Preparação de Poly(pentafluorophenyl acrylate) acrescida SiO2 grânulos para purificação de proteínas
19 de novembro de 2018
Um protocolo para a preparação de poli (acrilato de pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) enxertados grânulos de sílica é apresentado. A superfície funcionalizados poly(PFPA) é então imobilizada com anticorpos e usada com sucesso para a separação de proteínas através da imunoprecipitação.
Este método pode ser usado para preparar superfícies ativadas por biomoléculas, que têm aplicações em áreas como entrega de medicamentos, detecção de alvos biológicos e bio separação. A principal vantagem dessa técnica é que os pincéis poly PFPA são altamente reativos com aminas, e a imobilização de anticorpos é alcançada pela incubação em solução tampão por algumas horas. As implicações desta técnica se estendem para a purificação da proteína através da imunopurificação, já que o anticorpo imobilizado pode se ligar com os antígenos alvo.
Embora este método seja demonstrado para mobilização de anticorpos e purificação de proteínas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que requerem mobilização biomolecular. Para tratar contas de dióxido de silício com APTES, primeiro obtenha partículas de dióxido de silício na forma de uma suspensão aquosa de volume de peso de 5%. Combine 0,8 mililitros de suspensão de dióxido de silício com 40 miligramas de APTES, e oito mililitros de metanol em um frasco de cintilação de 20 mililitros equipado com uma barra de mexida.
Deixe a reação prosseguir à temperatura ambiente por cinco horas com agitação vigorosa. Depois de cinco horas, transfira a solução para um tubo cônico. Para isolar as contas de dióxido de silicone funcionalizadas APTES, centrifugar a solução a 10.000 G durante cinco minutos.
Em seguida, remova o supernaspe. Agora lave as contas repaginando-as em três mililitros de metanol fresco. Aperte o tubo à mão para misturar, mas, se necessário, melhore a dispersão por sônica em um banho de água por alguns segundos.
Centrifugar como antes, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. Combine as contas de dióxido de silicone de lavagem de metanol com três mililitros de sulfóxido de dimetil, ou DMSO. Agite a mistura à mão, ou se necessário, sonicar por alguns segundos até que as contas estejam totalmente dispersas no DMSO.
Após a centrifugação antes, remova o sobrenante. Repita a etapa de centrifugação um tempo final para garantir a troca completa de solventes do metanol para o DMSO. Para preparar a solução poly PFPA, dissolva 20 miligramas de pfpa de poli em dois mililitros de DMSO em um frasco de cintilação de 20 mililitros.
Para preparar a solução PEG, dissolva peg funcionalizado de amina em um mililitro de DMSO. Agora transfira a solução PEG para a solução poly PFPA. Reaja à temperatura ambiente por uma hora com agitação vigorosa.
Transfira um mililitro das contas de dióxido de silício funcionalizadas APTES suspensas em DMSO para a solução DE POLI PFPA substituída pelo PEG. Permita que o enxerto entre as contas de dióxido de silício funcionalizante poly PFPA e APTES prossiga à temperatura ambiente por uma hora com agitação vigorosa. Em seguida, isole as contas por centrifugação a 10.000 G por cinco minutos, seguido pela remoção do supernasce.
Lave as contas adicionando três mililitros de DMSO, e misture à mão ou com alguns segundos de sônica. Centrifugar as contas como antes. E remova o supernatante antes de repetir a lavagem do DMSO duas vezes.
Lave as contas mais duas vezes com três mililitros de água tripla destilada. Em seguida, misture à mão ou com alguns segundos de sônicação. Centrifugar as contas como antes e remover o supernatante.
Por fim, seque as contas a 40 graus celsius em um forno a vácuo durante a noite. Adicione cinco miligramas de contas de dióxido de silício enxertadas de poli PFPA a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Lave as contas adicionando 800 microliters de PBS, e misture bem com vórtices.
Centrifugar as contas a 10.000 G em temperatura ambiente por um minuto. Retire o supernatante e repita o passo de lavagem três vezes. Agora adicione 350 microliters de PBS fresco, 50 microliters de 0,1% PBST e 6,67 microgramas do anticorpo.
Incubar aproximadamente 20 horas em uma rotadora a quatro graus celsius. No dia seguinte, lave as contas e a centrífuga a 400 G e 4 graus celsius por um minuto. Em seguida, remova o supernascer e adicione cuidadosamente 400 microliters de tampão de lise.
Levemente resuspenque as contas pipetting para cima e para baixo cinco vezes. Repita esta etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o máximo possível do supernante.
Prepare células e tampão de lise conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, resuspenja a pelota celular com 400 microliters do tampão de lise. Sonicar as células usando um ultra sonicator.
Após a sônicação, vórtice brevemente. Em seguida, centrifugar o lysate a 20.000 G a quatro graus celsius por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Para realizar a imunoprecipitação, transfira 300 microlitadores de lisato celular para contas de dióxido de silício enxertadas poli PFPA previamente preparadas. Retenha 30 microlitadores do liseto celular como a amostra de entrada em um novo tubo de microcentrifuagem. Incubar a mistura de contas de lise por três horas em um rotador a quatro graus celsius.
Após a incubação, centrifugar a mistura a 400 G a quatro graus celsius por um minuto. Remova o supernatante e adicione cuidadosamente 400 microliters de tampão de lavagem. Levemente resuspenque as contas pipetting para cima e para baixo cerca de cinco vezes.
Depois de três lavagens, remova o máximo possível do supernante. Adicione 30 microliters de corante de carregamento SDS 2x às contas e à amostra de entrada. Em seguida, aqueça-os por 10 minutos a 95 graus celsius.
Após o aquecimento, analise a amostra usando manchas ocidentais ou armazene a amostra a menos 20 graus celsius. As contas de sílica funcionalizada são examinadas por espectroscopia fotoeletrrona de raios-X, ou XPS, para determinar a composição da superfície. Os dados do Representante XPS são mostrados aqui.
Após o tratamento APTES, o pico de nitrogênio 1s associado à zona do grupo de amina APTES é detectado. Após o tratamento de poli PFPA, o pico de flúor 1s associado às unidades pfp no polímero é detectado. RNA de quinase proteica ativado, ou enriquecimento PKR através da imunoprecipitação é realizado, e a amostra de proteína aludida é analisada usando mancha ocidental.
Como esperado, contas imobilizadas sem anticorpos, ou uma mixtura de anticorpos não específica não mostram recuperação de PKR. As contas incubadas com anti-PKR podem enriquecer com sucesso o PKR, como indicado pela presença de uma banda PKR e pela ausência de banda GAPDH. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, ao comparar sistemas, os experimentos ip, bem como a análise subsequente de manchas ocidentais devem ser feitos simultaneamente.
Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser utilizada para a imobilização de diferentes substratos biomoleculares ou materiais. Além disso, este método tem o benefício adicional de sintonizar apenas a propriedade de superfície a ser adaptada para atender à necessidade de cada aplicativo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a preparação de microesferas de sílica revestidas com poli(acrilato de pentafluorofenila) (poli(PFPA)), funcionalizadas com anticorpos para separação de proteínas por imunoprecipitação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia biomolecular
- Purificação de proteínas
- Técnicas de imunoprecipitação
Contexto
- Escovas de poli(PFPA) são altamente reativas com aminas.
- A imobilização de anticorpos é realizada mediante incubação em solução tampão.
- Este método possui aplicações na liberação de fármacos e na detecção de alvos biológicos.
- As esferas de dióxido de silício são tratadas com APTES para modificação da superfície.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para criar superfícies ativadas por biomoléculas.
- Aprimorar os processos de purificação de proteínas.
- Demonstrar a versatilidade da técnica para diversas aplicações biomoleculares.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma suspensão aquosa a 5% peso por volume de partículas de dióxido de silício.
- Combinação da suspensão de dióxido de silício com APTES e metanol.
- Incubação da mistura para facilitar a modificação da superfície.
- Imobilização de anticorpos para imunoprecipitação subsequente.
Resultados Principais
- Imobilização bem-sucedida de anticorpos em superfícies funcionalizadas com poli(PFPA).
- Interação eficaz dos anticorpos imobilizados com antígenos-alvo.
- Demonstração da aplicabilidade do método para purificação de proteínas.
- Potencial de uso em outros sistemas que exigem mobilização biomolecular.
Conclusões
- As microesferas de sílica enxertadas com poli(PFPA) fornecem uma plataforma robusta para separação de proteínas.
- Essa técnica pode ser adaptada para diversas aplicações biomoleculares.
- A exploração adicional desse método pode aprimorar sistemas de entrega e detecção de fármacos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a preparação de superfícies reativas de microesferas de sílica para imobilização de anticorpos, apoiando fluxos de trabalho de purificação de proteínas em etapas subsequentes. A estratégia de enxerto de poli(PFPA) fornece uma plataforma ajustável para captura de biomoléculas, aumentando o enriquecimento do alvo enquanto minimiza interações não específicas. Tais superfícies melhoram a confiabilidade e a escalabilidade de ensaios baseados em imunoprecipitação na validação inicial de alvos e na descoberta de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do enriquecimento específico de antígenos utilizando anticorpos imobilizados.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao reduzir o ruído de fundo em estudos de interação proteica.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança nos dados de engajamento de alvo por meio de resultados reprodutíveis de imunoprecipitação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz esferas revestidas com anticorpos padronizadas, adequadas para ensaios quantitativos de precipitação.
- Valor Operacional: Garante consistência entre lotes por meio do monitoramento da funcionalização da superfície por XPS e DLS.
- Prontidão para Ensaios: Facilita fluxos de trabalho de triagem ao permitir captura rápida e reversível de biomoléculas em condições fisiológicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a validação de alvos em fase de descoberta à análise de biomarcadores pré-clínicos por meio de eficiência consistente em IP.
- Sistema Relevante para a Doença: Demonstra utilidade no enriquecimento de PKR, uma quinase envolvida em vias de resposta ao estresse relevantes para oncologia e neurodegeneração.
- Mitigação de Riscos: Reduz falsos positivos na desmistificação de alvos ao minimizar a ligação proteica não específica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo a captura de antígenos para estudos mecanicistas e desenvolvimento de ensaios.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio do enriquecimento específico de antígenos a partir de lisados complexos.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da imobilização quantificável de anticorpos e recuperação de antígenos.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (por exemplo, sinal em Western blot) para comparação de condições de ligação e desempenho de anticorpos.
- Pesquisa Translacional: Conecta a validação inicial de alvos à continuidade pré-clínica por meio de eficiência reprodutível em imunoprecipitação.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma plataforma de química de superfície reutilizável, adaptável a múltiplos alvos de anticorpos e escalas de purificação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo por meio do enriquecimento específico do antígeno e baixo fundo.
- Valor Operacional: Oferece funcionalização superficial reprodutível, verificável por espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS) e análise de tamanho de partículas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção do projeto ao aumentar a confiança preditiva nas relações entre alvo e doença.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados confiáveis de imunoprecipitação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em química de superfície e técnicas de imobilização biomolecular.
- Necessita de acesso à infraestrutura de espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS), dispersão dinâmica de luz (DLS), centrifugação e Western blot.
- Exige padronização entre equipes para garantir eficiência consistente na enxertia de APTMS e poli(PFPA).
- Requer testes de adaptação ao ser aplicado a biomoléculas não anticorpo ou substratos de microesferas alternativos.
- Limitado pela necessidade de ligantes contendo aminas para a troca de PFP, o que restringe o uso direto com químicas de superfície não aminadas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:54
Preparation of Poly(PFPA) Functionalized SiO2 Beads
2:31
Preparation of SiO2 Beads Grafted with PEG-Substituted Poly(PFPA)
4:06
Antibody Immobilization on Poly(PFPA) Grafted SiO2 Beads
5:20
Cell Lysis and Immunoprecipitation
7:00
Results: Analysis of Poly (pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification
8:09
Conclusion
