Name: Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a estabelecer infecção viral em Drosophila melanogaster usando nano-injeção para análise de interação vírus-hospedeiro. Este método permite controle preciso da dose viral e estudo de dinâmicas de infecção in vivo.

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Gostaríamos de agradecer o laboratório Pan todo em IPS. CAS. Agradecemos o Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) para assistência experimental e Dr. Gonalo Cordova Steger (natureza de Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) e Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) para comentários. Este trabalho foi apoiado por concessões do programa estratégico de pesquisa prioritárias da Academia Chinesa de Ciências L.P (XDA13010500) e h. t (XDB29030300), a Fundação ciência Natural nacional da China para L.P (31870887 e 31570897) e J.Y (31670909). L.P é um membro da Associação de promoção de inovação do CAS da juventude (2012083).

Nota: Antes de iniciar o experimento, as linhas celulares e voar estoques usados devem não ser contaminados por outros patógenos, especialmente para vírus como DCV, FHV, Drosophila X vírus (DXV) e nefrite aviária (ANV). Idealmente, a sequenciação do ARN ou uma simples identificação de PCR-baseados são usados para detectar a contaminação10,45. Se a contaminação ocorreu, as linhas celulares e estoques voar não devem ser usados mais, até que estejam completamente descontaminados46.
1. vírus e preparação de voar
<ol><li>Recolha e propagação de vírus Nota: Drosófila S2 * células são utilizadas para a titulação e a propagação de DCV. A linha de celular S2 * é derivada de uma cultura primária de embriões de d. melanogaster estágio finais. Esta linha de celular tem sido bem descrito anteriormente47.<ol>
<li>Cresce S2 * células num meio de Drosophila Schneider em 25 ° C, sem adicionais de CO2, como um monolayer semi aderente, solto uma placa de cultura de célula 10 cm, com uma densidade de 1 x 107 células viáveis/mL. Meio completo de uso para S2 * células: drosófila médio da Schneider contendo 10% calor inativada FBS, 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina de 100 μg/mL. Nota: As células saudáveis devem mostrar uma forma redonda e exibem tamanho homogêneo.</li>
		<li>Descongele rapidamente o estoque DCV de-80 ° C em banho de água de 25 ° C. Infectar células S2 * com DCV em MOI = 0,01 imediatamente, diretamente, adicionando 1 mL de solução de antivírus para os pratos de cultura celular (área de crescimento: 55cm2) com 10 mL de meio completo para S2 * células.</li>
		<li>Incube as células a 25 ° C durante 3 a 5 dias. Quando o vírus está pronto para a coleção, a morfologia celular é anormal (forma da célula parece borrão) e o meio de cultura é cheio de partículas pretas indicativas de detritos celulares.</li>
		<li>Recolher a cultura de células inteiras em um tubo de 15 mL pipetando para cima e para baixo e congelar a-80 ° C (por até um ano). Nota: DCV pode ser armazenada por períodos prolongados de tempo a-80 ° C, com mínima perda de infecciosidade, por até um ano.</li>
		<li>Descongelar a cultura de células em um banho de água de 25 ° C com agitação constante e centrifugar a 6.000 x g, durante 15 min a 4 ° C. Recolha o sobrenadante em um tubo estéril 15 mL e vortex. Alíquota até 200 μL de solução de vírus por tubo. Nota: Alíquotas de vírus podem ser armazenadas por períodos curtos de até 3 dias a 4 ° C e até 1 ano a-80 ° C. Ciclos repetidos de congelamento-descongelamento devem ser evitados. É sempre melhor usar alíquota todas de uma vez.</li>
		<li>Escolha 5 tubos contendo vírus aleatórios para determinar a dose infecciosa de cultura de tecidos de vírus média (TCID50) por um ensaio de efeito citopático (ECP) (1 unidade de TCID50= 0.7 placa formando unidade [PFU]). Nota: CPE refere-se a alterações estruturais em células hospedeiras causadas pela invasão viral. O vírus infectante causa lise da célula hospedeira, ou quando a célula morre sem lise devido a uma incapacidade de reproduzir48.<ol>
<li>No dia 1, colete preparado S2 * células pipetando. Conte o número de celular. Centrifugar as células para 300 x g, durante 4 min e descartar o sobrenadante. Dilua as células para a densidade de 1 x 106 células/mL com meio completo para S2 * células conforme descrito na etapa 1.1.1.</li>
			<li>Sementes de 1 x 105 S2 * (100 μL) de células por bem para o fundo plano 96--placa (~ 30% confluência).</li>
			<li>Realize diluições de 10 vezes em série da unidade populacional DCV com meio completo para S2 * células. Adicione 50 diluições µ l para o poço. Adicione 50 µ l de meio de cultura sem vírus ao poço classificado bem como controlo negativo. Nota: Para cada taxa de diluição, 8 poços foram usados. Como o rendimento típico de DCV é cerca de 108-109 PFU/mL, a diluição deve cobrir pelo menos ~ 10-5-10-10.</li>
			<li>No dia 4, observe o CPE, com um microscópio de campo claro com o objetivo de X 40 ou 20 X. Classifica um poço no qual as células olham embaçadas e o meio está cheio de fragmentos como um "Bem positivo" e um poço no qual a morfologia celular é normal como "bem negativo".</li>
			<li>Poços de positivo ou negativos de Mark CPE com + ou –, respectivamente. Calcule o vírus TCID50 pelo método de Reed e Muench49.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elimine todos os materiais contaminados e luvas na panela descontaminação. Se o vírus não pode alcançar o desejado TCID50, concentrar-se 100 mL de solução de vírus por centrifugação a 68.000 x g, durante 1 h a 4 ° C. Nota: dependendo do objetivo do experimento, uma gama de doses de 102 a 10 unidades de6 TCID50 pode ser usado para infecção por vírus. Normalmente, usamos 3 x 106 TCID50 unidades.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de tampão Tris-HCl (10 mM, pH 7,2). Alíquota 20 μL de solução de vírus por tubo e loja a-80 ° C. Escolha 5 tubos aleatórios para determinar o vírus médio TCID50 novamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação para a infecção de voar Nota: Bactérias simbióticas Wolbachia podem suprimir muitos tipos de infecção de vírus de RNA em insetos30,31,32,33,41. Assim, é essencial para limpar Wolbachia do moscas antes de estudar o hospedeiro-vírus infecção na vivo33.<ol>
<li>Prepare-se voar alimentos contendo tetraciclina adicionando 400 μL de 50 tetraciclina µ g/mL (em etanol a 70%) para 4 g de farinha de milho fresco padrão mosca alimentos (1L de comida contém 77,7 g de farinha de milho, 32,19 g de levedura, 10,6 g de ágar-ágar, 0,726 g de CaCl2 31,62 g de sacarose, 63,3 g de glicose, 2 g de sorbato de potássio e 15 mL de 5% C8H8O3). Misture bem e coloque os alimentos a 4 ° C durante a noite para evaporar o álcool etílico. Nota: Uma alta dose de etanol pode afetar a fertilidade voar, então não omitir este passo.</li>
		<li>Aquecer o alimento à temperatura ambiente e coloque recém eclosed moscas adultas (20 fêmeas e 10 machos) no frasco. Reproduzem as moscas a 25 ° C, umidade de 60% em um ciclo normal de claro/escuro. Nota: Normalmente, demora de 3 a 4 dias para as moscas desovar o suficiente. Muitos ovos inibem o desenvolvimento de larvas e diminuem a eficiência de tetraciclina.</li>
		<li>Coletar recém eclosed moscas adultas (dentro de 3 ~ 5 dias) sob um fluxo de luz de CO2e repita a etapa ~ 1.2.1-1.2.2. Normalmente, pelo menos 3 gerações são necessárias para a eliminação de Wolbachiacompletamente.</li>
		<li>Depois de 3 gerações com tratamento de tetraciclina, colete 5 moscas em um fluxo de luz de CO2 para o teste de infecção Wolbachia . Moscas para 1 min com 250 μL de água bidestilada (ddH2O) e alguns grânulos 0.5 mm cerâmica estéril em um tubo de 1,5 mL usando um homogeneizador de moer. Adicionar outro 250 μL de 2x tampão A (0.2 M Tris-HCl, pH 9.0; EDTA 0,2 M; 2% SDS) para a amostra e o vórtice. Nota: Desde que o SDS impedirá o movimento do grânulo, 1 x A reserva não pode ser diretamente usado para moer moscas. Se as moscas têm olhos vermelhos, remova cabeças antes da trituração, como isso pode influenciar a cor do produto de DNA.</li>
		<li>Congele as amostras a-80 ° C (manter por até um ano). Rapidamente a descongelar a amostra de-80 ° C em banho de água de 25 ° C, até dissolver. Incube as amostras a 70 ° C por 30 min.</li>
		<li>Adicionar 190 μL de 5 M KOAc, vórtex e incubar no gelo por 15 min ou mais.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente, recolher o sobrenadante e transferi-los para novos tubos.</li>
		<li>Repita a etapa 1.2.7 para obter DNA com melhor qualidade.</li>
		<li>Adicionar 750 μL de isopropanol para cada amostra e inverta suavemente várias vezes à mão. Incube a temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. O pellet de DNA genômico branco vai ficar no fundo do tubo.</li>
		<li>Adicione 1 mL de etanol a 70% nas pelotas, centrifugar 13.000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Secar o DNA até que se torne transparente.</li>
		<li>Dissolver o DNA em 100 μL de DDQ2O, titula-se concentração de DNA por espectrofotometria de absorção UV-Vis e o DNA de 100 ng/μL.</li>
		<li>Uso 200 ng de DNA para a reação de PCR (em um sistema de 20 μL, consulte a Tabela de materiais). Realizar PCR pelo seguinte programa: 95 ° C por 15 min; ciclo de 36 de 95 ° C por 45 s, 50 ° C durante 45 segundos e 72 ° C por 1 min; e uma etapa final de extensão (72 ° C por 1 min) em um termociclador. Nota: A Wolbachia 16S rRNA, usam os seguintes primers: 5' TGAGGAAGATAATGACGG 3' (em frente) e 5' CCTCTATCCTCTTTCAACC 3' (reverso). Para wsp, os primers foram 5' CATTGGTGTTGGTGTTGGTG 3' (em frente) e 5' ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3' (reverso).</li>
		<li>Analise os produtos de PCR com eletroforese em gel de agarose a 1%. O tamanho do produto do PCR de Wolbachia 16S rRNA e wsp é em torno de 200 bp e 600 bp, respectivamente.</li>
		<li>Traseira Wolbachia livre voar estoque na comida de mosca de fubá padrão. Coletar de 3 a 5 dias recém eclosed macho voa para a infecção. Nota: Tratamento de tetraciclina também pode afetar a composição da microbiota intestinal, que posteriormente influencia respostas antivirais no acolhimento. Recomendamos que todas as moscas devem receber os mesmos tratamentos de tetraciclina. Manter livre de Wolbachia moscas crescer sob condições normais de pelo menos 3 gerações restaurar a microbiota do intestino.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipagem de Pastrel Nota: A presença do alelo S ou R do gene pst no fundo genético foi relatada para afetar a infecção de DCV em Drosophila34,35. É necessário verificar o genótipo de pst , especialmente para a infecção de DCV. Existem alguns SNPs em pst que podem afetar a infecção pelo vírus, o SNP major é 512 C/T. O gradiente de temperatura do PCR é um método rápido para identificar o genótipo de pst .<ol>
<li>Extrato de voar DNA genômico como descrito acima (passo 1.2.4 - 1.2.15).</li>
		<li>Uso 100 ng de DNA como o modelo, o primer de 512C, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTC 3' (em frente) e 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (reverso) para detectar o alelo R, o primer 512T, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTT 3' (em frente) e 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (reverso) para detectar o Alelo S.</li>
		<li>Definir os gradientes de Tm (temperatura de fusão) da seguinte forma: 54 ° C, 54,7 ° C, 55,5 ° C, 58 ° C, 59,7 ° C, 62,2 ° C, 63,7 ° C e 64 ° C (45 s a cada temperatura). Nota: 30 ciclos de PCR reação em cadeia são recomendados (sistema de 20 μL).</li>
		<li>Visualize o produto do PCR 100-bp por eletroforese em gel de agarose 2%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. viral infecção em Drosophila
<ol><li>
Infectar moscas por nano-injeção e realizar ensaios de sobrevivência.
	<ol>
<li>Puxe os capilares para preparar as agulhas de injeção, costas-encha a injeção da agulha com óleo e montar o injector como descrito anteriormente50.</li>
		<li>Anestesiar moscas na almofada sob um fluxo de luz de CO2. Inocular moscas por injeção intra torácica44 de 50,6 nL de solução de antivírus (PFU 100, diluído em tampão Tris-HCl, pH 7,2). Injete pelo menos 3 frascos de moscas (20 moscas por frasco). Nota: A injeção é demoradas (geralmente 100 moscas por hora) e replicação de DCV é muito rápida, por isso é muito importante anotar a hora exata no tubo uma vez terminando cada frasco (20 moscas). Injeção única de buffer é definida como um controle de simulação. Geralmente, moscas adultas masculinas são preferidas, como os resultados são mais estável e reprodutível do que quando usando fêmeas desde que as variações hormonais durante o acasalamento e reprodução podem influenciar a leitura de fêmeas51.</li>
		<li>Crescem as moscas injetadas a 25 ° C, 60% de umidade sob um ciclo normal de claro/escuro. Fornecemos moscas com alimentos frescos diariamente e registrar o número de mortos ﬂies.</li>
		<li>Realizar pelo menos 3 réplicas biológicas e traçar a curva de sobrevivência.</li>
		<li>Para a análise estatística dos dados de sobrevivência, gere curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier pelo software estatístico. Execute teste de log-rank para calcular os valores de P. Na tabela de sobrevivência, insira informações para cada disciplina. O software então calcula a sobrevivência por cento a cada momento e traça um plano de sobrevivência de Kaplan-Meier. Nota: Não adicione o fermento adicional dentro do frasco. Comparado com controles simulados, moscas infectadas por DCV ocasionalmente têm ascite e desajeitadas, que torná-lo vulnerável para o fermento pegajoso. É melhor gravar mais tempo pontos no experimento preliminar para descobrir um período de tempo no qual a morte maciça acontecerá para moscas infectadas. Geralmente, as moscas infectadas raramente morrem nos primeiros dois dias, mesmo para as linhas mutantes Dcr-2 . Para a Wolbachia voar livre w1118 (Bloomington 5905) infectado com 100 PFU de DCV, esta janela de tempo é em torno de 3 a 5 dias pós infecção. As moscas de fruta que morrer em poucas horas de injeção 0,5 h post deve não serão contadas como uma fatalidade porque eles podem ser mortos por lesão de agulha não por infecção viral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DCV carga medida pelo ensaio CPE Nota: Carga Viral é medida da mesma forma para a titulação da unidade populacional de vírus (etapa 1.1.6) mas requer preparação da amostra adicional (passo 2.2.1-2.2.4).<ol>
<li>No dia 1, infectar moscas masculinas, conforme descrito no passo 2.1.1-2.1.2. Grupo de moscas injetadas em grupos de 20 e mantê-los a crescer em alimentos frescos de voar para o tempo desejado (normalmente por 24 horas ou 3 dias). Fornece moscas com alimentos frescos diariamente.</li>
		<li>No dia 2, semente drosófila S2 * células numa placa de cultura de células de 10cm para a densidade de aproximadamente 5 x106 a 1 x 107 células/mL conforme descrito na etapa 1.1.1.</li>
		<li>No dia 3, coletar 5 moscas (sob um fluxo de luz de CO2) e triturá-los em um tubo de centrífuga de 1,5 mL por 30 s com 200 µ l de tampão Tris e grânulos cerâmicos usando homogenizador. Armazenar as amostras a-80 ° C ou imediatamente prosseguir para a próxima etapa.</li>
		<li>Vórtice completamente a amostra. Use uma seringa de 1 mL e 0,22 μm para filtro o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Prossiga com a titulação, conforme descrito em etapas 1.1.6.1-1.1.6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carga DCV, medida por qRT-PCR
	<ol>
<li>No dia 1, infectar moscas como descrito acima. Grupo injetado macho voa (20 moscas/grupo) e crescer em alimentos frescos de voar para o tempo desejado, normalmente para 24h ou 3 dias. Fornece moscas com alimentos frescos diariamente.</li>
		<li>No dia 3, coletar 5 moscas em um fluxo de luz de CO2 em um tubo de 1,5 mL com 200 μL de tampão de Lise e 20 grânulos cerâmicos (diâmetro = 0,5 mm), moer as amostras por homogenizador com alta velocidade de 30 s. Adicionar 800 μL de tampão de Lise adicionais a cada tubo e armazenar o s práticas a-80 ° C ou imediatamente realizar a extração do RNA e qRT-PCR.</li>
		<li>Preparar dicas grátis de RNase, tubos e água deionizada, diethylpyrocarbonate (DEPC) tratada e água de filtro de membrana 0,22 µm. Adicionar 200 μL de clorofórmio (99.5%) para a amostra e vigorosamente agitar durante 15 s pela mão. Incube durante 5 min ou mais à temperatura ambiente até a fase da água e a fase orgânica são claramente separados. Nota: Clorofórmio é extremamente perigoso e deve ser manuseado com cuidado. Fazer não vórtice a amostra, o que aumentará o risco de contaminação de DNA.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Coletar 400 μL do sobrenadante e transferir o sobrenadante para tubos novos. Misture com o mesmo volume de isopropanol (≥ 99.5%), inverta suavemente as amostras para 20 vezes à mão e depois precipitar por 10 min ou mais à temperatura ambiente. Nota: Precipitação a-20 ° C irá aumentar o rendimento do RNA.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. RNA de branco pelotas são visíveis na parte inferior do tubo.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol a 70% (etanol em água DEPC) e inverter algumas vezes para lavar o RNA.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e seco do RNA por 5-10 min; RNA deve tornar-se transparente.</li>
		<li>Adicione 50 μL de água DEPC para a amostra, pipeta para poucas vezes e vortex.</li>
		<li>Tome 3 μL de RNA para titulada a concentração de RNA. Quantificar o RNA em 260 nm. Normalmente, a concentração de RNA extraída por este protocolo é aproximadamente 100-500 μg/μL, que é apropriada para a síntese do cDNA.</li>
		<li>Uso 2 μg de RNA para a síntese do cDNA. Diluir a amostra com 100 μL com DDQ2O e loja a-20 ° C.</li>
		<li>Faça qRT-PCR de acordo com as instruções do fabricante e execute qRT-PCR. Nota: Para a síntese do cDNA de DCV, primers aleatórios funcionavam muito melhor do que o primer poli A em nossas mãos. Expressão de RNAm DCV é normalizado para proteína endógena ribosomal 49 (rp49) mRNA. As primeiras demão do oligonucleotide usadas nesta parte: rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (em frente) e 5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (reverso); DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (em frente) e 5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (reverso); Vani, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (em frente) e 5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (reverso); vírus-induzida RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (em frente) e 5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (reverso).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, apresentamos um procedimento detalhado sobre como estabelecer um sistema viral infeccioso em adultos Drosophila melanogaster , usando nano-injeção. Os protocolos incluem a preparação de linhas apropriadas de voar e estoque de vírus, técnicas de infecção, a avaliação dos indicadores de infecciosas e a medição da resposta antiviral. Apesar de DCV é usado como um exemplo de um patógeno viral, dezenas de tipos diferentes de vírus foi bem sucedidas para estudo no sistema da drosófila. Além disso, foram ...

Emergentes de infecções virais, especialmente por arbovírus, tais como o vírus de Chikungunya1, o vírus da Dengue, a febre amarela vírus2 e ovírusZika3, ter sido uma enorme ameaça para a saúde pública, causando pandemias 4. assim, uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro tornou-se cada vez mais importante para o controle de epidemia e tratamento de doenças virais nos seres humanos. Para este objetivo, modelos mais apropriados e eficientes devem ser estabelecidos para investigar os mecanismos subjacentes a infecção pelo vírus.
Mosca da fruta, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fornece um sistema poderoso para investigar de5,de interação vírus-hospedeiro6 e tem provado para ser um dos modelos mais eficientes para estudar doenças humanas virais7 , 8 , 9. antiviral altamente conservada, sinalização de caminhos e ferramentas de genéticas incomparáveis fazem voa um grande modelo para produzir resultados significativos com implicações reais para estudos antivirais humanos. Além disso, moscas são fáceis e baratas de manter no laboratório e são convenientes para triagem em larga escala de novos fatores regulatórios6,10 no vírus e o hospedeiro durante a infecção.
Quatro principais vias antivirais altamente conservadas (ex., o RNA de interferência (RNAi) via11, o JAK-STAT caminho12, via NF-κB e a caminho de autofagia13) são bem estudados em Drosophila nos últimos anos6. A via RNAi é um mecanismo antiviral amplo que pode suprimir a maioria dos tipos de vírus infecção6,14. Este caminho por mutações nos genes como Dicer-2 (Dcr-2) ou Argonaute 2 (AGO2) podem levar ao aumento de vírus título e host mortalidade15,16,17. O pathway JAK-STAT tem sido implicado no controle da infecção por um vírus da família Dicistroviridae e família Flaviviridae em insetos, por exemplo., vírus C drosófila (DCV) em moscas16 e vírus do Nilo Ocidental (WNV) e o vírus da Dengue em mosquitos18,19. O pedágio da drosófila (homólogo ao pathway NF-κB humana) e percursos de deficiência imunológica (IMD) (semelhantes ao humano pathway NF-κB e TNF) estão envolvidos na defesa de vírus invasão20,21, 22. autofagia é outro mecanismo conservado envolvidos na regulação da infecção viral, que é bem caracterizada em Drosophila23,24. Assim, a identificação de fatores regulatórios novela destas vias e dissecação crosstalk entre estes sinalização antiviral e outros caminhos biológicos, tais como metabolismo, envelhecimento, reação neural e assim por diante, podem ser facilmente configurados na drosófila sistema.
Embora modelos de infecciosos virais mais bem estabelecidos em drosófila são induzidos por vírus de RNA, infecção pelos invertebrados iridescente vírus 6I (IV-6) e vírus de Kallithea demonstraram o potencial para o estudo dos vírus de DNA em moscas25, 26. Além disso, o vírus também pode ser modificado para permitir a infecção de Drosophila, tais como o vírus da gripe9. Isto expandiu-se enormemente a aplicação da plataforma de triagem de Drosophila . Neste procedimento, usamos DCV como exemplo para descrever como desenvolver um sistema infeccioso viral em Drosophila. DCV é um positivo-sentido único encalhado RNA vírus de aproximadamente 9300 nucleotídeos, codificação de proteínas 927. Como um patógeno natural de d. melanogaster, DCV é considerado como um vírus adequado para estudar a resposta imune do hospedeiro fisiológicos, comportamentais e basal durante hospedeiro-vírus interação e co-evolução28. Além disso, sua taxa de mortalidade rápida após infecção em moscas do tipo selvagem torna DCV útil para triagem de genes resistentes ou suscetíveis no anfitrião29.
No entanto, há vários aspectos de preocupação quando estudar infecções virais em Drosophila. Por exemplo, bactérias simbióticas Wolbachia têm uma capacidade de inibir uma ampla espectros de proliferação de vírus de RNA em Drosophila e mosquito31,de30,32. Evidência recente mostra um possível mecanismo no qual Wolbachia blocos Sindbis vírus (SINV) infecção através o upregulation do methyltransferase Mt2 expressão no anfitrião33. Além disso, o fundo genético de insetos também é fundamental para a infecção viral. Por exemplo, o natural polimorfismo no gene, pastrel (pst), determina a suscetibilidade à infecção de DCV em Drosophila34,35, enquanto Locus E2H-Ubc e CG8492 estão envolvidos em vírus de paralisia de Cricket (CrPV) e infecção por vírus (FHV) rebanho casa, respectivamente,36.
Os modos particulares para estabelecer a interação vírus-hospedeiro em moscas, deve ser escolhido de acordo com fins de investigação, tais como uma tela de alta produtividade para componentes celulares do hospedeiro em Drosophila célula linhas37,38, oral infecção para estudar a resposta antiviral específico do intestino22,39,40, agulha picando41,42 ou nano-injeção, passando as barreiras epiteliais para estimular imune sistêmica respostas. Nano-injeção pode controlar com precisão a dose viral para induzir uma reação antiviral controlada e uma lesão fisiológica43, garantindo alta reprodutibilidade experimental44. Neste estudo, descrevemos um método de nano-injeção para estudar interações do vírus-anfitrião em Drosophila, destacando a importância dos efeitos de fundo dos moscas.

<table><tbody><tr><td>Filtro de 0,22um</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Marca</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga sem RNase de 1,5 ml</td> Placa de cultura de células <td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Sigma</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>100 Tubos de substituição</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 qPCR sistema</td><td>ABI</td><td>7500</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Sanyo</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Eppendof</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Eppendof</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>151858</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>DEPC água</td><td>Sigma</td><td>95284-100ML</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Drosophila Incubadora</td><td>Percival</td><td>I-41NL</td><td>Criação Drosophila</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>12657-029</td><td>Cultura</td></tr> de <tr><td>células de fundo plano placa de 96 poços</td><td>Sigma</td><td>CLS3922</td><td>Microscópio</td></tr> de <tr><td>fluorescência Olympus</td><td></td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sigma</td><td>Tampão</td> de lise <td>de extração de RNA</td>I9516</tr><tr><td>(extração de RNA)</td>Tampão de lise de reagente <td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td>TRIzol</td></tr><tr><td>(extração de RNA de amostra líquida)</td>Microscópio de reagente <td>Thermo Fisher</td><td>10296028</td><td>TRIzol LS</td></tr><tr><td></td><td>Injetor</td> de nanolitro automático Olympus <td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Nanoject II Volume Variável (2,3 a 69 nL) Injetor Automático com Capilares de Vidro (110V)</td></tr><tr><td>Filme Adesivo Óptico</td><td>ABI</td><td>4360954</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, Líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Placa</td></tr><tr><td>qPCR</td> de cultura celular <td>ABI</td><td>A32811</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Schneider' s Inseto Médio</td><td>Sigma</td><td>S9895</td><td>Software</td></tr><tr><td>estatístico</td> de cultura celular <td>GraphPad Prism 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td><td>TransScript</td><td>AT301</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>VORTEX 3</td><td>Extração de RNA</td></tr></tbody></table>

estabelecimento de infecção viral e análise da interação vírus-hospedeiro em drosophila melanogaster.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Propagação do vírus é das principais causas de doenças epidêmicas. Assim, compreender a interação entre o vírus e o hospedeiro é muito importante para estender o nosso conhecimento de prevenção e tratamento da infecção viral. A mosca de fruta Drosophila melanogaster provou para ser um dos organismos modelo mais eficiente e produtiva de tela para fatores antivirais e investigar a interação vírus-hospedeiro, devido a ferramentas poderosas de genéticas e altamente conservada imune inata vias de sinalização. O procedimento descrito aqui demonstra um método de nano-injeção para estabelecer a infecção viral e induzir respostas antivirais sistêmicas em moscas adultas. O controle preciso da dose injeção viral neste método permite alta reprodutibilidade experimental. Os protocolos descritos neste estudo incluem a preparação de moscas e o vírus, o método de injeção, análise de taxa de sobrevivência, a medição de carga de vírus e uma avaliação do percurso antiviral. Os efeitos da influência da infecção viral pelo fundo dos moscas foram mencionados aqui. Este método de infecção é fácil de executar e quantitativamente repetíveis; pode ser aplicado para a tela para anfitrião/viral factores envolvidos na interação vírus-hospedeiro e dissecar o crosstalk entre imune inata de sinalização e outras vias biológicas em resposta à infecção viral.

Após a infecção de DCV de d. melanogaster, obtêm-se resultados desta seção. A Figura 1 mostra o fluxograma de infecção viral em Drosophila. Moscas são injetadas intra-thoracically, e em seguida as amostras são coletadas para a medição do viral TCID50 e o nível do genoma de RNA (Figura 1). Infecção por vírus pode induzir lise celular e CPE é observada em 3 dias pós infecção (Figura 2A). Em consonância com a carga de vírus, medida pelo ensaio d...

Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de interação entre vírus e hospedeiros sobre como estabelecer efetivamente uma infecção viral em Drosophila melanogaster. Este método de nanoinjeção permite um controle preciso da dose de infecção do vírus e pode ser facilmente aplicado a infecções com outros patógenos microbianos. Comece crescendo uma vez 10 a a sétima células estelares S2 viáveis por mililitro como monocamada solta e semi-aderente em um prato de cultura celular de 10 centímetros com 10 mililitros de Drosophila Medium completo schneider sem dióxido de carbono adicional a 25 graus Celsius por uma hora.Durante a incubação, resuspenque o vírus Drosophila C ou DCV recém-descongelado para uma multiplicidade de infecção de 0,01 em um mililitro de meio completo e adicione solução de vírus aos pratos de cultura celular. Em seguida, devolva a placa para a incubadora Celsius de 25 graus por três a cinco dias. O vírus está pronto para coleta quando a morfologia celular parece embaçada e o meio de cultura está cheio de partículas negras indicativas de detritos celulares.Misture o supernasce por pipetar algumas vezes antes de transferir toda a cultura celular para um tubo de 15 mililitros para lise das células hospedeiras a menos 80 graus Celsius. Para gerar concentrações de trabalho do vírus, descongele a suspensão celular em um banho de água de 25 graus Celsius com agitação constante antes de pelotas dos detritos celulares por centrifugação. Em seguida, transfira o supernascer para um novo tubo estéril de 15 mililitros para vórtice e alíquota de até 200 microliters de solução de vírus por tubo.Para determinar a dose infecciosa média da cultura do tecido do vírus, primeira semente uma vez 10 para as cinco células estelares S2 em 100 microliters de meio completo em oito poços por coluna em 12 linhas de uma placa de 96 poços. Em seguida, devolva a placa para a incubadora Celsius de 25 graus. Selecione aleatoriamente cinco tubos de vírus a partir de menos 80 graus Celsius de armazenamento.Enquanto as células estão se instalando, encha 10 tubos de microcentrífugo estéreis de 1,5 mililitros com 450 microliters de meio completo estéril e adicione 50 microliters de estoque de vírus ao primeiro tubo de 1,5 mililitro contendo 450 microliters de meio estéril completo diluindo as suspensões 10 vezes por passo ao 12º poço. Ao final da incubação, adicione 50 microlitadores de cada diluição ao poço apropriado em cada coluna para esse tubo de vírus e adicione 50 microliters de meio de cultura sem vírus a um poço por coluna, bem como o controle negativo. Em seguida, coloque a placa na incubadora 25 graus Celsius por três dias e avalie o efeito citopático de cada estoque de vírus sob um microscópio Brightfield em uma ampliação de 20X diariamente.Classifique um poço em que as células pareçam embaçadas e o meio esteja cheio de fragmentos como um poço positivo e um poço no qual a morfologia celular é normal como um bem negativo. Antes da reprodução, misture completamente 400 microlitadores de 50 microgramas por mililitro de Tetraciclina com quatro gramas de alimentos frescos padrão de mosca de fubá e coloque o alimento a quatro graus Celsius durante a noite para evaporar o etanol. Na manhã seguinte, aqueça a comida à temperatura ambiente e coloque a comida e 20 fêmeas e 10 machos recém-eclosed adulto voam em um frasco de reprodução para uma incubação de reprodução de três a quatro dias a 25 graus Celsius e 60% de umidade sob um ciclo normal claro/escuro.Quando ovos suficientes foram colocados, colete as moscas adultas recém-eclosadas sob um fluxo leve de dióxido de carbono e crie o Drosophila novamente mais duas vezes como apenas demonstrado. Após três gerações de tratamento tetraciclina, colete cinco moscas sob um fluxo leve de dióxido de carbono e homogeneize as moscas com 250 microliters de água dupla destilada e algumas contas de cerâmica estéreis de 0,5 milímetros. Após um minuto, adicione 250 microliters de 2X Buffer A à amostra para vórtice antes de congelar as amostras a menos 80 graus Celsius.Em seguida, descongele rapidamente amostras de menos 80 graus Celsius armazenados em um banho de água de 25 graus Celsius, seguido de uma incubação de 30 minutos em um banho de água de 70 graus Celsius antes de extrair o DNA genômico e amplificar o DNA pela reação em cadeia de polimerase de acordo com os protocolos padrão. Confirme a ausência de Wolbachia 16 pequeno RNA e wsp em cada mosca homogeneizado por eletroforese de gel de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, criar o estoque de mosca livre de Wolbachia em alimentos padrão de mosca de fubá, como demonstrado.Para infecção viral, primeiro use um estereómico e fórceps finos para quebrar a ponta de uma agulha capilar de vidro ao diâmetro apropriado para nanoinjeção. Para montar o injetor, coloque o teto o-ring e um espaçador branco sobre o êmbolo metálico do injetor com a covinha grande voltada para fora. Use uma seringa equipada com uma agulha calibre 30 para encher a agulha de vidro com óleo mineral e coloque a agulha através da coleira.Coloque o anel O maior ao redor da base do colarinho cerca de um milímetro da extremidade cega da agulha e coloque a agulha no êmbolo do injetor. Fixar a agulha no êmbolo e pressionar o botão vazio para estender o êmbolo do microinjetor até que um sinal sonoro seja ouvido. Agora pressione o preenchimento para retrair o êmbolo de cinco milímetros e mergulhe a agulha em uma suspensão viral de 100 unidades formadoras de placas.Agite suavemente um ou pelo menos três frascos de 20 Drosophila masculino sem Wolbachia no prato de injeção. Moscas dotadas machos são preferidas durante o acasalamento e a reprodução pode influenciar as fêmeas. Em seguida, injete o tórax de cada mosca com 50,6 nanolitros de solução de vírus na região colorida ligeiramente mais clara entre a mesopleura e a pteropleura e meça a carga de DCV por ensaio de efeito citopático e RT PCR quantitativo de moscas terrestres como apenas demonstrado.Após a injeção, transfira cuidadosamente as moscas para um frasco fresco e coloque o frasco em uma posição horizontal para evitar que as moscas grudem no meio enquanto se recuperam da anestesia. A injeção é demorada, mas a replicação do DCV é muito rápida, por isso é muito importante anotar o tempo exato no tubo uma vez que todas as moscas de cada frasco tenham sido injetadas. A infecção por vírus pode induzir a lise celular e os efeitos citopáticos são observados em três dias após a infecção.Os primers wolbachia 16s rRNA e wsp podem ser usados para detectar a presença de Wolbachia e Drosophila como demonstrado. As moscas livres de wolbachia apresentam uma taxa de sobrevivência significativamente reduzida após a infecção pelo DCV e de forma dependente de doses. O DCV ativa vias de sinalização antiviral no hospedeiro que são críticas para a infecção antiviral em Drosophila, como evidenciado pela diminuição da taxa de sobrevivência e aumento da carga viral em moscas mutantes Dicer-2.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a contaminação com o genótipo wolbachia pode afetar a suscetibilidade das moscas de Drosophila melanogaster para a infecção pelo DCV. Após este procedimento, outros métodos como uma tela genética de maior escala podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre genes de hospedeiro definidos necessários para infecção viral ou respostas antivirais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da doença viral humana explorarem os mecanismos subjacentes a surtos de infecções virais humanas endêmicas no modelo Drosophila melanogaster.Não se esqueça que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar o equipamento de proteção apropriado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Novos fatores hospedeiro envolvidos na infecção viral podem ser identificados através de células baseado em perda de todo o genoma da função de triagem RNAi.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Fonte: Siva-Jothy, J. A., et al. Infecção Bacteriana Oral e Eliminação em Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)O vídeo demonstra a infecção oral de Drosophila melanogaster com bactérias patogênicas. Inclui a preparação de frascos de infecção e a transferência de moscas famintas para possibilitar a ingestão bacteriana. O procedimento captura a colonização intestinal, seguida pela esterilização superficial e homogeneização das moscas. Por fim, mostra a quantificação da carga bacteriana...

Infecção Oral de Drosophila melanogaster com Bactérias Patogênicas

Fonte: Hiroyasu, A., D et al., Extração de Hemocitos de Larvas de Drosophila melanogaster para Infecção e Análise Microbiana. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o procedimento para estabelecer uma infecção bacteriana em larvas de Drosophila , colocando-as em uma gota bacteriana e furando-as com uma agulha de tungstênio. As larvas são então incubadas em uma placa de ágar sulcada e rica em nutrientes para estudar as interações hospedeiro-patógeno.

Estabelecimento de infecção bacteriana em larvas de Drosophila

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para realizar uma nanoinjeção de um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo em moscas Drosophila machos adultos e, posteriormente, estudamos as respostas antivirais iniciadas devido à infecção. A análise da reação em cadeia da polimerase identifica a regulação positiva de genes específicos nas moscas infectadas que indicam a ativação das vias de resposta imune, incluindo interferência de RNA e sinalização JAK / STAT.

Nanoinjeção viral intratorácica para estudar interações vírus-hospedeiro em moscas adultas

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de efeito citopático para determinar a dose viral infecciosa de cultura de tecidos do vírus Drosophila C em células Drosophila S2*. Uma variedade de concentrações virais é usada para infectar as células cultivadas. A proporção de células que exibem alterações estruturais é determinada e esses dados são usados para calcular a dose infectante da cultura de tecidos.

Ensaio para determinar a dose infecciosa do vírus Drosophila C em células de insetos cultivadas

Drosophila melanogaster é um excelente organismo modelo para estudar o sistema imunológico inato e as consequências fisiológicas de infecções e doenças. Este protocolo descreve como fornecer infecções bacterianas robustas e quantitativamente repetíveis a D. melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Aprenda a estabelecer infecção viral em Drosophila melanogaster usando nano-injeção para análise de interação vírus-hospedeiro. Este método permite controle preciso da dose viral e estudo de dinâmicas de infecção in vivo.

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

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