Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

O método Contact Bubble Bilayer é uma técnica alternativa para bicamadas lipídicas convencionais. e este método permite vibração mais versátil através da membrana. O método CBB integra os benefícios do Planar Lipid Bilayer e do método de remendo.

Como técnica de bicamadas lipídicas, uma CBB com uma composição lipídica arbitrária pode ser formada. Desenvolvemos um CBB para gravações de corrente de canal único com alta relação sinal/ruído. Este método permite variedades de vibrações de membrana e oferece uma vasta plataforma tipo para a interface de membrana de canal.

Todo mundo já experimentou soprar uma bolha de sabão. Manobras semelhantes são tomadas para a formação de CBB, ajustando manualmente a pressão aplicada em vez de soprar pela boca. Pratique e aproveite a CBB.

Para ser este procedimento dispersar fosfolipídios em clorofórmio em uma concentração desejada em um frasco fundo redondo. Coloque a solução fosfolipítida em um evaporador rotativo conectado a um cilindro de gás nitrogênio. Gire o frasco sob o fluxo de nitrogênio à temperatura ambiente até que uma fina película fosfolipílica apareça.

Em seguida, coloque o frasco aberto em um dessecator conectado a uma bomba de vácuo. Usando a bomba de vácuo aspira o interior do dessecator por várias horas para remover completamente o clorofórmio. Posteriormente adicione um volume apropriado de solução de eletrólito ao frasco e suspenda o fosfolipídio para obter dois milligrmas por suspensão fosfolipídida mililitro.

Sonciar a suspensão por 20 a 30 segundos usando um sonicator de banho para obter uma suspensão de vesícula multicamadas. Para a preparação de proteolipósos que contenham proteínas do canal de íons, adicione uma solução proteica à suspensão de vesícula multicamadas. E sonicate por vários segundos usando o sonicator de banho.

Para preparar grandes pipetas de vidro, coloque um capilar de vidro em um puxador de pipeta e forja a micropipette com uma fina ponta afilada através de dois passos puxando. Em seguida, coloque a micropipette em uma micro forja e entre em contato com a ponta da micropipette a um filamento de platina na porção afilada com um diâmetro de 30 a 50 micrômetros. Aqueça o filamento brevemente e desligue-o imediatamente.

O uso de água destilada e etanol limpa a superfície do escorregador de vidro com um poço raso. Em seguida, aplique o reagente de silício no slide de vidro e deixe o reagente secar completamente no ar. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro no palco de um microscópio invertido.

Adicione 100 microlitadores de hexadecano no poço raso do escorregador de vidro siliconado. Usando uma seringa tuberculina encha a solução de eletrólitos até metade do comprimento da micropipette. Em seguida, coloque a micropipette no suporte de micropipette com a porta de pressão, permitindo que o eletrodo do fio de cloreto de prata/prata mergulhe na solução de eletrólitos de pipeta.

Conecte um dos suportes de micropipette ao estágio da cabeça de um amplificador de grampo de remendo e o outro ao solo elétrico. Posteriormente, conecte um microinjetor à porta de pressão do suporte de micropipette. Ajuste a micropipette a uma posição apropriada acima do estágio de um microscópio invertido usando o micromanipulador.

Para ajustar o potencial de deslocamento do eletrodo, coloque um microliter da mesma solução de eletrólito usada para encher a micropipette na superfície plana ao redor do poço raso do deslizamento de vidro para criar uma cúpula eletrólito. Mergulhe a ponta de ambos os micropipettos na cúpula eletrólito. Depois ajuste o potencial de deslocamento do eletrodo do amplificador de grampo de remendo.

Para extrair a solução lipossa da ponta, adicione um microliter de solução lipossa na superfície plana ao redor do poço raso do vidro deslizante. Em seguida, coloque a ponta da micropipette na cúpula que contém liposom. Aspire a solução contendo lipossomo usando o microinjetor.

Repita o procedimento para a outra mircopipette para lipossomos reconstituídos do canal aspirado. Agora coloque a micropipette no hexadecano no poço raso. Sopre uma bolha de água lentamente aumentando a pressão até que a bolha atinja o tamanho desejado e mantenha a mesma pressão depois disso.

Descarte a bolha passando a ponta através da interface óleo-ar se for difícil manter o tamanho da bolha estável. Repita os procedimentos até formar duas bolhas estáveis. Estabeleça um contato entre as duas bolhas.

Ajuste a pressão para manter o tamanho da bolha, porque o tamanho pode mudar gradualmente mesmo com a pressão intra-bolha constante. Defina o potencial da membrana para o valor apropriado usando o amplificador de reivindicação de patch e aguarde que a corrente do canal surja. Para formação de bicamadas lipídicas estáveis é essencial limpar as manchas.

A preparação capilar de vidro ou pipeta deve ser lavada completamente e evitar a contaminação pelas moléculas de detergente. Uma vez que a CBB tinha formado as moléculas do canal em solução aquosa ou no lipossomo foram espontaneamente inseridos na bicamada dentro de alguns a dezenas de minutos. As inserções dos canais foram confirmadas pelo aumento da amplitude atual sob o potencial de membrana aplicada.

Um bicamado formado pelo método CBB pode ser desintegrado em duas monocamadas. A corrente do canal pTB surgiu imediatamente após anexar as duas monocamadas. E a corrente ficou maior à medida que o contato aumentava a amplitude da corrente sincronizada com a manipulação de desvinculação da CBB.

Se o número de bolhas aumentar a concentração lipídica na solução aquosa diminuir e a monocamada não for formada. Em seguida, tente aliviar a pressão na seção liposso. Uma vez estabelecida a formação da CBB e a reconstituição do canal, você pode tentar variar as composições de solução aquosa e membrana através de profusão ou injetando uma substância hidrofílica ou hidrofóbica.

O método CBB abriu formas versáteis de explorar as interações entre canais e membranas.