Name: Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a avaliar a citotoxicidade de células T CAR contra esferoides tumorais 3D em tempo real usando imagem avançada. Este método combina tecnologia de imagem com ensaio imunológico sensível para estudar eficácia terapêutica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa norueguês sob concessões #244388, #254817 e #284983; a sociedade de câncer norueguês (#6829007); A região de saúde norueguês sudeste sob Grant #17/00264-6 e #2016006.

1. geração de esferoides de linhagem de células de câncer colorretal
<ol><li>Monocamadas de células lavar HCT 116 (estàvel transfectadas para expressar o Cluster de diferenciação 19 (CD19) e proteína de fluorescência verde (GFP)) com fosfato tampão salino (PBS; 5 mL por uma de 25 cm2 ou 10 mL para um balão de2 de 75 cm). Adicionar a tripsina (0,5 mL por uma de 25 cm2 ou 1 mL para um balão de2 de 75 cm) e incube as células a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Verificar o desprendimento de células sob um microscópio e neutralizar a enzima de dissociação celular com meio de Roswell Park Memorial Institute 160 completo (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL por uma de 25 cm2 ou 20 mL para um balão de2 de 75 cm).</li>
	<li>Suspensão de células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender pipetando para cima e para baixo várias vezes com 5 mL de meio de 1640 RPM1 completo.</li>
	<li>Contar as células usando Trypan azul exclusão em um contador de célula compatível.</li>
	<li>Suspensão de células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender em meio RPMI para obter 5 x 103 células/mL.</li>
	<li>A suspensão de células de transferência para um reservatório estéril e dispense a 200 µ l/poço em 96-poço redondo fundo placas usando uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Transfira a placa para o aparelho automatizado de imagens dentro de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade).</li>
	<li>Logar o software de aquisição, selecione Agenda para adquirir | Lançamento adicionar navio | Digitalização na programação | Criar o navio: nova.</li>
	<li>
Selecione tipo de digitalização: esferoide. Selecionar os canais de interesse: fase + Brightfield (para acompanhar o crescimento de esferoides), verde (para que siga o sinal de tumor, aquisição tempo 300 ms) e vermelho (para seguir a apoptose, aquisição tempo 400 ms).
	<ol>
<li>Selecione a desejada ampliação: 10x.</li>
		<li>Escolha o modelo da placa e a sua posição na gaveta. Selecione a posição dos poços para a imagem. Digite a descrição do experimento: nome, tipo de células, o número de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a instalação de análise, selecione Adiar análise até mais tarde. Clique com o botão direito na linha do tempo e selecione a opção Definir selecionado varredura intervalo do grupo e defina Adicionar varreduras cada a 4 h e para um total de 24 h. definir a data inicial desejada (pelo menos 1 h após a incubação no aparelho automatizado de imagens).</li>
	<li>
Verifique a cada 2 dias para o crescimento de esferoides fazendo o login no software da imagem latente.
	<ol>
<li>Escolher a opção View recentes Scans e clique duas vezes sobre a experiência desejada. Selecione Brightfield no painel de canais de imagem e em seguida, use a ferramenta de características imagem de medida para medir o diâmetro dos esferoides. Demora 6 dias para um esferoide atingir o tamanho desejado: 0,5 mm de diâmetro. Adicione 50 µ l de meio RPMI completo por alvéolo no dia 4 para limitar o efeito de evaporação média.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. geração de células T de carro CD19
<ol><li>
Expansão de células T de carro CD19 Nota: Expressao de células CD19 carro T foi adquirido pela transdução de retroviral em massa do dador saudável PBMCs como descrito anteriormente,16. A codificação de construção retroviral para CD19 carro é um carro de segunda geração e consiste de fmc63 cadeia de scFv, dobradiça de CD8 e domínio transmembrana, um domínio co-estimulatória 4-1BB e, finalmente, um domínio CD3ζ.<ol>
<li>Para expandir, cultura a transduzidas T células na presença de grânulos magnéticos anti-CD3/28 com uma célula a relação do grânulo de 1:1 por 10 a 11 dias. Durante a expansão, as células são no meio completo (VIVO X 15, 5% reposição de soro e IL-2 humana recombinante de 100 U/mL). Nota: A densidade ideal para uma expansão eficiente é de 1 a 2 x 106 células/mL. Dependendo do número inicial, as células podem ser expandidas em balões (balões de 25 cm2 a 20 mL, frascos de 75 cm2 a 40 mL de volume total) em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade).</li>
		<li>Como um grupo de controle negativo para os seguintes ensaios, incluem não-transfectadas PBMCs (irá ser chamado Mock) do protocolo de expansão paralela às células CD19 carro T.</li>
		<li>No dia 3 em diante, adicionar meio fresco todos os dias e dividir as células em frascos de cultura mais se necessário.</li>
		<li>No dia 10-11, células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e combinar todas as células em um tubo de 50 mL e ressuspender as células em ~ 30 mL de mídia completa fresca.</li>
		<li>Coloca o tubo de 50 mL contendo as células ressuspensa num suporte magnético para separar as esferas magnéticas do meio de cultura.</li>
		<li>Espere 2-3 min para os grânulos coletar na lateral do tubo.</li>
		<li>Remova o meio de cultura com uma pipeta e transferência para um novo tubo sem tocar as zonas de coleção magnética do grânulo.</li>
		<li>Repita os passos sobre a remoção do grânulo (2.1.5–2.1.7) mais uma vez para limitar o número de grânulos em meio de cultura final.</li>
		<li>Resuspenda e contar as células, ajustar a densidade de 1 a 2 x 106 células/mL em meio completo.</li>
		<li>Descanse as células pelo menos 4 h até durante a noite. Então diretamente congelá-los para baixo a-80 ° C e transferir os frascos para um tanque de nitrogênio líquido, no dia seguinte para armazenamento a longo prazo. Alternativamente, um pode prolongar o resto até durante a noite para uso imediato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controle de expressão de CD19 carro na primárias células T
	<ol>
<li>Conte o número de pilhas de T expandidos como os números podem variar ligeiramente depois de cultura durante a noite ou moderadamente congelamento/descongelamento.</li>
		<li>Transferência de 5 x 105 células de ambos os carro CD19 e Mock as células T primárias para separar os tubos de citometria de fluxo.</li>
		<li>Lavar as células com 200 μL de tampão de fluxo (2% FBS em PBS) e centrifugar os tubos a 500 x g durante 5 min. Repita as etapas de lavagem para se livrar de qualquer artefatos causados por meio de cultura.</li>
		<li>Prepare o anticorpo primário (biotina cabra anti-Mouse IgG, F(ab') ₂ fragmento específico), realizando a diluição de 1: 200 em Buffer de fluxo.</li>
		<li>Ressuspender as células em 100 μL de mistura de anticorpos pelo tubo e incubar no gelo por 15 min. Repita a etapa anterior de lavar duas vezes para remover o excesso anticorpo.</li>
		<li>Prepare o anticorpo secundário (Streptavidin-PE) como a diluição de 1: 400 em Buffer de fluxo.</li>
		<li>Ressuspender as células em 100 μL de mistura de anticorpos pelo tubo e incubar no gelo por 15 min. Repita a etapa anterior de lavar duas vezes para se livrar de anticorpo em excesso.</li>
		<li>Ressuspender as células em 200 μL de tampão de fluxo por tubo e analisá-lo em um citômetro de fluxo.</li>
		<li>As pilhas de T zombar de uso para montar o portal positivo e negativo e analisar carro CD19 transfectadas células T em conformidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D Tumor Spheroid matar ensaio
<ol><li>
Depois de 6 dias ou uma vez esferoides atingir o tamanho desejado, retirar a placa da incubadora. Usando uma pipeta multicanal, delicadamente retire 100 µ l/poço de meio completo RMPI 1640 as chapas de esferoide.
	<ol>
<li>Para esta etapa, as dicas para o interior do ângulo parede da placa de 96 poços, evitando o contato com o fundo do poço para minimizar a perturbação dos esferoides. Permanecendo o volume deve ser em torno de 100 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma solução de 1: 200 de anexina V vermelho misturando-se 50 µ l de anexina V vermelho com 9,95 mL de meio RPMI 1640 completo.</li>
	<li>Adicione 100 µ l/poço da 1: 200 solução anexina V vermelho.</li>
	<li>Transfira a placa para uma incubadora (37° C, 5% de CO2, 95% de umidade) por 15 min.</li>
	<li>As células T de carro CD19 transduzidas em um tubo de 15 mL e centrífuga-los a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender pipetando para cima e para baixo várias vezes com 2 mL de meio de 1640 RPM1 completo da colheita.</li>
	<li>Contar as células usando Trypan azul exclusão em um contador de célula compatível.</li>
	<li>Suspensão de células de centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender em meio RPMI para obter 2 x 105 células/mL.</li>
	<li>A suspensão de células de transferência para um reservatório estéril e dispense 100 µ l/poço em 96-poço redondo placa de esferoide inferior usando uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Transferi a placa de volta para o aparelho automatizado de imagens dentro de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade).</li>
	<li>
Logar o software de aquisição, selecione Agenda para adquirir.
	<ol>
<li>Botão direito do mouse na linha da tempo de varredura e selecione Editar linha do tempo. Botão direito do mouse sobre o grupo de verificação e excluí-lo. Botão direito do mouse na linha do tempo e selecione a opção Definir selecionado varredura intervalo do grupo e defina Adicionar varreduras cada de 1,5 h e para um total de 24 h.</li>
		<li>Defina o tempo de partida desejado (pelo menos 1 h após a incubação no aparelho automatizado de imagens). Selecione salvar agenda varreduras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise de imagem automatizado
<ol><li>Entrar em aquisição, escolha a opção View recentes Scans e selecione a opção Iniciar análise . Selecione criar nova definição de análise | Tipo de análise: Spheroid. Assinale os canais de imagem para analisar (fase + Brightfield, verde e vermelho).</li>
	<li>Selecione pelo menos 10 imagens representativas: normalmente, 1 por Estado e pelo menos 3 pontos de tempo (início, meio e fim da aquisição).</li>
	<li>Visualização padrão analisar procedimento na pilha toda a imagem.</li>
	<li>Modifica os parâmetros para brightfield máscara. Parâmetros típicos são: sensibilidade 10, buraco preencher 1.000 µm2, min área 1.000 µm2. Pré-visualize na pilha toda a imagem e verifique que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.</li>
	<li>Modifica os parâmetros para máscara verde (GFP). Parâmetros típicos são: segmentação de Cartola com raio 200 µm e limiar 3 tos, borda cindido, buraco preencher 5.000 µm2, ajustar tamanho -2 pixels, área min 3.000 µm2. Pré-visualize na pilha toda a imagem e verifique que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.</li>
	<li>Modifica os parâmetros para máscara vermelha (anexina V). Parâmetros típicos são: segmentação de Cartola com raio 150 µm e limiar 2 CDU, borda cindido, buraco preencher 5.000 µm2, ajustar tamanho 0 pixels, área min 1.000 µm2. Pré-visualize na pilha toda a imagem e verifique que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.</li>
	<li>
Lançamento do analisador.
	<ol>
<li>Uma vez que a análise é feita, extrair a medição de interesse. Selecione o arquivo analisado e, em seguida, a opção Gráfico métricas . Selecione as métricas de interesse, a verificação e o poço. Normalmente, intensidade total de vermelha e verde dentro dos limites do brightfield dar as medições mais precisas, restringindo o sinal de fluorescência para os limites de esferoides determinado pela máscara brightfield (Figura 3). Extrair métricas selecionadas em vários formato de arquivo, clicando em "Export Data".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceder à extração das imagens e filmes, selecionando o arquivo analisado e em seguida, selecione a opção exportar imagens e filmes . Duas opções estão disponíveis, ou "conforme exibido" para recuperar imagens e filmes como visto sobre o software de imagem (imagens geralmente compostas), ou "como armazenado" para recuperar os dados brutos para análise externa através do software de terceira parte.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
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<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
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<li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2016.3467?text=abstract">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li>
<li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-Formation+%28Colonosphere%29+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li>
<li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metastatic+Microenvironment%3A+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
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<li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncolology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).</li>
<li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O uso de esferoides como uma ferramenta inovadora para validar o tratamento do câncer futuro tornou-se um campo de interesse crescente nos últimos anos. Esferoides representam uma etapa intermediária entre o clássico 2D análise in vitro e in vivo-avaliação. O método ainda detém muita promessa em relação a sua potência em termos de tumor micro-ambiente imitando assim como gene de perfil7. O protocolo apresentado nesta publicação foi adaptado de Saheen et al.11 para ...

Transferência de células adotivos (ACT) representa o tratamento de câncer na próxima geração. Ele conta com a injeção de células efetoras (células T ou NK) em um paciente. Estas células podem ser geneticamente modificadas com um receptor que irá guiá-los até seu alvo, o tumor e destruí-lo. Recentemente, esta abordagem foi mostrada para ser viável quando um Receptor de antígeno Quimérico (carro) dirigido contra o marcador de célula B CD19 foi introduzido nas células do paciente T matar seu câncer1. No caso do carro, que é um receptor artificial, o projeto consiste em fragmentos de anticorpos específicos, o antigénio vinculativa domínio reduzido a um fragmento de variável entidade designada de cadeia única (scFv), ligada aos domínios de sinalização de células T. Embora haja vários designs, as versões mais comumente usadas referidos como segunda geração desenhos dos carros, consistem de CD3z para sinalização de TCR e um domínio co-estimulatória (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) 1 , 2. o campo da imunoterapia dirigido a maioria de sua atenção para esta nova forma do acto quando células CD19 carro-T eficazmente trataram numerosos pacientes com neoplasias malignas de células B3,4. Após este sucesso, os pesquisadores tentaram explorar os projetos similares ao direcionamento outros resumos para tumores sólidos com sucesso limitado. Infelizmente, a escassez de antígenos específicos do tumor e o microambiente que tumor mais duras processado carro T células menos eficaz para tumores sólidos5.
Atualmente, as estratégias mais comumente usados em vitro validação dependem bidimensionais (2D) sistemas que abordam apenas um fragmento dos desafios já mencionado tumor sólido. Classicamente, 2D em vitro sistemas envolvem uma mistura de células T de carro e linhas de células de câncer de alvo como monocamadas para avaliar a funcionalidade e a especificidade dessas células efetoras. Embora estas estratégias são peças importantes e vitais dos estudos, eles não levam em consideração a morfologia complexa e os estrutura tridimensional (3D) do câncer células6. As células cancerosas, cultivadas em sistemas 3D, conhecido como esferoides, adquirem novas características fenotípicas através de alterações no gene expressão perfil7, que possam influenciar o reconhecimento pelas células efetoras redirecionada. Birgersdotter e colegas demonstraram que uma linhagem de células Hodgkin Linfoma (HL) quando só cresceu em um modelo 3D da cultura adquire um perfil de expressão do gene que é semelhante ao tumor primário amostras8. Portanto, esferoides ou 3D semelhante cultura oferta de metodologias mais relevante em modelos de vitro em oposição aos sistemas 2D padrão. Tais sistemas são também semelhantes aos estudos in vivo, que são vistos como a etapa final no processo de validação de um determinado carro. Considerando que os sistemas 2D não imitar a morfologia de clusters de câncer, esferoides oferecem formações similares para avaliar a funcionalidade das células T de carro antes de modelos in vivo. Em um estudo, Pickl et al identificaram que um modelo de esferoide do receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) superexpressão células cancerosas demonstrado perfis de sinalização semelhantes a modelos in vivo9. Isto suporta mais que esferoides oferecem mais relevantes e close-para-na avaliação de vivo das células T de carro. Além disso, validação de células T carro contra esferoides pode ajudar a avaliar sua eficácia mais criticamente e impedir que alguns dos projetos movendo-se prematuramente para estudos in vivo10; contribuindo assim, para pesquisas eticamente preocupada sacrificando menos animais. Além disso, protocolos utilizando esferoides não são mais caros do que os sistemas 2D clássicos e muito mais rápido em comparação com estudos clássicos na vivo . Tomados em conjunto, pode-se prever que a inclusão de estudos esferoide em breve se tornará uma prática padrão para vincular estudos in vitro e in vivo.
Aqui, apresentamos a preparação de esferoides da linhagem de células de câncer de cólon HCT 116. Esta linha de celular foi modificada para expressar a molécula CD19 humana para torná-lo sensível às células CD19 carro T e para fornecer uma avaliação clara da matança usando uma construção de carro clinicamente validada.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><<td>strong>Número do lote: RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; frascos de área de crescimento</td><td>VWR</td><td>430639</td><td>Número do lote: 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; frascos de área de crescimento</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>Número do lote: 3718006</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Número do lote: SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Número do lote: 1926384</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Número do lote: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Número do lote: 1904924A</td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano, 0,4%</td><td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td><forte>Número do lote:</forte> 1886513</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços, fundo redondo</td><td>VWR</td><td>734-1797</td><td><forte>Número do lote:</forte> 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Ativador Humano T CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 com Gentamicina L-Gln, Vermelho de Fenol, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Número do lote: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Substituição do soro de células imunes</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Número do lote: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Número do lote: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Número do lote: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Reservatório de reagentes</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td>Número do lote: 89094-672</td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td>Número do lote: 19317044</td></tr><tr><td>anti-humano CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Número do lote: 4016990 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>Biotina-SP (espaçador longo) AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-rato IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Número do lote: 129474: RRID: AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>Número do lote: 5191579: RRID: </forte> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Linha de Carcinoma Colorretal</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de matança spheroid por pilhas de t do carro

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Imunoterapia tornou-se um campo de crescente interesse na luta contra o câncer caso contrário intratável. Entre todos os métodos de imunoterapia, receptor de antígeno Quimérico (carro) Redirecionado células T obtidas os resultados mais espetaculares, em particular com leucemia linfoblástica aguda-B Pediátrica (B-ALL). Métodos de validação clássica de células T do carro dependem o uso de especificidade e de ensaios de funcionalidade das células T de carro contra células alvo em suspensão e em modelos de enxerto. Infelizmente, as observações feitas in vitro são muitas vezes dissociadas do resultados obtidos na vivo e um monte de esforço e animais poderia ser poupado, adicionando mais um passo: o uso da cultura 3D. A produção de esferoides de potencial nas células-alvo que imitam a estrutura 3D das células do tumor, quando eles são incorporados no modelo animal representa uma alternativa ideal. Aqui, nós relatamos um método acessível, confiável e fácil de produzir esferoides de uma linha celular colorretal transduzidas como uma ferramenta de validação para a terapia celular adotiva (exemplificada aqui por pilhas de T de carro CD19). Este método é acoplado com um avançado sistema de geração de imagens ao vivo que pode acompanhar o crescimento de esferoide, efetoras células citotoxicidade e tumor apoptosis da pilha.

Como pode ser visto na Figura 1, é fundamental verificar por citometria de fluxo, o nível de expressão de CD19 carro em células T (figura 1A) e o nível de CD19 em linhas de células de tumor HCT116 (figura 1B). A Figura 2 exemplifica o resultado de um experimento típico esferoide. Automatizada de imagem aparelho tira fotos em quatro diferentes canais: campo claro, fluores...

Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imunoterapia sobre a avaliação da citotoxicidade das células imunes contra células tumorais de estrutura 3D. As principais vantagens deste método são que ele é simples e combina tecnologia avançada de imagem e um ensaio imunológico sensível. Comece lavando a linha de interesse das células cancerígenas colorretais com cinco mililitros de PBS e removendo as células do fundo do frasco com 0,5 mililitros de trippsina por cinco minutos a 37 graus Celsius.Após confirmar o desprendimento sob um microscópio, neutralize a enzima de dissociação celular com 10 mililitros de meio completo e colete as células por centrifugação. Resuspend a pelota em cinco mililitros de meio fresco completo para contagem e resuspensar as células a uma concentração de 1,5 vezes 10 para a terceira células por concentração mililitro. Em seguida, semente 200 microliters de células em cada poço de 96 poços de placa de fundo redondo e coloque a placa em um aparelho de imagem automatizado dentro de uma incubadora Celsius de 37 graus com 5%de CO2 e 95% de umidade.Faça login no software de aquisição do aparelho e selecione Agendar para Adquirir, Lançar Adicionar Embarcação, Digitalizar no Cronograma e Criar Embarcação Nova. Em seguida, selecione o tipo de varredura Spheroid e selecione os canais de interesse apropriados de campo brilhante e fluorescência. Defina a ampliação em 10 vezes e selecione o modelo da placa e sua posição dentro da gaveta do aparelho de imagem.Selecione a posição dos poços a serem imagens e digite a descrição do experimento, incluindo o nome, o tipo de células e o número de células. Para a configuração de análise, selecione Analisar deferimento até mais tarde, clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e selecione Definir intervalo de grupo de varredura selecionado e defina adicionar varreduras a cada quatro horas e para um total de 24 horas. Em seguida, defina o horário de partida para pelo menos uma hora após a incubação no aparelho de imagem automatizado.Para verificar o progresso do crescimento esferoide, a cada dois dias, faça login no software de imagem e selecione Exibir varreduras recentes. Clique duas vezes no experimento de interesse e selecione Brightfield no painel Canais de imagem. Em seguida, use a ferramenta Measure Image Features para medir o diâmetro dos esferoides, adicionando 50 microlitros de meio completo por poço no quarto dia para limitar quaisquer efeitos médios de evaporação.Quando os esferoides atingirem o tamanho experimental apropriado, angule cuidadosamente a placa e use uma pipeta multicanal para remover suavemente 150 microliters de meio completo de cada poço sem perturbar os esferoides. Em seguida, substitua o meio descartado por 50 microlitadores de uma solução de um a 200 de Anexo V Vermelho e coloque a placa em uma incubadora de cultura celular por 15 minutos. Centrífuga transduziu células CAR CD19 T em um tubo cônico de 15 mililitros e resuspenda a pelota em dois mililitros de meio completo.Após a contagem, dilui as células para duas vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média completa. Em seguida, adicione 100 microliters de células CAR CD19 T a cada poço contendo esferoides e devolva a placa ao aparelho de imagem automatizado. No software de aquisição, selecione Agendar para Adquirir e clique com o botão direito do mouse na linha do tempo da varredura.Selecione Editar linha do tempo e clique com o botão direito do mouse no grupo de varredura para excluí-lo. Clique com o botão direito do mouse na linha do tempo novamente e selecione Definir intervalo de grupo de varredura selecionado e definir Adicionar varreduras a cada 1 hora e meia e para um total de 24 horas. Em seguida, defina a hora de início da imagem para pelo menos uma hora após o início da incubação no aparelho de imagem automatizado e selecione Salvar varreduras de agendamento.Para análise automatizada de imagens, no software de varredura, selecione Exibir varreduras recentes e análise de lançamento. Selecione Criar nova definição de análise e tipo de análise Spheroid e definir os canais de imagem a serem analisados. Selecione pelo menos 10 imagens representativas e visualize o procedimento de análise padrão em toda a pilha de imagens.Modifique os parâmetros para a máscara de campo brilhante e visualize a pilha de imagens, confirmando que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão. Modifique os parâmetros para máscara verde e visualize a pilha de imagens para confirmar que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão. Modifique os parâmetros para máscara vermelha e visualize a pilha de imagens para confirmar que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.Tome cuidado para obter o melhor sinal sobre ruído e sensibilidade sobre as relações de especificidade, tendo em mente que você não será capaz de encontrar um conjunto de parâmetros que permitirá capturar cada evento em cada ponto de tempo. Em seguida, lance o analisador. Quando a análise estiver concluída, extraia a medição de interesse e selecione o arquivo analisado e a opção métricas de gráfico.Selecione as métricas de interesse, a varredura e o poço. Clique em Exportar dados para extrair as métricas selecionadas em vários formatos de arquivo. Em seguida, para extrair as imagens, selecione o arquivo analisado e selecione Exportar Imagens e Filmes.A expressão CAR CD19 em células T transduzidas e a expressão CD19 em células cancerígenas colorretais transduzidas podem ser confirmadas por citometria de fluxo. Aqui, o resultado de um típico experimento esferoide pode ser observado. Ao contrário das células T simuladas, as células CD19 CAR T são capazes de matar especificamente os esferoides derivados da linha de células cancerígenas colorretais, diminuindo consideravelmente o número de células tumorais vivas.O rastreamento da evolução dos sinais totais verdes e vermelhos dentro dos limites esferoides ao longo do tempo revela que logo após a injeção de células CAR T cd19, o tamanho dos esferoides diminui rapidamente à medida que o sinal de apoptose aumenta rapidamente. Após este procedimento, outros métodos como ensaios de toxicidade, ensaios de migração celular ou medidas de estrutura esferoide podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre rastreamento de drogas, motilidade celular T ou formação de spheroid, respectivamente.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de desafio tumoral repetitivo para avaliar o potencial de morte tumoral repetitiva das células T CAR durante altas cargas de células tumorais. Além disso, as células T CAR podem ser analisadas usando citometria de fluxo para determinar as diferentes subpopulações de células T CAR na amostra.

Ensaio de desafio de tumor repetitivo: um ensaio de cultura in vitro para avaliar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para potencial de morte de tumor repetitivo

Este vídeo demonstra um método para monitorar a atividade das células T CAR contra células cancerígenas por meio de medições de impedância elétrica em tempo real. O rastreamento de mudanças na impedância avalia a eficácia das células T CAR na indução da citólise de células cancerígenas, fornecendo informações sobre suas capacidades citotóxicas.

Um ensaio de citólise in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T CAR

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro avaliando os efeitos citotóxicos das células T CAR em esferoides tumorais 3D que expressam proteínas fluorescentes. Esta avaliação utiliza a sonda fluorescente vermelha Anexina V, que se liga a resíduos de fosfatidilserina expostos no folheto externo de células cancerígenas apoptóticas após interações com células T CAR. A fluorescência vermelha emitida pela sonda ajuda a distinguir essas células das saudáveis que emitem fluorescência verde.

Um ensaio in vitro para avaliar a citotoxicidade de células T CAR contra esferoides tumorais

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para validar a atividade das células T do receptor de antígeno quimérico (CAR). As células do linfoma de células B que expressam o antígeno CD19 e a luciferase citoplasmática são co-cultivadas com células T CAR específicas para CD19. A ligação do CAR ao CD19 em um tumor induz as células T CAR a liberar citocinas e toxinas que causam citotoxicidade das células tumorais. A atividade das células T CAR é avaliada pela quantificação da citocina liberada e...

Um ensaio in vitro para avaliar a atividade antitumoral de células T CAR específicas para tumores

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Aprenda a avaliar a citotoxicidade de células T CAR contra esferoides tumorais 3D em tempo real usando imagem avançada. Este método combina tecnologia de imagem com ensaio imunológico sensível para estudar eficácia terapêutica.

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

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