Name: Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a analisar a motilidade direcional de microglia em fatias agudas de cérebro de camundongos usando microscopia de dois fotões. Este método permite medir respostas celulares a ATP e serotonina em tempo real.

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Agradecemos a célula e tecido Imaging facilidade do Institut du Fer à Moulin, onde foram realizados todos os aquisição de imagem e análise. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Centre National de la Recherche Scientifique, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Ciências da Université de Sorbonne e por concessões da Sorbonne universidades-Pierre et Marie Curie University ( Programa Emergence-UPMC 2011/2014), da Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, a Fondation de France, a Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", o Ministério francês da pesquisa (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 e o d'Avenir Investissements programa "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) e uma pesquisa colaborativa em programa de neurociência computacional, Science Foundation/francês nacional Agência Nacional para a pesquisa (número: 1515686). Todos os autores são filiados à investigação de grupos que são membros da escola de Paris de neurociência (PEV) e do Labex Bio-Psy. Fe é um estudante de doutorado filiado a Sorbonne Université, Collège doutoral, F-75005 Paris, França e é financiado pelo Labex Bio-Psy. V.M. é bolsista de pós-doutoramento financiada pela pesquisa colaborativa em programa de neurociência computacional, Science Foundation/francês nacional Agência Nacional para a pesquisa (número: 1515686). Os autores graças a Marta Kolodziejczak que participaram no início do projeto.

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<li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Mantendo-se, ao contrário de em dissociada ou organotypic fatia de cultura, uma integridade estrutural com ajustes de rede limitada, fatias de cérebro aguda permitem aos pesquisadores estudar microglia no seu ambiente fisiológico. No entanto, uma das principais limitações é o fato de que o procedimento de corte cria lesões que rapidamente podem comprometer a viabilidade de neurônios, particularmente no cérebro adulto. Como microglia são particularmente reactivo ao dano celular, é importante limitar a morte celular neuron...

Microglial células são macrófagos residentes do cérebro e desempenham um papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas1,2. Eles têm uma morfologia altamente ramificada e são constantemente ampliar e retraindo seus processos3,4. Esse comportamento de "digitalização" é acreditado para ser relacionadas e necessárias para o levantamento de seus arredors. A plasticidade morfológica da micróglia é expressa em três modos. Primeiro, alguns compostos rapidamente modulam microglial morfologia: a adição de ATP5,6 ou5,de NMDA7 no meio de banho fatias cerebral aguda aumenta a complexidade das ramificações microglial, Considerando que a noradrenalina diminui-lo6. Estes efeitos são diretamente mediados por receptores de microglial (para ATP e norepinefrina) ou requerem uma liberação de ATP de neurônios (NMDA). Em segundo lugar, a velocidade de crescimento e retração de processos microglial, chamado de "vigilância", ou motilidade pode ser afetada por fatores extracelulares8, homeostase interrupções9,10ou mutações9, 10,11. Em terceiro lugar, para além destas alterações isotrópicas de morfologia e motilidade, microglia têm a capacidade de estender seus processos direcionalmente em direção a uma pipeta entregando ATP3,5,12, 13 , 14, na cultura, em fatias de cérebro aguda ou in vivo, ou entregando 5-HT cerebral aguda fatias15. Tal crescimento orientado de processos microglial, também chamado de motilidade direcional, foi descrito pela primeira vez como uma resposta a uma lesão de laser local3,4. Assim, fisiologicamente, pode ser relacionado com a resposta à injúria ou necessária para o direcionamento de processos microglial para sinapses ou regiões do cérebro que exigem poda durante desenvolvimento15,16, ou em fisiológicas17 ,18,19 ou situações patológicas9,18,19,,20 em idade adulta. Os três tipos de alterações morfológicas dependem de diferentes mecanismos intracelulares11,13,20, e um determinado composto não necessariamente modulam todas elas (por exemplo, NMDA, que age indiretamente na microglia, tem um efeito sobre a morfologia, mas não induz a motilidade direcional5,7). Portanto, quando, com o objetivo de caracterizar o efeito de um composto, uma mutação ou uma patologia na microglia, é importante caracterizar os três componentes da sua plasticidade morfológica. Aqui, descrevemos um método para estudar o crescimento direcional de processos microglial na direção de uma fonte local de composto, que é, aqui, ATP ou 5-HT.
Existem vários modelos para estudar a atração dos processos microglia: culturas primárias em ambiente 3D6,18,19, fatias do cérebro aguda6,13,15e na vivo imagem3,13. A abordagem em vivo é o melhor para preservar o estado fisiológico da micróglia. No entanto, intravital imagem de regiões profundas exige procedimentos cirúrgicos complexos e, portanto, muitas vezes é limitado às camadas corticais superficiais. O uso de cultura primária microglia é a técnica mais fácil de testar um grande número de condições, com um número limitado de animais. No entanto, é impossível obter a mesma morfologia celular como vivo, e as células perdem suas interações fisiológicas com neurônios e astrócitos. Fatias de cérebro aguda representam um compromisso entre essas duas abordagens. Este modelo permite aos pesquisadores estudar estruturas cerebrais que são de outra maneira difíceis de alcançar e para imagem com alta resolução em vivo e para investigar fatias de estágios neonatais, Considerando que a microscopia transcraniana é realizada principalmente na idade adulta. Finalmente, ele torna possível observar em tempo real os efeitos da aplicação da droga local e de repetir experiências enquanto estiver usando um número limitado de animais. No entanto, um problema com fatias de cérebro aguda é o tempo limitado (algumas horas), durante o qual as células permanecem vivas, nomeadamente para fatias de ratos mais de duas semanas e a possível mudança da morfologia microglia sobre tempo21,22 .
Aqui, descrevemos um protocolo para preparar fatias aguda do cérebro de jovens e adultos Cx3cr1GFP / + ratos até dois meses de idade, com a preservação da microglia morfologia e motilidade durante várias horas. Em seguida, descrevemos como usar essas fatias para estudar a atração dos processos microglial para compostos como o ATP ou 5-HT.

<table><tbody><tr><td><forte>para preparação de pipetas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Clark Borosilicato Capilares de Parede Fina</td><td>Harvard Aparelho</td><td>30-0065</td><td>Borosilicato Parede Fina sem Filamento, 1,5 mm OD, 1,17 mm ID, 75 mm L, Pkg. de 225</td></tr><tr><td>DMZ Extrator Universal</td><td>Zeitz Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>para soluções</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de colina</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto</td> de magnésio <td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td>de ácido L-ascórbico</tr><tr><td>1 M (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio SigmaUltra >99,0% (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>MilliQ</td><td></td><td>para todas as soluções</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>for preparação de fatias</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x 200 mL placas</td><td></td><td></td><td></td>de cristalização</tr><tr><td>80 mL Pyrex béquer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antlia-3C Bomba peristáltica digital DD</td><td>Biolab</td><td>178961</td><td>Para perfusão de camundongos e perfusão em câmara de 2 fótons (aCSF)</td></tr><tr><td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td><td>Air Liquide France Industrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dolethal</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal 50 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>Papéis de filtro (Whatman)</td><td>Papel</td><td>de</td><td>filtro qualitativo Sigma WHA1001042 Whatman, Grau 1 (Tamanho do poro: 11&micro; M)</td></tr> <tr><td>Tesouras Finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-60</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de alimentos 10 cm de diâmetro, 8 cm de altura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cola (etil cianoacrilato)</td> <td>Loctite</td><td>super cola 3 power flex</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de Hipócampo (espátula)</td> <td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10099-15</td><td>A maior extremidade tem que ser inclinada a 90&deg;</td></tr><tr><td>Pinça de íris</td><td></td><td></td> de gelo (curvada)Moria MC31 <td></td></tr><tr><td>Tecido de limpeza de lentes</td><td>THOR LABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td></td><td></td> de malha de nylon <td>diâmetro 7 cm</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>72000</td><td>Para a lâmina</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>do<td>bisturi</td></tr> do fatiador <tr><td></td> Suporte de interface de fatia <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>feito em casa, o arquivo para impressão 3D é fornecido em Tesoura Cirúrgica de Material</td></tr><tr><td>Suplementar - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Fatiador Vibratório</td><td>Thermo Scientific</td><td>720-2709</td><td>Modelo: HM 650V (Micrótomo de lâmina vibratória)</td></tr> <tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td>Conjunto em 32 &deg; C (primeira etapa de recuperação)</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>para imagens de fatias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&times; 25 Objetiva de imersão em água de 0,95 NA</td><td>Leica Microsystems (Alemanha)</td><td>HCX Irapo</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical MP5 de 2 fótons com scanners ressonantes (8 kHz) e dois detectores híbridos HyD</td><td>Leica Microsystems (Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica digital Antlia-3C</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td><td>Para perfusão em câmara de 2 fótons com aCSF</td></tr><tr><td>Carbogen 5% CO2/95% O2</td><td>Air Liquide France Industrie</td><td>I1501L50R2A001</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra2 Ti: laser de safira</td><td>Coerente (Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas de transferência descartáveis, boca larga</td><td>ThermoFischer científico</td>, <td>por exemplo: 232-11</td><td>5,8 mL com ponta de aleta, mas cortamos (aprox. 7 cm) para ter um filtro de emissão de boca de 4 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>SP680</td><td>Leica Microsystems (Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cubo fluorescente contendo um filtro de emissão 525/50 e um filtro dicróico 560 (para coleta de fluorescência)</td><td>Béquer de vidro da Leica Microsystems (Alemanha)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>com 50 mL de ACSF para manter a perfusão constante da fatia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aquecimento</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>Automatic Heater Controller TC-324B</td><td>para manter a solução de perfusão a 32 > C</td></tr><tr><td>câmara</td><td></td><td></td> de perfusão <td>caseira, o arquivo para impressão 3D é fornecido em suporte de fatia de material suplementar</td></tr><tr><td>("harpa")</td><td></td><td></td>feito <td>em casa: grampo de cabelo feito de platina com os dois ramos unidos por fios de nylon paralelos</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td> Comentários</td></tr><tr><td>para estimulação de fatias </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato dissódico sal hidratado (ATP)Sigma</td><td></td> <td>A-26209</td><td>a ser preparado extemporaneamente : 1 mg/mL (3 mM) solução estoque preparada no dia do experimento, mantida a 4 &graus; C (algumas horas) e diluído antes do uso</td></tr><tr><td>Fluoresceína (opcional)</td> <td>Sigma</td><td>F-6377</td><td>use em 1 &micro; M final</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Luigs e Neumann</td><td>SM7</td><td>conectado ao buraco da micropipeta</td></tr><tr>Suporte <td></td><td></td> de<td>micropipeta</td><td>igual à eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Cloridrato de serotonina</td><td>Sigma</td><td>H-9523</td><td>alíquotas de solução estoque 50mM em H20 mantida a -20 &deg;C. 500 &micro; M preparada no dia do experimento.</td></tr><tr><td>Seringa 5 mL (sem agulha)</td><td>Terumo medical products</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo transparente</td><td>Fischer Scientific</td><td>11750105</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade; Tygon&trade; E-3603 Tubulação não DEHP</td></tr> <tr><td> Nome</td> <td> Empresa </td> <td> Número de catálogo <</td> <td>strong > Comentários </td></tr> <tr><td> para análise de imagem </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fiji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td>Schindelin, J. et al Nat. Métodos (2012) doi 10.1038</td></tr><tr><td>Icy</td><td>Institut Pasteur</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org</td><td>de Chaumont, F. et al. Nat. Métodos (2012</td></tr><tr><td>)Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários<</td></tr><tr><td>strong>camundongos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-GFP camundongos</td><td>Jung et al, 2000</td><td></td><td>macho ou fêmea, P3 a 2 meses de idade; Retrocruzamos esses mouses no fundo 129SV.</td></tr><tr><td>Camundongos CX3CR1creER-YFP</td><td>Parkhurst et al 2013</td><td></td><td>machos ou fêmeas, P3 a 2 meses de idade; retrocruzamos esses camundongos no fundo 129SV.</td></tr></tbody></table>

imagem de dois fotões de atração microglial processos para atp ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial são residentes inatas imunes células do cérebro que constantemente digitalizar seu ambiente com seus longos processos e, após o rompimento da homeostase, passam por rápidas mudanças morfológicas. Por exemplo, uma lesão do laser induz em poucos minutos um crescimento orientado de processos microglial, também chamado de "motilidade direcional", para o local da lesão. Um efeito similar pode ser obtido através da entrega localmente ATP ou serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]). Neste artigo, descrevemos um protocolo para induzir um crescimento direcional de processos microglial em direção a uma aplicação local de ATP ou 5-HT em fatias aguda do cérebro de ratos jovens e adultos e a imagem esta atração ao longo do tempo por microscopia do multiphoton. Propõe-se um método simples de quantificação com software de análise de imagem livre e open-source. Um desafio que ainda caracteriza fatias cerebral aguda é o tempo limitado, diminuindo com a idade, durante o qual as células permanecem em um estado fisiológico. Este protocolo, portanto, destaques algumas melhorias técnicas (secção interface ar-líquido médio, imagem de câmara com uma dupla perfusão) visam otimizar a viabilidade de células microglial durante várias horas, especialmente em fatias de ratos adultos.

Este protocolo descreve um método para induzir, observar e quantificar o crescimento orientado de processos microglial em direção a um composto aplicado localmente, por exemplo, fatias de ATP ou 5-HT, no cérebro agudo de jovem ou adulto (pelo menos até dois meses de idade) ratos. Entre os fatores que contribuem para a manutenção de fatias de cérebro de animais adultos, em um estado saudável durante várias horas, é o uso de duas ferramentas projetado para otimizar a sobrevivência da pilha ...

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Para caracterizar totalmente um fenótipo microglial, é importante abordar a motilidade basal e direcional. Este protocolo pode ser usado para testar a motilidade direcional da microglia por imagens de dois fótons em fatias cerebrais de camundongos, usando interface de impressão 3D personalizada e câmaras de perfusão. Demonstrando o procedimento estarão Fanny Etienne, uma estudante de doutorado, e Vincenzo Mastriolia, um pesquisador de pós-doutorado, ambos de nossos laboratórios.Pelo menos 30 minutos antes da dissecção, comece a borbulhar 70 mililitros de fluido cerebrospinal artificial de colina, ou aCSF de colina, no gelo. Adicione 150 mililitros de colina aCSF a 32 graus Celsius, com carbogen. Coloque um prato cristalizador de 200 mililitros com um ímã de barras em uma caixa de alimentos selada e adicione 200 mililitros de aCSF ao prato.Coloque um suporte de fatia de interface impresso em 3D em cima do prato e remova o excesso de fluido do prato cristalizador, até que apenas uma fina película de solução cobrindo a malha do suporte de slides da interface permaneça. Adicione alguns milímetros de aCSF na parte inferior da caixa de alimentos e comece a borbulhar o fluido com carbogen

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um método para visualizar repetidamente microglia murino e monócitos...

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Fonte: Etienne, F. et al. Imagem de dois fótons da atração de processos microgliais por ATP ou serotonina em fatias cerebrais agudas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da microscopia de dois fótons para estudar a atração de processos microgliais em direção a um composto injetado em fatias cerebrais. Ele fornece uma visão geral da preparação de fatias de cérebro de camundongo, injeção de um composto de teste quimioatraente e imagens de microglia marcada com fluorescência para...

Microscopia de dois fótons para estudar a atração do processo microglial em direção a um composto em uma fatia de cérebro de camundongo

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

A tomografia serial de dois fótons (STPT) é uma técnica para obter imagens de uma massa de tecido em sua forma tridimensional, combinando imagens de dois fótons com controle automático de estágio e corte de micrótomo. Aqui descrevemos um protocolo para implementá-lo para cérebros de saguis para entender melhor suas características estruturais.

Tomografia seriada de dois fótons de todo o cérebro do sagui para análises neuroanatômicas

Aprenda a analisar a motilidade direcional de microglia em fatias agudas de cérebro de camundongos usando microscopia de dois fotões. Este método permite medir respostas celulares a ATP e serotonina em tempo real.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

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