Multiplexação focada a estimulação de ultra-som com microscopia de fluorescência

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na mecanobiologia, como como as amostras biológicas respondem às forças mecânicas produzidas pela estimulação de ultrassom de baixa intensidade. A principal vantagem desta técnica é que permite que um experimentalista aplique forças mecânicas não invasivamente a uma amostra e meça vários perímetros biológicos em tempo real. Para começar, faça lentamente um furo de 12 milímetros na parte inferior de uma placa de cultura padrão de 35 milímetros usando uma broca de prensa vertical.

Uma vez perfurado, remova pedaços de plástico presos à parte inferior do prato usando uma lâmina, para criar uma superfície lisa no lado externo. Em seguida, aplique uma fina camada de epóxi de grau marinho ou cola na superfície inferior externa do prato. Em cima do adesivo, coloque uma película de poliéster de dois pontos e cinco mícrons de espessura, pressionando firmemente para garantir que o adesivo se espalhe uniformemente entre o filme e a espessa superfície plástica.

Puxe suavemente o filme de forma centrífuga com os dedos, para criar uma superfície plana. Uma vez que o adesivo tenha secado, enxágue brevemente o prato inferior do poliéster com 95% de etanol. Em seguida, UV esterilizar o prato colocando-o sob uma forte fonte de excitação UV de 254 nanômetros.

Ajuste a duração e intensidade para fornecer uma dose UV de aproximadamente 330 milímetros por centímetro quadrado. Em seguida, diluir uma mistura de proteína de matriz extracelular comercialmente disponível com o meio de cultura desejado em uma proporção de um a 100. Trabalhe no gelo para evitar a polimerização da matriz, e aplique rapidamente 100 microliters da mistura média no filme de poliéster.

Coloque a tampa de volta no prato para manter a esterilidade. Uma vez coberto, incubar os pratos de fundo de poliéster revestidos de matriz em uma cultura celular, incubadora tamponada com dióxido de carbono a 37 graus Celsius por seis a 12 horas. Após a incubação, aspire o excesso médio e semee diretamente a superfície com células na densidade desejada.

Coloque um tanque de água sob o objetivo de um microscópio vertical. Em seguida, utilizando componentes opomecânicos disponíveis comercialmente, posicione o titular da amostra entre o objetivo e o transdutor. Certifique-se de que as partes móveis e os atuadores das etapas de tradução estão fora do tanque ou acima da linha de água para evitar danos à água.

Em seguida, encha o tanque com água desionizada e desgasejada até o plano horizontal do porta-amostras, antes de utilizar o transdutor de imersão. Utilizando componentes opomecânicos não corrosivos e comercialmente disponíveis, certifique-se de que o transdutor em posição oblíqua em relação ao caminho óptico. Isso garantirá que quaisquer ondas refletidas sejam direcionadas para longe da amostra.

Ajuste a frequência do gerador de função para a frequência de pico nominal do transdutor. Em seguida, crie um pulso de tensão sinusoidal da duração desejada e frequência de repetição, usando o modo de estouro do gerador de função. Em seguida, ajuste a tensão de pico para um valor desejado.

Certifique-se de que a duração do pulso é menor do que o tempo decorrido entre dois pulsos consecutivos. Conecte a saída do gerador de função à entrada de um osciloscópio. Use o osciloscópio para confirmar que a forma de onda corresponde ao sinal desejado.

Em seguida, conecte a saída do gerador de função à entrada de uma potência de um amplificador RF de tamanho adequado. Utilizando uma sonda hidrofone que opera com uma faixa de frequência e intensidade acústica compatível com a do transdutor de ultrassom, leve cuidadosamente a ponta da sonda em foco dentro do campo de visão do objetivo na posição da amostra. Certifique-se de que tanto a sonda quanto o transdutor estejam imersos no banho de água e realizem um pré-alinhamento bruto do transdutor, posicionando visualmente seu eixo acústico em direção à sonda hidrofone.

Certifique-se de que a distância entre os dois corresponde à distância focal do transdutor. Não bata a ponta do hidrofone com qualquer objeto físico que não seja água, pois isso alterará seu revestimento e afetará a medição. Em seguida, conecte a saída do hidrofone a uma das entradas de sinal do osciloscópio.

Em seguida, conecte o gatilho de sincronização do gerador de função a outra entrada osciloscópio. Visualize ambos os sinais simultaneamente no osciloscópio. Em seguida, dirija o transdutor com poucos ciclos de ultrassom em um ciclo de baixa potência e baixa amplitude para evitar danificar a sonda.

Verifique com o fabricante do hidrofone condições seguras de operação para evitar danificar a ponta do hidrofone. Ajuste o botão de divisão S de acordo com o tempo de viagem do ultrassom da superfície do transdutor para o hidrofone. Procure um sinal hidrofone no osciloscópio após o gatilho de sincronização.

Em seguida, acione lentamente o transdutor usando um estágio XYZ motorizado ou manual. Posicione o transdutor na posição que se correlaciona com o sinal hidrofone máximo. Com o feixe agora alinhado, meça a amplitude de pico ao pico da saída hidrofone no osciloscópio para várias tensões que conduzem o transdutor.

Certifique-se de não exceder o limite de pressão do hidrofone. Substitua o meio de cultura da célula pelo tampão de imagem desejado contendo cinco micromolar de um corante sensoriado de células, sensível ao cálcio, como o Fluo-4 AM. Em seguida, incubar o prato de cultura em uma incubadora tamponada com dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, lave cuidadosamente as células com o mesmo tampão livre de corante.

Em seguida, coloque o prato no suporte de amostra. Excite as células usando iluminação de luz azul a 490 nanômetros. Ajuste a intensidade de excitação e a exposição da câmera para evitar branqueamento excessivo ou saturação de pixels.

Realize imagens de lapso de tempo usando um objetivo de imersão com uma longa distância de trabalho para melhor qualidade de imagem e para reduzir reflexões indesejadas. Aqui, as células de glioblastoma são mostradas em filme de poliéster revestido de matriz extracelular em meio de cultura padrão. Estas células foram incubadas com um repórter fluorescente sensível ao cálcio.

Nesta imagem, os pontos vermelhos representam células fluorescentes individuais, identificadas por meio de um software de processamento de imagem. Após a estimulação por 10 segundos com ultrassom, elevações robustas de cálcio foram visualizadas em muitas regiões de interesse. O número de regiões ativadas de interesse são mostrados aqui ao longo do tempo.

Após a ativação de 10 segundos com ultrassom, aproximadamente 70% das regiões foram encontradas acima dos valores de limiar definidos pelo usuário. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de alinhar o feixe de ultrassom antes de fazer a medição da fluorescência.