em buffer ACK. Suspenda as células em 1 mL de DMEM/FCS.</li>
	<li>Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C por 10 min de Pelotas, remover o sobrenadante e suspender em 1 mL de DMEM/FCS. Em seguida, conte as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.</li>
	<li>Transferi 1 x 106 células para tubo de 1,5 mL microcentrifuga e girar a bola. Então suspenda em 1 mL de dsH2O vórtice para lisar as células. 50 µ l em placas LB no não diluído e 10-2 diluições da placa e incubar a 37 ° C para enumerar Lm para análise do UFC.</li>
	<li>Transferir 1 x 106 células para tubos de FACS para cada amostra de tecido de acordo com a contagem de células e lavar com 1 mL de tampão de FACS.</li>
	<li>Centrifugar as células a 800 x g a 4 ° C por 10 min de pelotas e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Prepare um coquetel de anticorpos que contém os anticorpos de interesse com base na concentração recomendada para cada anticorpo e buffer de FACS. Consulte Tabela de materiais para quantidades recomendadas utilizadas na análise.</li>
	<li>Suspender o sedimento em 100 µ l de anticorpo cocktail e incubar os tubos no escuro a 4 ° C por 30 min.</li>
	<li>Após a incubação, adicionar 2 mL de tampão de FACS a cada tubo e suspender as células.</li>
	<li>Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C de pelotas e descartar o sobrenadante. Então, suspender o sedimento em 400 µ l de tampão de FACS para uso imediato, ou 200 µ l de tampão de FACS e 200 µ l de 4% PFA se guardar para mais tarde.</li>
	<li>Analisar as células por citometria de fluxo (consulte a etapa 5.13).</li>
</ol>

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<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido a seu programa de infecção celular rápida e processive, Lm é um patógeno ideal para sondar celulares atividades que impactam a infecção. Foram identificada uma série de fatores do hospedeiro que positivamente ou negativamente afetar Lm infecção celular11,12,13,14. Dois desses hospedam fatores caracteriza-se em nosso laboratório, perforina-2 e o inibidor de Heme regulada...

Infecção com base em modelos experimentais são inerentemente desafiadoras devido a sua dependência sobre as condições de estado inicial do hospedeiro e patógeno, as várias estratégias de infecção do patógeno e a dificuldade de atribuir o patógeno e hospedeiro-orientado a processos com base em resultados. A bactéria Listeria monocytogenes (Lm) tornou-se um patógeno ideal para sondar as respostas de defesa do hospedeiro por causa de sua rastreabilidade genética e microbiológica, sua estratégia de infecção celular rápida e processive e relativamente clara relação entre seus fenótipos de infecção celular e organísmica-nível. A infecção celular de Lm procede por quatro fases distintas1: (i) invasão celular que conclui com Lm sendo colocadas dentro de um vacúolo; (ii) Lm-dirigido a dissolução da membrana do vacúolo e libertação de Lm no citosol; (iii) intracytosolic replicação; e (iv) penetração física da membrana plasmática que resulta na infecção de células diretamente adjacentes (tais como uma folha epitelial) ou, em celas solitárias, lançamento do Lm para o meio extracelular. Cada uma destas fases são promovidos pelo específico Lm-codificado fatores (referidos como 'fatores de virulência') que, quando eliminado, causar defeitos de infecção em modelos celulares e animais. Esta estratégia de infecção geral tem sido evoluiu de modo independente por vários dos chamados patógenos 'citosólica'2.
Formadoras de Colônia (UFC) de unidade ensaios são amplamente empregados para avaliar ambos in vitro (ou seja, celulares), bem como in vivo (ou seja, organísmica) resultados de infecção. Além de sua alta sensibilidade, particularmente para infecções em vivo, CFU ensaios fornecem uma leitura ambígua para invasão do patógeno e sobrevivência/proliferação intracelular. CFU ensaios têm sido utilizados extensivamente para analisar os determinantes de célula Lm e o anfitrião que impactam a infecção. Tão informativa como estes estudos prévios foram analisar a invasão celular e replicação de intracytosolic, ensaios de UFC não, o melhor de nosso conhecimento, foram utilizados para acompanhar a quarta fase do processo de infecção de Lm : fuga de celular. Aqui, descrevemos relativamente simples meios de evacuação como celular (doravante referida como 'emergência') podem ser monitorados por meio de ensaio CFU (bem como por citometria de fluxo) e mostrar exemplos de como os dois fatores do patógeno e hospedeiro codificado - regulam esta fase da Lm ciclo de infecção. A análise da fase terminal do ciclo celular Lm infecção pode tornar possível identificar atividades e fatores de infecção específica de célula do hospedeiro e patógeno adicional.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing</td><td>Buffer Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>Contas de Compensação Reativa de Amina ArC&nbsp;</td><td>Caldo de Infusão</td> de Coração Cerebral <td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>da Life Technologies EMD Milipore</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 70 &micro; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td>Tubos FACS <td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Inativado por Calor&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solução salina balanceada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Grow Cells MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas amarelas fixáveis&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Faloidina&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800 Analisador Espectral</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa 28 G 1/2" 1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP Placas de 48 Poços&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP Placas de 6 Poços para Cultura de Tecidos&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads eBioscience</td><td></td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE Cy5, Diluição = 1/100, Clone = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 647, Diluição = 1/100, Clone = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = APC Cy7, Diluição = 1/100, Clone = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE, Diluição = 1/100, Clone = BM8</td></tr><tr><td>Vivo/Morto</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Flurocromo = AmCyN, Diluição = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurocromo = PacBlue, Diluição = 1/200, Clone = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurocromo = AF 700, Diluição = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurocromo = BV 605, Diluição = 1/100, Clone = PK136</td></tr></tbody></table>

usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível host respostas

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Há uma variedade de estratégias de patógenos bacterianos empregam para sobreviver e proliferar uma vez dentro da célula eucariótica. Os chamados 'citosólico' patógenos (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) ter acesso para o citoplasma da célula infectada pelo fisicamente e enzimaticamente degradante a membrana vacuolar primária. Uma vez no citosol, estes patógenos proliferam tanto geram forças mecânicas suficientes para penetrar a membrana plasmática da célula hospedeira para infectar novas células. Aqui, nós mostramos como essa etapa terminal do ciclo celular de infecção de L. monocytogenes (Lm) pode ser quantificada por citometria de fluxo e ensaios de unidade formadoras e dar exemplos de como ambos impacto de fatores patógeno e hospedeiro codificado - isto processo. Também mostramos uma estreita correspondência de Lm dinâmica de infecção das células cultivadas infectados in vitro e os de células hepáticas, derivadas de ratos infectados in vivo. Estes ensaios baseados em função são relativamente simples e podem ser facilmente ampliados para telas de alta produtividade baseada na descoberta de moduladores da função da célula eucariótica.

Avaliar o papel do patógeno e hospedeiro-codificado fatores impactando infecção celular Usando as condições de infecção descritas acima, 0,15% da entrada do selvagem-tipo Lm é recuperado após 1,5 h de incubação co com macrófagos cultivados (Figura 1A). No subsequente 1,5 h de incubação co (3h pós infecção, hpi), houve um 4-fold aumento na recuperação de viável Lm e de 3 a 6 hpi, houve um aumento de 7.5-fo...

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Patógenos microbianos que se replicam intracelularmente devem eventualmente sair da célula infectada. Que, quando comparado com outros aspectos das interações de patógenos hospedeiros é relativamente subestudado. Aqui, descrevemos técnicas para analisar o efflux patógeno.Mostramos como ensaios relativamente simples podem ser usados para avaliar a eficiência efflux ou caracterizar patógenos pós-efflux As técnicas gerais descritas aqui são amplamente aplicáveis, embora modelos específicos de células hospedeiras de patógenos possam diferir em cinéticas, dosagens e possivelmente leituras. Como na criação de qualquer sistema experimental, é essencial que sejam estabelecidos controles claros que garantam que processos biológicos genuínos sejam observados em amostras experimentais ou coortes. Demonstrando o procedimento será Petoria Gayle, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para começar com o experimento de infecção, use uma pipeta para adicionar 20 microliters do inóculo Lm recém-preparado aos poços, com o prato ligeiramente inclinado e a ponta da pipeta cuidadosamente colocada na mídia sobrelada. Evite tocar nas paredes do poço com a ponta da pipeta. Pipeta suavemente o conteúdo de cada poço para garantir a mistura completa.Não agite ou incline significativamente a placa para evitar espalhar LM sobre as paredes do poço. Retorne o prato de cultura celular ao prato de 37 graus Celsius, 5% de incubadora de dióxido de carbono. Use mídia condicionada de células não infectadas como diluídas para preparar uma solução de 10 microgramas por mililitro de gentamicina.Aos 30 minutos pós-infecção, adicione cuidadosamente 30 microliters da solução de gentamicina no prato para alcançar uma concentração final de microgramas de dois pontos e cinco por mililitro. Pipeta suavemente o conteúdo do poço para misturar e devolver o prato de cultura celular para a incubadora. Para colher, incline ligeiramente o prato e use cuidadosamente uma pipeta para remover toda a mídia do poço.Adicione um ponto cinco mililitros de água destilada e estéril ao poço. Após 30 segundos, transfira o lise de água resultante para um tubo de microcentrífugo de um ponto e cinco mililitros e vórtice vigorosamente por 10 segundos. Adicione microlitres de quatro pontos e cinco e 50 microlitadores do liseu de água a 450 microliters de água destilada e estéril para preparar as diluições de dez vezes e cem vezes.Brevemente vórtice para garantir a mistura completa. Adicione 50 microliters das amostras diluídas e cem vezes diluídas em placas de ágar de caldo lysogeny e espalhe usando um espalhador de placas. Para avaliar o LM emergente, extraia 10 microlitadores da mídia sobreposta do prato e divida-a em duas alíquotas de cinco microlitrais e tubos de microcrédito.Adicione cinco microliters de DMEM/FCS a uma alíquota e adicione cinco microliters de DMEM/FCS contendo cinco microliters por gentamicina mililitro à segunda alíquota como controle. Espere cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione 90 microliters de água estéril destilada a cada alíquota e vórtice os dois vigorosamente por 10 segundos.Em seguida, adicione 50 microliters da amostra em placas de ágar LB e espalhe usando um espalhador de placas. Armazene as placas em incubadoras de 37 graus celsius por dois dias antes de enumerar colônias Lm. Usando um contador celular automatizado, ajuste as células preparadas, cruas de dois a quatro e sete pontos, para a concentração de uma vez 10 para a sexta célula-por-mililitro.Adicione um mililitro da amostra a poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Infecte as células com um Lm inóculo preparado, correspondendo a uma multiplicidade de infecção de 50. Em um ponto e cinco horas após a infecção, em um tubo de microcentrífuga de um ponto e cinco mililitros cheio de 500 microliters de 4% PFA, coletar mídia do primeiro conjunto de poços e colocar o tubo no gelo.Para coletar Lm intracelular, adicione um mililitro de água destilada e estéril a cada poço. Após 60 segundos, transfira o lysato de água resultante para um tubo de microcentrífuga de um ponto e cinco mililitros com 500 microliters de 4% de PFA. Vórtice o tubo vigorosamente por 10 segundos e colocá-lo no gelo.Para os poços remanescentes, remova a mídia e substitua por um mililitro de DMEM/FCS por cinco microgramas por mililitro gentamicin para matar lm extracelular.Devolva prontamente o prato à incubadora. Após 30 minutos, remova a mídia e substitua-a por DMEM/FCS sem gentamicina. Depois de mais duas e quatro horas, colete mídia em lysates pela segunda e terceira vez aponta para os tubos e coloque-os no gelo para esfriar.Tubos de centrífuga a 10.000 vezes G por sete minutos. Usando uma pipeta, remova o supernasce sem perturbar a pelota. Adicione coquetel de coloração contendo 50 microliters de 4% pfa e 15 microliters de falo no tubo e misture para suspender cada pelota.Incubar tubos no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão FACS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo para misturar. Gire tubos na centrífuga a 10.000 vezes G por sete minutos.Remova o supernatante sem perturbar a pelota. Para uso imediato, suspenda cada pelota em 400 microliters de buffer FAX. Se armazenar para análise posterior, adicione 200 microliters de buffer FAX e 200 microliters de 4% PFA no tubo e misture para suspender.Usando as condições de infecção no breve tratamento com o antibiótico gentamicina para eliminar lm não internalizado, zero-ponto-um-cinco por cento do tipo selvagem Lm é recuperado após um ponto-cinco horas de co-incubação com macrófagos cultivados. Na co-incubação subsequente, houve um aumento de quatro vezes e sete pontos na recuperação do LM viável, que representam exclusivamente a proliferação intracelular. Observou-se perfil comparável para a cepa Lm que possui um prfA hipervirulento durante a infecção inicial, mas não entre três e seis HPI.Quando a prfA foi excluída da cepa Lm, há uma redução subsequente na recuperação da cepa após co-incubação prolongada. Quando a gentamicina é removida dos poços a seis HPI, o LM extracelular pode ser detectado uma hora depois para as cepas prfA do tipo selvagem e hipervirulenta, mas não para a cepa com prfA excluído. A sobreposição de mídia tanto macrófagos não infectados quanto infectados continha material particulado do tamanho de uma bactéria.No entanto, apenas a mídia de macrófagos infectados possuía sinais positivos de GFP dentro do tamanho do gating. Observou-se aumento do tempo no aparecimento de mico-positivo de falo-positivo Lm com macrófagos infectados. Ao emplacar os macrófagos no prato de cultura tecidual de 48 poços, deixe alguns poços sem células.Esses poços de controle sem células são então tratados exatamente como os poços contendo células, em termos da adição do patógeno, antibióticos, etc. para garantir que os sinais experimentais dependem da presença de células hospedeiras. Semelhante aos experimentos mostrados nas figuras um e três, fatores patógenos ou hospedeiros e ou pequenas moléculas podem ser testadas quanto ao seu impacto no efflux celular patógeno.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo geral para o estudo da invasão das células do hospedeiro por um agente patogénico, com foco...

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Este vídeo demonstra uma técnica de quantificação in vitro para determinar a infecção de macrófagos por Listeria monocytogenes pelo ensaio de unidade formadora de colônias. As colônias bacterianas na placa de ágar representam a população bacteriana intracelular que escapa do mecanismo de defesa do hospedeiro e sobrevive dentro dos macrófagos.

Quantificação da infecção bacteriana em células hospedeiras pelo ensaio da unidade formadora de colônias

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a capacidade de Porphyromonas gingivalis, uma bactéria patogênica anaeróbica, de aderir e invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Depois de infectar as células hospedeiras com as bactérias, as células hospedeiras são lisadas para liberar bactérias aderidas e internalizadas. Quando o lisado é plaqueado em um meio apropriado, a presença de colônias indica interações bactéria-célula hospedeira bem-sucedidas.

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Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

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