Name: Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Aprenda a usar proteínas recombinantes de fusão em ensaios de protease fluorescente com HIV-1. Este protocolo permite triagem em alta vazão e análise cinética enzimática para descoberta de fármacos.

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Este trabalho foi parcialmente suportado pelo projeto "Unindo PHARMPROT" GINOP-2.3.2-15-2016-00044 e, também, financiado pelo programa de excelência institucional de ensino superior de Ministério das capacidades humanas na Hungria, no âmbito da Programa temático de biotecnologia da Universidade de Debrecen. Os autores são gratos por membros do laboratório de bioquímica Retroviral pela ajuda durante o desenvolvimento do ensaio científica e também pela sua paciência durante as filmagens do ensaio (especialmente para Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz e Vanda Toldi, que estão aparecendo no fundo do vídeo). Os autores também queria dizer especial graças a Gedeon Richter Plc., especialmente ao Dr. Zoltán Urbányi para permitir que o trabalho de Beáta Bozóki no departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, como pesquisador convidado. Os autores também gostaria de estender sua gratidão ao György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi e Zoltán Király do centro técnico de E-learning da Universidade de Debrecen e multimídia para a assistência profissional em áudio e vídeo produção.

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<li>Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li>
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<li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991(2013).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido as investigações industriais e acadêmicas intensivas de enzimas proteolíticas e a constante procura de célere e acessíveis plataformas de ensaio de protease HTS-compatível nesse sentido, temos desenvolvido uma protease fluorescente magnético do grânulo-baseados do ensaio. O ensaio baseia-se na utilização de proteínas recombinantes de fusão que podem ser novas alternativas para os substratos de peptídeo sintético amplamente utilizada.
No formato de ensaio desenvolvidos, os substratos de proteína de fusão são imobilizados nas superfícies dos grânulos de agarose magnética Ni-quelato-revestido. O acessório de substrato é fornecido pelo N-terminal sua marca6 afinidade da proteína de fusão, que é fundida diretamente a um tag MBP para facilitar a dobradura e aumentar a solubilidade em água do substrato13. O MBP é seguido por sítios de clivagem de TEV PR e uma protease de interesse. O primeiro pode servir como um local de clivagem de controle no ensaio, enquanto o último pode ser processado pela protease a ser investigada. O local de clivagem é intercambiável; uma sequência curta dsDNA codificação para o local de clivagem de interesse pode ser inserida dentro do flexível' clonagem' do plasmídeo de expressão pela ligadura. As proteínas recombinantes de fusão contêm uma marca altamente estável, monomérica proteína fluorescente no C-terminal, que permite a detecção de ponto de extremidade de enzima-liberado, fluorescentes C-terminal clivagem produtos divulgada mediante clivagem proteolítica ( Figura 1A). Os substratos intactos fluorescentes purificados resolvidos nos buffers diferentes também são usados para calibração para avaliar as concentrações molares de substratos e produtos de clivagem. Além disso, após fluorimetria, os componentes do ensaio podem ser analisados por SDS-PAGE, também. Ambos os nativos (nondenatured) e proteínas desnaturadas fluorescentes podem ser visualizadas no gel, imediatamente após a electroforese ou após subsequente em-gel renaturalização, respectivamente. Este adicional procedimento-em combinação com um convencional azul de Coomassie brilhante coloração-maio ser usada eficientemente para a verificação dos resultados do ensaio (figura 1B).
O procedimento de ensaio consiste em passos simples, fácil-para-executar em um formato de baixo volume que pode ser totalmente adaptado a um ambiente de alta produtividade automático. No entanto, independentemente da realização do ensaio, manualmente ou com um sistema de automação, as seguintes partes do ensaio são consideradas ser crucial e precisam de atenção especial durante a realização do procedimento. i) homogeneidade da solução magnética do grânulo. Uma solução homogênea do grânulo magnético deve ser usada durante todo o ensaio, tanto na purificação e etapas de lavagem. Particularmente, a confiabilidade dos ensaios de protease depende fortemente corretamente alíquotas das soluções estoque conectado à carcaça magnética do grânulo (Claudecir). Para aumentar a eficácia da suspensão e dispersão, recomenda-se definir a concentração do grânulo entre 2% e 10% (v/v). Durante a preparação da amostra, o uso de buffers suplementados com detergente não iônico (tais como o Triton X-100 ou Tween 20) até 2% também pode diminuir a aderência dos grânulos magnéticos para superfícies de plástico. A aderência dos grânulos nas paredes dos frascos de amostra pode ser evitada se as suspensões do grânulo são aplicadas com cuidado para o fundo dos frascos em vez de nas paredes dos tubos de amostra. A homogeneidade dos grânulos magnéticos durante a reação enzimática é também crítica e pode ser assegurada agitando continuamente as amostras a 600 rpm durante a incubação. Grânulos são devidamente dispersos em utensílios de plástico arredondados ou achatados, enquanto não se recomenda o uso de frascos de V-fundo. Um resultado de qualidade inferior causado por homogeneização inadequada do grânulo é representado na Figura 4B. II) término de amostras de reação.  Outra vantagem do método é que a reação enzimática pode ser encerrada sem a utilização de tratamento de calor desnaturação ou qualquer de agentes químicos potencialmente interferentes15. A rescisão pode ser realizada simplesmente separando as esferas magnéticas da mistura de reação, usando um concentrador de partícula magnética convencional. Enquanto o amortecedor da reação removido contém a enzima activa e os produtos de clivagem fluorescentes gerados C-terminal, os substratos uncleaved permanecem ligados aos talões. Devido à presença da enzima activa no buffer de reação, o procedimento de separação precisa ser realizada com cuidado para a deteção de confiança do ponto de extremidade. Antes de colocar os frascos de amostra para o concentrador, é aconselhável aplicar uma centrifugação de curta rotação. Depois de colocar os tubos para o concentrador, fornecer pelo menos 15 s para as contas a cobrar. Ligeiro movimento do separador e para trás pode facilitar a recolha dos grânulos. Por favor, considere que, durante uma separação realizada manualmente, a rescisão geralmente leva mais tempo do que o início das reações. Portanto, um atraso de cerca de 2 min registrado recomenda-se, entre as iniciações, se o mesmo tempo de incubação deve ser aplicado para todas as amostras.
O princípio do ensaio descrito proteolítica é relativamente simples; no entanto, a versatilidade do sistema é garantida pela estrutura de substrato flexível e estável. A otimização individual do ensaio pode ser limitada apenas pela compatibilidade dos grânulos afinidade com as condições aplicadas, reagentes e aditivos. De acordo com o protocolo do fabricante, nós também achamos que a ligação de afinidade de substratos para as superfícies de grânulo de Ni-NTA enfraquece substancialmente a pH ≤ 6,515. Portanto, é recomendável aplicar amostras em branco do substrato paralelas para as amostras de reação, e a taxa de dissociação espontânea do substrato precisa ser considerado durante a avaliação dos resultados.
Nesses casos, onde magnética do grânulo-ensaios baseados não podem ser executados devido ao uso de componentes incompatíveis do grânulo ou um baixo pH, em solução de digestão de substratos recombinantes purificados pode igualmente ser aplicado. Nestes casos, as misturas de reação podem ser analisadas por eletroforese, e as proteínas podem ser visualizadas no gel baseado no protocolo descrito. Para investigar a atividade proteolítica, digestão em solução e em gel detecção de proteínas também podem ser ferramentas alternativas de fluorimetria. Uma novidade do sistema projetado substrato é a aplicação de uma etapa de renaturalização de em-gel após desnaturação de SDS-PAGE. Enquanto o nativas proteínas fluorescentes (nondenatured) retêm sua fluorescência durante a electroforese, o Propriedade fluorescente é abolido após desnaturação (Figura 7B). No entanto, a fluorescência de proteínas desnaturadas pode ser parcialmente recuperada pela remoção do gel de SDS. Assim, uma separação dos componentes de reação utilizando condições desnaturação possibilita não só a base de fluorescência mas a identificação molecular baseados em peso. Outra vantagem da detecção fluorescente em-gel em comparação com a análise de um gel manchado de Coomassie é que as proteínas fluorescentes (nativo ou renatured) podem ser facilmente identificadas no gel com base em sua fluorescência (ver Figura 7). Isto pode ser importante se as reações de clivagem são realizadas em amostras contendo contaminantes nonfluorescent ou proteínas altamente, assemelhando-se os pesos moleculares do outro.
Ensaios de protease similarmente usando substratos projetados já foram publicadas anteriormente8,9,10, e embora o local de clivagem de interesse nesses casos também estava localizado entre uma tag de afinidade e um proteína fluorescente, o sistema de ensaio apresentado aqui não apenas repete as ideias descritas mas combina as vantagens diferentes das plataformas anteriores e também conclui-los com novas melhorias: i) a utilização de um parceiro de fusão de MBP, ii) a presença de um local de clivagem do controle do PEV PR, iii) o uso de FPs monomérico recentemente projetado e iv) a aplicação de um procedimento de calibração do substrato original. O ensaio em si foi projetado especialmente para ser útil para a especificidade da enzima e estudos cinéticos de forma segura, tempo e custo-eficiente forma, sem a necessidade de instrumentação cara. O método é destinado a ser uma ferramenta acessível e adequada para ambos os fins de pesquisa acadêmica e industrial. Devido à flexibilidade da fita' clonagem' do plasmídeo de expressão, o sistema pode ser adequado para a geração rápida e barata de bibliotecas de substrato recombinante. O ensaio descrito neste documento é uma ferramenta viável para a implementação de especificidade de substrato, mutagênese de enzima, e inibição estudos e, também, fornecer uma ferramenta alternativa para executar cinética enzimática. A plataforma de ensaio (a partir de rompimento da pilha bacteriana para a determinação dos parâmetros cinéticos) pode ser adaptada a um ambiente de HTS e automação baseada e, potencialmente, pode ser aplicada em triagem de inibidor de protease industrial e/ou drogas antivirais desenvolvimento. Além disso, a adaptação do ensaio para proteólise competitiva também é no futuro escopo de nosso laboratório. Em um ensaio tão competitivo, dois diferentes substratos, cada contendo um sítio de clivagem diferente fundido a um diferente C-terminal fluorescente marca-são destinado a ser utilizados simultaneamente na mesma reação de clivagem para investigar a preferência dos estudados enzima para as sequências de determinado destino. Além disso, o uso de um formulário de ensaio adaptado de placa de 96 poços (Figura 8) também está sendo otimizado para rastreio de mutação usando uma série de substratos com sequências de sítio de clivagem modificada em caso de proteases de cisteína.

Enzimas proteolíticas pertencem aos grupos mais intensamente investigado enzima devido a sua importância em vias metabólicas e em aplicações industriais, bem como. Seu papel-chave nas doenças virais, a regulação da coagulação do sangue, câncer e cardiovascular e doenças neurodegenerativas faz proteases alvos proeminentes no campo da descoberta da droga. Portanto, a caracterização detalhada da especificidade de substrato e inibidor de perfilação da protease (PR), de interesse é cruciais e são realizados de preferência por ensaios bioquímicos rápida, eficiente e robusto1,2, 3.
Hoje em dia, a grande maioria dos ensaios in vitro protease aplicado no campo da descoberta de drogas para perfis compostos é homogêneo, fluorescente baseado em peptídeo e elevado-throughput screening (HTS)-plataformas compatíveis4. Além disso, peptídeos etiquetados não são somente apropriados para triagem de biblioteca, mas eles também oferecem ótimas ferramentas para a determinação da enzima parâmetros cinéticos sobre os substratos selecionados. Em outros casos, onde a rotulagem do substrato não é possível, ensaios baseados em separação podem fornecer uma solução possível para avaliar as propriedades cinéticas de reações proteolíticas3.
Geralmente, os ensaios in vitro protease baseiam-se na utilização de dois tipos de substrato: curto peptídeos ou proteínas inteira. Nesses casos, onde a clivagem de sequências peptídicas curtas refletem as propriedades de clivagem suficientemente, são aplicáveis as seguintes abordagens padrão: (i) análise de substratos de proteína padrão tais como insulina oxidado da cadeia B, (ii) teste comercialmente disponíveis substratos de outras proteases, (iii) bibliotecas de peptídeo sintético e fluorescente etiquetadas criadas por química combinatória, ou (iv) de rastreio usando métodos genéticos, por exemplo, biológico exibir tecnologias5, 6. A classificação convencional, além de outras plataformas de romance também estão disponíveis para geração de substrato (por exemplo, a formação do peptídeo derivado de proteome bibliotecas7 ou subtipos especiais de métodos genéticos, como a fusão recombinante substratos à base de proteínas8,9,10,11,.12).
Todos os tipos de substrato acima mencionados e ensaios têm suas próprias vantagens e limitações, e o desenvolvimento de formatos de ensaio combinando e/ou melhorar as vantagens das plataformas conhecidas ainda está em demanda. Aqui descrevemos um protocolo para um ensaio de separação-baseado protease fluorescente, que utiliza substratos recombinantes. Estas proteínas de fusão consistem em seus rótulos MBP fundidos a um local de clivagem de controle do PR do PEV, que é seguido pela sequência substrato de interesse que está directamente ligado a uma proteína fluorescente do C-terminal (FP) (figura 1A) e6 . A clonagem de uma sequência de DNA que codifica para um local de clivagem de interesse dentro da ' clonagem' pode ser executada por uma reação de ligadura único para o plasmídeo de expressão, que tem sido linearizada anteriormente por endonucleases de restrição.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Figura 1: Princípio do ensaio fluorescente protease. Protease (A), a representação esquemática de um substrato fluorescente e sua clivagem pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é mostrado. A seta indica a posição de clivagem dentro da sequência de sítio de clivagem de matriz/capsídeo de protease do HIV-1 (VSQNY * PIVQ). Substratos (B) o fluorescente podem ser usados para analisar reacções enzimáticas por ensaio baseado em grânulo magnético Ni-NTA e por eletroforese em gel de poliacrilamida, bem, como é mostrado no diagrama de fluxo de trabalho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Embora proteolíticas ensaios usando a proteína recombinante semelhante substratos contendo uma tag de afinidade, um local de clivagem proteolítica e um proteína fluorescente-ter já sido descrito8,9,10, o sistema apresentado aqui tem a intenção de integrar e melhorar as vantagens destes métodos. Uma diferença importante é que os substratos de proteína de fusão nesta plataforma de ensaio estão equipados com MBP para aumentar a solubilidade de proteínas13 e conter um local de clivagem de controle para TEV PRs. Além disso, os substratos contêm proteínas fluorescentes de nova geração, que são altamente estáveis e têm uma forma monomérica para prevenir a agregação de substrato. Além do aplicativo publicado anteriormente de mTurquoise2 e mApple-fundido formas14, aqui nós também mostramos resultados dada pelo uso de um substrato recombinante contendo um monomérico reforçada etiqueta fluorescente proteína fluorescente amarela (mEYFP). Pelo presente, podemos demonstrar a compatibilidade do sistema com outras proteínas fluorescentes e representam alguns tipos gerais de resultados que podem ser adquiridos por meio de ensaio o protease.
As proteínas recombinantes de fusão são expressos em células de Escherichia coli BL21(DE3) e são utilizadas como substratos para o ensaio em um ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA)-magnético-agarose-grânulo-Unido forma revestida. Os produtos de clivagem do C-terminal são liberados da superfície do grânulo no sobrenadante após clivagem pela protease de interesse. Após a separação do sobrenadante (contendo a enzima e os produtos de clivagem) das esferas magnéticas, a fluorescência pode ser medida para determinar as propriedades de clivagem da enzima. Em contraste com os métodos anteriormente descritos, no sistema apresentado aqui, a quantidade de substrato e produtos de clivagem do C-terminal é excepcionalmente quantificada com base em um procedimento de calibração de substrato detalhadas. O sistema de ensaio pode ser suportado por uma análise de SDS-PAGE das amostras de ensaio; uma visualização de em-gel fluorescente subsequente pode ser aplicada imediatamente após a electroforese ou após a renaturalização em-gel dos nondenatured e desnaturados componentes fluorescentes, respectivamente14.
A flexibilidade e a estrutura da fita' clonagem' permitir uma inserção e custo-eficiente tempo de uma grande variedade de sequências para a construção e, assim, promove a geração de bibliotecas de substrato. Uma vez que todas as etapas do ensaio são automação e HTS-compatível, o sistema pode ser especialmente atraente para, por exemplo, medições de especificidade de protease e de mutagénese ou também pode ser efetivamente utilizado para rastreio de inibidor de protease industrial e/ou desenvolvimento de drogas antivirais, também.
Parâmetros de cinética enzimática (kgato, Km) podem ser determinados pelo teste desenvolvido com base em separação; Portanto, pode ser apropriado realizar medições cinética enzimática individuais, tais como os estudos de tempo-curso, dependente do substrato e inibição. Isto prova que os substratos de proteínas recombinantes de fusão fornecem boas alternativas para os substratos de oligopeptídeos sintética frequentemente utilizada, e devido a sua alta similaridade com os substratos poliproteína, eles representam a ocorrência natural interações enzima-substrato com mais precisão.

<table><tbody><tr><td>Tubos Amicon 10K</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Acrilamida/Bis 40% 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SERVA</td><td>11404.04</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Imager HP sistema de documentação em gel</td><td>Persulfato</td> de amônio ProteinSimple <td></td><td></td></tr><tr><td>(APS)</td> <td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-22 centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392185</td><td></td></tr><tr><td>Placas pretas de meia área</td><td>Greiner bio-One</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Para linearização de plasmídeo (passo 1.1.1)</td></tr><tr><td>Transiluminador Dark Reader</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-45M</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2&nbsp; partícula magnética&nbsp; concentrador</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3) células competentes&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merc-Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Etilenodiaminotetracético&nbsp; (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td></td><td>Corante</td></tr> de <tr><td>Carregamento em Gel 798681, Roxo (6X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>356350</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Kit Mini de Plasmídeo de Alta Velocidade</td><td>GeneAid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Jouan CR 412 centrífuga</td><td>Jouan</td><td>CR412</td><td></td></tr><tr><td>Labinco LD-76 Rotator&nbsp;</td><td>Caldo Labinco</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>MERCK eurolab banho ultrassônico</td><td>MERCK</td><td>USR54H</td><td></td></tr><tr><td>Millifuge Eppendorf spin centrifugador</td><td>Millipore</td><td>CT10</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Célula de eletroforese</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N, N, N&prime;, N&prime;-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF endonuclease de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131L</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Níquel(II) (NiSO4)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td></td><td></td>656895</tr><tr><td>Contas de agarose magnéticas Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>36113</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Biosan</td><td>OS-20</td><td></td></tr><tr><td>PacI endonuclease de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>PageBlue Solução de coloração de proteína&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>24620</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanossulfonil-fluoreto (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lobind Micro-tubos de centrífuga&nbsp;</td>Kit de Extração de Gel <td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Snijders Shaker Press-to-Mix&nbsp;</td><td>Gemini</td><td>34524</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Mancha de Gel de Ácido Nucleico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo shaker</td><td>Biosan</td><td>TS-100</td><td>com bloco de acessórios SC-24</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA)&nbsp;</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>WALLAC VICTOR2 1420 balcão multilabel</td><td>Wallac Oy, Turku, Finlândia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases são enzimas intensivamente estudadas devido à suas funções essenciais em diversos caminhos biológicos dos organismos vivos e na patogênese; Portanto, eles são alvos de drogas importantes. Nós desenvolvemos uma plataforma de ensaio magnético-agarose-grânulo-baseado para a investigação da atividade proteolítica, que é baseada na utilização de substratos de proteínas recombinantes de fusão. Para demonstrar o uso deste sistema de ensaio, um protocolo é apresentado no exemplo do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) de protease. A plataforma de ensaio apresentado pode ser utilizada com eficiência na caracterização bioquímica de proteases, incluindo medições de atividade enzimática em mutagênese, cinética, inibição ou estudos de especificidade, e pode ser apropriado para alta produtividade rastreio de substrato ou pode ser adaptado a outras enzimas proteolíticas.
Neste sistema de ensaio, os substratos aplicados contém maltose-ligação proteína (MBP) marcas e hexahistidine N-terminal (a6), sítios de clivagem para tabaco etch vírus (TEV) e proteases HIV-1 e uma proteína fluorescente do C-terminal. Os substratos podem ser eficientemente produzidos em células de Escherichia coli e facilmente purificada usando - quelato - grânulos revestidos de níquel (Ni). Durante o ensaio, a clivagem proteolítica de substratos do grânulo-anexado leva à liberação de fragmentos de clivagem fluorescente, que pode ser medido por fluorimetria. Além disso, reações de clivagem podem ser analisadas por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE). Um protocolo para a renaturalização em-gel de componentes de ensaio também é descrito, como renaturalização parcial de proteínas fluorescentes permite sua detecção com base no peso molecular e fluorescência.

A figura 1A mostra a estrutura esquemática de um substrato de proteína recombinante fluorescente representativos que pode ser processado pelo PR de HIV-1 em sua sequência de sítio de clivagem específica. Figura 1B representa a produção de substrato e suas possíveis aplicações em ensaios de protease, incluindo ensaio de Ni-NTA magnética do grânulo-baseada e/ou página.
Para obter dados fiáveis por fluorimetria, um procedimento de calibração é necessário, a fim de determinar as quantidades de substratos fluorescentes e produtos de clivagem. Para isso, os valores de intensidade de fluorescência de substratos diferentes das condições de reserva diferentes precisam ser medidos e precisam ser correlacionada com as respectivas concentrações na faixa de concentração analisado (Figura 3). Os valores de inclinação das curvas de calibração podem ser aplicados para determinar as quantidades de substratos e produtos de clivagem nas amostras de ensaio. As inclinações das curvas de calibração são independentes das sequências clivagem local inseridas os substratos (tabela 11) e potencialmente podem ser usadas para uma série de substratos fundida-se para o mesmo tipo de proteína fluorescente. Zoom em gráficos são mostrados para todas as regressões lineares, para ampliar os intervalos de concentração mais baixos também (Figura 3). É importante notar que a calibração precisa ser executada com cuidado porque uma adequada distribuição de pontos de dados é necessária para uma calibração confiável. Por esta razão, dupla diluição serial é aplicada para preparar as amostras para a calibração, porque o valor de2 R indica uma boa correlação entre a concentração de proteína fluorescente e fluorescência, somente se um número suficiente de pontos de dados têm sido utilizados para cobrir o intervalo de concentração toda. Além disso, os erros experimentais altamente podem afetar a exatidão da calibração; assim, uma avaliação gráfica das linhas de regressão pode ser também necessária.
Uma variedade de medições enzimáticas pode ser executada pelo ensaio de protease, incluindo uma análise do efeito da concentração de substrato na velocidade da reação (Figura 4A). Por regressão não-linear, os dados podem ser usados para determinar os parâmetros cinéticos de enzima (por exemplo, vmax e Km). Uma suspensão de grânulo insuficiente e dispersão e uma finalização de reação inadequada podem causar resultados suboptimal (Figura 4B), que não são adequados para calcular valores de cinética enzimática confiável.
Uma dependência da formação do produto no tempo pode ser determinada por ensaio (Figura 5A) (por exemplo, durante a otimização dos parâmetros de reação de clivagem). Atividade enzimática na presença de um inibidor também pode ser investigado (Figura 5B) para a determinação da concentração de enzima activa e constante inibitória. Usando a mesma metodologia, efeitos de outros inibidores também podem ser rastreados por ensaio.
O ensaio de protease é útil quando investigando os efeitos do pH na atividade enzimática, também. Figura 6A representa a dependência da atividade enzimática no pH pelo exemplo de TEV PR, que tem uma faixa de largura ideal de pH (pH 6-9). Se a dependência do pH da atividade da enzima é estudada (ou enzimas, tendo uma ótima de pH ácido precisam ser medido), é necessário considerar que a ligação de afinidade de substratos recombinantes para os grânulos pode ser restrita em pH ligeiramente ácido. Uma dissociação elevada de substratos de grânulos (Figura 6B) pode causar uma distorção dos resultados do ensaio. Para considerar a dissociação espontânea do substrato de grânulos, os valores medidos para amostras de reação precisam ser corrigido das amostras de B.
A Figura 7 mostra que a nondenatured proteínas fluorescentes podem ser diferenciadas no gel com base em suas cores, usando transiluminação de luz azul (Figura 7A). Se a determinação dos pesos moleculares dos fragmentos de substratos/clivagem é necessária, desnaturação condições pode também ser utilizado para a preparação da amostra, porque proteínas fluorescentes podem ser parcialmente renatured no gel e podem ser detectadas por iluminação UV (Figura 7B) ou por Coomassie coloração (Figura 7). Se as amostras de R são analisadas, apenas os produtos de clivagem do C-terminal são visíveis (Figura 7), enquanto os fragmentos de clivagem do N-terminal e os substratos uncleaved permanecem ligados aos talões. Ocasionalmente, as proteínas podem desnaturar parcialmente apesar de usar condições nondenaturing (Figura 7), e enquanto as proteínas nondenatured são mais abundantes, desnaturadas formas também são detectáveis na amostra. Este fenômeno não influencia a detecção de clivagem proteolítica, mas precisa ser considerado no caso de densitometria quantitativa de amostras nondenatured.
Embora a descrição detalhada é mostrada apenas para um ensaio 2 mL tubo-baseados, o ensaio pode ser adaptado para um 96 poços baseados na placa de sistema (Figura 8), que já foi testado com sucesso em nosso laboratório (não mostrado). O formato de placa-adaptado de 96 poços é totalmente compatível com o fluorimétrica eletroforética análises e, também, e os dados obtidos também podem ser avaliados com base em métodos descritos neste artigo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Figura 3 : As curvas de calibração. As curvas de calibração do substrato representativos são demonstradas com o exemplo de dois substratos recombinantes fundidos para diferentes etiquetas fluorescentes do C-terminal: (A e B) seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 e (C e D de ) Seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom em figuras também são mostradas para representar a regressão linear de pontos de dados na 0,005-0 intervalo de concentração de substrato de milímetros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Figura 4 : Determinação de parâmetros cinéticos de enzima. Foram realizadas medidas cinéticas de substrato dependentes por HIV-1 PR (em uma concentração final de ativa de 41,2 nM). Os valores de velocidade inicial foram plotados contra a concentração de substrato e realizou-se uma análise de regressão não-linear de Michaelis-Menten. As barras de erro representam SD (n = 2). (A), A representante ideal resultado é mostrado no exemplo de seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple substrato de proteína de fusão. (B), um representante suboptimal resultado também é indicado para a sua6- MBP-KARVL * substrato de macacos-mTurquoise2, onde o cenário das concentrações de substrato adequado era problemático devido a uma homogeneização insuficiente da solução SAMB , enquanto relativamente elevados erros foram causados por rescisão de reação imprópria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Figura 5 : Estudo do tempo-curso e inibitório. () Seu 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP substrato de proteínas recombinantes de fusão (em uma concentração final de 0,00326 mM) foi clivado por HIV-1 PR (em uma concentração final de ativa de 41,2 nM), e o lançamento de fragmentos de proteolíticas fluorescentes PIVQ-mEYFP foi medido para realizar uma análise de tempo-curso. As medições foram realizadas em cinco pontos diferentes do tempo. As barras de erro representam SD (n = 2). (B) seu6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP foi usado como substrato (a 0,0015 mM) para determinar o efeito inibitório sobre a atividade do HIV-1 PR de amprenavir (numa concentração total de 163,8 nM). Por plotar os dados, o meia concentração inibitória máxima (IC50) podem ser avaliados e a concentração da enzima ativa (uma concentração final de ativa de 41,2 nM) do HIV-1 PR aplicada pode também ser calculada com base na curva de inibição. As barras de erro representam SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Figura 6 : Estudando a dependência da atividade enzimática e dissociação espontânea do substrato em pH (A) o seu MBP -6-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrato (em 0,033 mM) foi usado para medir a atividade de enzima de TEV PR (numa concentração total final de 91.42 nM) no buffer de clivagem definido para um pH diferente, entre o intervalo de 6.5-8.5. As barras de erro representam SD (n = 2). Os dados plotados tem sido publicadas anteriormente14. (B) com base nos valores a intensidade fluorescente relativo as amostras em branco do substrato, a dissociação espontânea de seus6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrato (0,033 mM) de grânulos magnéticos foi estudado usando buffer de clivagem com um pH diferente, entre 6.0-8.5. Os dados plotados tem sido publicadas anteriormente14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Figura 7 : Detecção de proteínas no gel por diferentes métodos. (A) Uncleaved e substratos de proteína de fusão do HIV-1 PR-digerido após a preparação da amostra nondenaturing foram visualizados por transiluminação luz azul depois de SDS-PAGE. A reação de clivagem foi realizada por digestão na solução. (B) imediatamente após a página, só nondenatured proteínas pode ser detectada no gel por iluminação UV, enquanto após a remoção do SDS, as proteínas fluorescentes previamente desnaturadas tornou-se parcialmente renatured e detectável. As amostras foram preparadas a partir os sobrenadantes do ensaio Ni-NTA magnética do grânulo-baseados. (C) coloração Coomassie também pode ser usado para detecção de proteínas, após a renaturalização em-gel. O SDS-presente em gel-maio causam a desnaturação parcial da proteína nativa, mas em amostras nativas, as formas de nondenatured são mais abundantes. As amostras foram preparadas a partir os sobrenadantes do ensaio Ni-NTA magnética do grânulo-baseados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Figura 8 : adaptação baseada em placa de 96 poços da plataforma de ensaio. (A), o ensaio pode ser realizada não só em tubos de 2 mL, mas nos poços de uma placa de 96 poços, também. Aqui nós mostramos a representação esquemática para a aplicação do ensaio estudar a especificidade de uma protease fictícia usando uma série de substratos fluorescentes, que podem conter o selvagem-tipo (wt) ou mutante (mut-1 a mut-4) sequências de sítio de clivagem. Para lidar com os grânulos magnéticos, um concentrador de partícula magnética compatível com 96 poços (MPC) é para ser usado nos experimentos. Todos os volumes indicados estão relacionados com um único poço. Para comparar a eficiência de clivagem de diferentes substratos, conversão de substrato pode ser avaliado da percentagem de substrato-em branco-corrigido valores RFU das amostras de reação, considerando os valores RFU substrato-em branco-corrigida das amostras de controlo de substrato como 100. (B) depois de fluorimetria, os sobrenadantes separados do ensaio as amostras também podem ser analisadas por página e os componentes de proteína fluorescente pode ser analisado diretamente ou após a renaturalização em-gel no caso de amostra nondenaturing e desnaturação preparação, respectivamente. Os três tipos de amostra de ensaio diferentes também são ilustrados em cada figura: C = controle de substrato, B = branco do substrato e R = reação. Amostras de controlo de substrato são em tampão de eluição, enquanto o branco do substrato e as amostras de reação estão no buffer de clivagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffer de</td>
			<td>Proteína fluorescente</td>
			<td>CV % das pistas (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluição</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Clivagem</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluição</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Clivagem</td>
			<td>12,68</td>
		</tr>
</tbody></table>Quadro 11: coeficiente de valores de variação (% CV) das encostas das curvas de calibração do substrato. Para testar se a fluorescência de substratos a proteína recombinante é dependente o local de clivagem inserido, calibrações foram realizadas por uma série de substratos de mApple - e mTurquoise2-fundido (seis variantes para cada um, contendo o local de clivagem diferente sequências de protease do HIV-1), ambos nos buffers de eluição e clivagem. Nós achamos que valores de CV % das encostas estão abaixo dos 15% em todos os casos, o que implica que uma calibração de substrato único pode ser utilizada para a avaliação das diferentes medições realizadas por variantes de substrato contendo a mesma marca de fluorescente.

Aqui, apresentamos o procedimento detalhado de uma plataforma de ensaio de protease recentemente desenvolvido utilizando o N-terminal hexahistidine/maltose-proteína e fluorescentes substratos recombinantes da proteína-fundido, anexados à superfície do níquel-nitrilotriacético grânulos de agarose magnético ácido. Também é apresentada uma análise subsequente em-gel das amostras de ensaio separados por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio.

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Proteases são um dos grupos mais investigados de suportes biomoleculares em pesquisas acadêmicas e industriais. Seu papel poderoso em vários processos fisiológicos e patológicos faz deles um alvo proeminente no campo da descoberta de drogas também. Em relação à sua pesquisa intensiva, há uma grande e contínua demanda para o desenvolvimento de plataformas de ensaios de teste de fluorescência protease compatíveis com o tempo e economia de custos.Aqui, gostaríamos de introduzir um protocolo para a aplicação de uma plataforma de ensaio de fluorescência compatível com triagem de alta throughput baseada em separação usando substratos de fusão recombinante fundidos de mTurquoise2 e mApple. Além disso, gostaríamos de demonstrar um método para a renaturação em gel dos substratos e os fragmentos de decote das amostras de ensaio após a desnaturação do SDS-PAGE também. Todos os experimentos são realizados no exemplo do vírus HIV-1 protease.A expressão plasmídeo carrega a sequência de codificação de uma tag de afinidade hexa histadina e uma proteína de fusão de ligação maltosa seguida por um local de controle de cálcio protease vírus de gravação, um de clonagem, e uma proteína fluorescente terminal C. Linearizar a expressão plasmid por endonucleases de restrição de PacI e NheI. Realize o ressarcimento do codon Escherichia coli otimizado para frente e para trás primers oligonucleotídeos que codificam para a sequência substrato de interesse e flanco por extremidades coesas paci e nhei.Realize a inserção dos primers resalados na expressão linearizada plasmid por ligadura. Para expressão proteica, transforme células competentes BL21(DE3)pela mistura de ligadura. As proteínas fluorescentes estarão no mesmo quadro de leitura aberta com as etiquetas de fusão n-terminal somente após uma ligadura bem sucedida.Poucos dias após a transformação, as colônias contendo a expressão plasmid codificando o local de interesse inserido do decote mostrarão fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Adicione 10 microliters glicerol estoque das células BL21(DE3)carregando a expressão codificação plasmida para a sequência de perfil de decote de interesse a cinco mililitros LB médio contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Incubar a suspensão a 37 graus durante 15 horas enquanto treme constantemente.Transfira cinco mililitros de cultura bacteriana para 50 mililitros frescos lb contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro. Cresça as células a 37 graus a uma absorção de 0,6 a 0,8 a 600 comprimentos de onda de nanômetros. Neste ponto, induzir a expressão proteica pela adição de IPTG.Daqui em diante, incubar a cultura por três horas a 37 graus enquanto treme continuamente. Após a incubação, transfira 25 mililitros da cultura em tubos limpos de centrífugas de 50 mililitros, e colmeia as células por centrifugação. Descarte o supernasce e armazene as pelotas de células bacterianas a menos 70 graus por pelo menos uma hora.As pelotas celulares contendo as proteínas fluorescentes expressas com sucesso mostram claramente uma fluorescência com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Coloque a pelota de célula congelada no gelo e deixe descongelar por 15 minutos. Adicione dois tampão de lise mililitros à pelota e suspenda as células.A seguir, adicione o inibidor de protease, liberte a suspensão por lyzozyme e DNase, suspenda as células e incuba a suspensão no gelo por 15 minutos. Transfira duas vezes uma suspensão mililitro em tubos de microcentrifuge de 1,5 mililitro e sonicize as suspensões por três minutos em rodadas de 10 segundos de sônica e cinco segundos de quebra. Centrifugar os tubos a 10.000 g por 20 minutos em temperatura ambiente.As células bacterianas limpas contendo o substrato fluorescente de interesse mostram fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. O procedimento do ensaio de protease desenvolvido começa com a preparação das amostras de ensaio. Em primeiro lugar, os substratos recombinantes são incubados com as contas magnéticas de afinidade, e as contas magnéticas anexadas ao substrato, abreviadas como SAMBs, são formadas.Os SAMBs são lavados várias vezes, e finalmente a solução de estoque SAMB é preparada pela alíquota da qual as amostras de ensaio são criadas. As reações são iniciadas pela adição da solução protease. Após o decote pela protease, os fragmentos protelíticos são liberados no supernatante.A reação é interrompida pela separação das contas magnéticas do tampão de reação que contém os produtos fluorescentes de decote e a enzima. Os supernantes são aplicados nos poços de uma placa de microtiter e a fluorescência é determinada pela fluormetria. As curvas de calibração são geradas usando substratos fluorescentes purificados resolvidos em cada amortecedor de ensaio.A concentração dos produtos de decote fluorescente do terminal C e também do substrato aplicado nas amostras de ensaio são determinadas com base na inclinação das curvas de calibração. Coloque o tubo contendo contas de níquel-NPA magnéticas novas ou recicladas em um concentrador de partículas magnéticas. As contas podem grudar na parede e/ou na tampa do tubo de microcentrífuga.Portanto, vire o concentrador de cabeça para baixo em todas as direções para garantir que todas as contas sejam coletadas. Remova o supernaspe e descarte-o. Adicione 1,8 mililitros de tampão de lise às contas e remova os tubos fechados do concentrador.Suspenda as contas no tubo tremendo e/ou virando o tubo de cabeça para baixo até que as contas fiquem completamente homogêneas. Coloque os tubos de volta no concentrador e vire-os de cabeça para baixo em todas as direções para garantir que todas as contas sejam coletadas. Abra o tubo e descarte o supernasal.Adicione o lise estéril de bactérias limpas contendo o substrato de interesse e remova o tubo fechado do concentrador. Vire os tubos de cabeça para baixo até que as contas fiquem completamente homogêneas e gire os tubos por rotador, lentamente, em temperatura ambiente por 30 minutos. Os SAMBs mostram fluorescência visível com ou mesmo sem usar um transilluminator azul Dark Reader.Lave os SAMBs três vezes por 1,8 mililitro 1%Tween 20, tampão de lavagem e tampão de decote. Adicione tampão de decote aos SAMBs lavados para criar uma solução de estoque SAMB. Se usar tubos de microcentrifuge de proteína de dois mililitros de baixa ligação, o volume do tampão de decote aplicado é de até 1,9 mililitros.Após a adição do buffer, não agite ou vire o tubo de cabeça para baixo. Feche o tubo e remova-o do concentrador. Prepare tubos de microcentrifuge de proteína de dois mililitros para as amostras de ensaio.Suspenda a solução de estoque SAMB até que seja completamente homogênea e meça a quantidade de substrato a ser analisada nas reações, transferindo imediatamente a solução de estoque SAMB para os frascos de amostra. Recomenda-se que o volume da solução de estoque SAMB seja transferida para 25 a 300 microliters, mas deve ser definido de acordo com o projeto experimental individual. Coloque os tubos de amostra contendo as suspensões SAMB aliquoted no concentrador.Remova cuidadosamente o supernatante dos SAMBs e descarte-o. Remova os tubos do concentrador e adicione cuidadosamente o tampão de reação aos SAMBs. O volume do buffer de reação adicionado deve ser calculado de acordo com o design experimental individual, mas recomenda-se definir o volume final da mistura de reação entre 50 e 150 microliters se forem usados tubos de dois mililitros.Feche as tampas dos tubos. Agora, as amostras estão prontas para serem iniciadas. Adicione a solução enzimática às amostras de reação.Misture as contas cuidadosamente movendo os tubos e coloque os tubos imediatamente no termoshaker já tremendo. No caso de amostras em branco de substrato e amostras de controle de substrato, adicione tampão de decote e tampão de elução, respectivamente. Trinta segundos antes do fim da incubação, retire a amostra do termoshaker e gire-a prontamente.Coloque o tubo sobre o concentrador e deixe o tubo ficar em pé por 15 segundos. A coleta dos SAMBs pode ser facilitada movendo ligeiramente o concentrador para frente e para trás. Abra a tampa e transfira cuidadosamente o sobrenante para uma placa ou um novo tubo.Não toque nas contas concentradas pela ponta da pipeta. O supernatante coletado das amostras de controle do substrato e as amostras de reação com alto grau de decote podem mostrar fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Transfira duas vezes 30 microliters dos supernantes de amostra separados em uma microplacão preto de meia área.Meça a fluorescência por fluorímetro usando os filtros apropriados de acordo com a proteína fluorescente aplicada. Para a purificação dos substratos fluorescentes, prepare a mesma solução descrita anteriormente e descarte o sobrenante. Adicione 400 a 600 tampão de eluição de microliters aos SAMBs e gire os tubos por rotador lentamente à temperatura ambiente por cinco minutos.Transfira o eluato para novos tubos de microcentrifuuge de baixa ligação de proteínas. Ele mostra fluorescência claramente visível com ou sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Após a purificação, troca de buffer e a medição do teor de proteína, prepare uma diluição serial dupla em pelo menos oito etapas, tanto a partir das soluções de substrato resolvidos com tampão de decote e tampo- tampão, utilizando elução ou tampão de decote para diluição, respectivamente.Transfira 30 microliters de cada ponto de diluição para uma microplacão preta de meia área. Meça a fluorescência por fluorímetro utilizando as mesmas configurações que foram aplicadas na medição dos supernacantes da amostra de ensaio. Como exemplo para o processamento de dados, as medidas cinéticas dependentes do substrato da protease hiv-1 foram realizadas em uma forma fundida de mTurquoise2 do substrato recombinante codificando o local do decote entre a matriz e as proteínas capsid no precursor natural da proteína gapic.Plote os valores de intensidade de fluorescência relativa corrigida contra a concentração molar dos substratos purificados, resolva o tampão de decote ou eluição e realize a regressão linear. Calcule a concentração molar dos produtos de decote terminal C nas amostras de reação usando a inclinação da curva de calibração baseada em tampão de decote. Calcule também a concentração de substrato aplicado nas amostras de reação com base na concentração molar do substrato elucido nas amostras de controle do substrato usando a inclinação da curva de calibração baseada em tampão de eluição.Os valores de velocidade iniciais foram calculados a partir da quantidade dos fragmentos de decote terminal C e, em seguida, plotados contra a concentração de substrato aplicado. Também os parâmetros cinéticos foram determinados pela análise de regressão não linear de Michaelis-Menten. Depois de realizar o ensaio baseado em contas magnéticas níquel-NTA, os supernantes de ensaio podem ser analisados por eletroforese de gel de poliacrilamida também.No entanto, além da análise das amostras de ensaio, também é possível analisar os substratos fluorescentes purificados e/ou os fragmentos de decote após a digestão em solução. Para digestão em solução, aliquo os substratos fluorescentes purificados a serem digeridos dissolvidos em tampão de decote em tubos de microcentrífa de 1,5 mililitro, e adicione a solução enzimácica às amostras. Incubar as amostras de acordo com o desenho experimental e terminar as reações pelo procedimento da preparação da amostra para PAGE.Para a preparação da amostra não desabitado, misture as amostras a serem analisadas com tampão de carga de amostra não dedesnaturação que não contenha nenhum agente redutor. No caso da preparação da amostra desnaturada, misture as amostras a serem analisadas com tampão de carga de amostra desnaturação e exponha as amostras ao tratamento térmico a 95 graus por 10 minutos. Aplique as amostras não desnaturadas e desnaturadas nos poços do gel de poliacrilamida SDS e realize a eletroforese.Remova o de gel do módulo de execução. Amostras não desnaturadas já são visíveis no gel mesmo a olho nu ou com o transilluminator azul Dark Reader. Para detectar os componentes fluorescentes das amostras desnaturadas no transilluminador, realize a renaturação em gel lavando o SDS do gel.Adicione 100 mililitros de água destilada ao gel e enxágue pelo menos por 30 minutos. Visualize as proteínas fluorescentes colocando o gel não manchado no transilluminador azul Dark Reader. As proteínas de fusão fluorescente recombinantes foram projetadas para serem usadas como substratos em ensaios proteolíticos.Após o decote pela protease no local específico do decote, o fragmento de decote fluorescente terminal C é liberado e sua fluorescência pode ser detectada. Seu uso em ensaios baseados em contas magnéticas níquel-NTA e a detecção fluorescente pela análise PAGE foram otimizados usando protease HIV-1. No entanto, a plataforma de ensaio desenvolvida também pode ser adequada para outros proteases.As curvas de calibração dos substratos purificados resolvidos em tampão de decote ou eluição são ilustradas nos exemplos da forma fundida mTurquoise2 e mEYFP do substrato recombinante codificando o lado do decote entre a matriz e as proteínas capsidas da proteína anecóica natural do HIV. O ensaio baseado em contas magnéticas níquel-NTA é uma ferramenta útil para examinar o efeito da concentração de substrato na velocidade de reação e, assim, também torna possível a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos como Vmax e Km. O diagrama A mostra um resultado ideal obtido após uma análise realizada com sucesso da atividade dependente de substrato em um substrato fundido por mApple.Em contraste, o diagrama B apresenta um resultado sub-ideal onde a homogeneização insuficiente da solução de estoque SAMB causa problemas na configuração das concentrações adequadas de substrato, enquanto o término inadequado das amostras de reação resulta em erros relativamente altos. O ensaio também fornece uma ferramenta adequada para a realização de estudos de tempo-curso e inibitórios. O diagrama A demonstra a dependência do tempo do decote proteolítico da protease HIV-1 em um substrato fundido por mEYFP, enquanto o diagrama B representa o efeito inibidor do amprenavir na reação do decote.A partir dos dados obtidos pelo estudo inibidor, tanto a concentração enzimática ativa quanto a constante inibitória podem ser determinadas. O ensaio também pode ser otimizado para estudar a dependência da atividade enzimápica no pH, pois é representado pelo diagrama A no exemplo da protease do vírus da etch do tabaco. O diagrama B indica uma limitação do ensaio por pH e mostra que o pH neutro ou ligeiramente alcalino é totalmente compatível com as medidas, enquanto o pH ácido facilita a dissociação espontânea dos substratos da superfície das contas magnéticas.A presente figura mostra os substratos fluorescentes intactos purificados, os fragmentos fluorescentes de decote terminal C, gerados pela digestão em solução pelo HIV-1 protease. Os componentes fluorescentes podem ser detectados no gel de poliacrilamida contendo SDS por transilluminação de luz azul logo após a eletroforese se as condições de não desnaturação foram aplicadas durante a preparação da amostra. As diferentes proteínas fluorescentes podem ser diferenciadas com base em sua cor.Após o ensaio à base de contas magnéticas, as proteínas fluorescentes não desnaturadas na amostra de supernantes também podem ser detectadas no gel pela iluminação UV. Em contraste, se as condições de desnaturação forem aplicadas durante a preparação da amostra, as proteínas desnaturadas não podem ser detectadas no gel imediatamente após a PÁGINA do SDS. No entanto, as proteínas fluorescentes desnaturadas podem ser parcialmente renaturadas pela remoção do SDS do gel e se tornam detectáveis.Portanto, a PÁGINA SDS é seguida pelo procedimento de renaturação em gel. A capacidade de renaturação das proteínas fluorescentes torna sua identificação possível não apenas com base em sua fluorescência, mas também com base em seu peso molecular. Aqui demonstramos o protocolo para o uso de nossa plataforma de ensaios fluorescentes de protease fluorescentes recentemente desenvolvida.Demonstramos o uso desse sistema no exemplo de estudos cinéticos enzimáticos sobre protease do HIV-1. Usamos formas fundidas de mTurquoise e mApple do substrato de ensaio recombinante, que continha a sequência do local de decote do protease. Além da análise fluormétrica, as amostras de ensaio também foram posteriormente analisadas pela SDS PAGE.Demonstramos que as proteínas fluorescentes desnaturadas podem ser parcialmente renaturadas no gel após a PÁGINA da SDS, que fornece identificação baseada em peso molecular e fluorescente do substrato e dos fragmentos proteolíticos.

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Bioquímica

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