Name: Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda genômica subtrativa computacional para identificar sequências genômicas difíceis de isolar usando software livre. Este método flexível auxilia na descoberta de alvos vacinais bacterianos e vírus desconhecidos.

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Os autores reconhecem Michelle Biederman, Alyssa Pedersen e Colin J. Saldanha por sua ajuda com o projeto de genômica zebra finch em várias fases. Também reconhecemos Evgeny Bisk para computação de administração do sistema de cluster e NIH grant 1K22CA184297 (para J.R.B.) e NIH NS 042767 (para C.J.S).

1. montar começando sequência de novo
Nota: Os dados de sequência de próxima geração (NGS) podem ser usados, enquanto um assembly pode ser produzido a partir desses dados. Dados de entrada apropriados incluem Illumina, PacBio, ou Nanopore de Oxford lê montado em um arquivo fasta. Para a concretude, esta seção descreve um assembly Illumina-baseado transcriptomic específicas para o estudo de zebra finch foram realizadas7; no entanto, esteja ciente de que as especificações variam de acordo com o projeto. Para o nosso projeto de exemplo, dados brutos foram derivados de um MiSeq e lê aproximadamente 10 milhões de pares foram obtidos de cada amostra.
<ol><li>Use Trimmomatic 0.3214 para remover adaptadores Illumina e bases de baixa qualidade. Na linha de comando, digite: Java-jar PE trimmomatic-0.32.jar-phred33 forward.fq.gz reverse.fq.gz - baseout quality_and_adaptor_trimmed ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 líder: 3 direita: 3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:40
</li>
	<li>Use pera15 v 0.9.6 para criar alta qualidade mescladas leituras de trimmomatic saída emparelhada leituras, usando parâmetros padrão. Na linha de comando, digite: pera -f < quality_and_adaptor_trimmed_1P.fastq > - r < quality_and_adaptor_trimmed_2P.fastq >
</li>
	<li>Réptil de uso v. 1.116 erro-corrigir o lê produzido através de pera. Siga o passo a passo protocolo descrito no17.</li>
	<li>Use a Trinity v 2.4.018 no modo padrão para montar as sequências corrigidas. Para bibliotecas de vertente específica, use o parâmetro SS_lib_type. A saída é um arquivo fasta (your_assembly.fasta). Na linha de comando, digite: Trindade - seqType fq..--SS_lib_type FR-max_memory 10g – Trinity_output..--deixada quality_and_adaptor_trimmed_forward_paired_reads.fq de saída – direito quality_and_adaptor_trimmed_reverse_paired_reads.fq – CPU 10 Nota: A saída será colocada em um novo diretório, Trinity_output, e o assembly será denominado 'Trinity.fasta', que pode ser renomeado como Your_assembly.fasta, se desejado. Consulte o site da Trindade para mais detalhes: https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Running-Trinity.</li>
</ol>2. explosão conjunto contra a sequência de referência
Nota: Uso esta etapa quando a referência é um conjunto ou longo lê como Sanger; Se ele é composto de Illumina-prima lê, consulte a etapa 3 abaixo para mapeamento de leituras para a consulta. Todas as etapas de explosão foram concluídas com versão 2.2.29+ embora os comandos devem funcionar em qualquer versão recente de explosão.
<ol><li>Fazer um banco de dados de explosão da sequência de referência (nucleotide_reference.fasta) na linha de comando. Entra em linha de comando a seguir: makeblastdb - dbtype nucl-em nucleotide_reference.fasta-se nucleotide_reference.db
</li>
	<li>EXPLOSÃO-fósforo (gerado na etapa 1) o conjunto de consulta ao banco de dados de referência. Para obter um arquivo de saída, use [-se BLAST_results.txt] e para gerar a saída tabular (necessária para etapas de processamento subsequentes com scripts Python), use [-outfmt 6]. Essas opções podem ser combinadas em qualquer ordem, para obter um exemplo concluir comando é [blastn-your_assembly.fasta - db nucleotide_reference.db de consulta-por BLAST_results.txt - outfmt 6]. Se uma configuração de valor e é desejada, use a opção - evalue com um número adequado, por exemplo [evalue-1e-6]. Esteja ciente no entanto que o ciclo subtrativo efetivamente inverte o evalue definindo conforme descrito na discussão.</li>
	<li>Para maior rigor, use sequências de proteínas do assembly como a consulta de explosão com traduzido do nucleotide BLAST (tBLASTn), que realiza a tradução de 6 vias de banco de dados (nucleotídeo). Este método é recomendado para a maioria dos sistemas não-modelo, evitando o problema de anotações de proteína incompleta.<ol>
<li>Garantir o correto código genético está selecionado para o organismo sendo estudado, usando o - opção de db_gencode. Para obter sequências de proteínas para a consulta, execute o comando TransDecoder.LongOrfs (do pacote de TransDecoder v. 3.0.1) para identificar os quadros de mais longa leitura aberta de sequências de consulta montada. O comando é [TransDecoder.LongOrfs -t your_assembly.fasta]; a saída será colocada no diretório chamado 'transcripts.transdecoder_dir' e irá conter um arquivo chamado longest_orfs.pep que contém as sequências de maior proteína predita de cada sequência em your_assembly.fasta.</li>
		<li>Para usar tBLASTn, execute o comando [tblastn-longest_orfs.pep - db nucleotide_reference.db de consulta-por BLAST_results.txt - outfmt 6]. Se uma referência de proteína de alta qualidade está disponível, use correspondência com BLASTp, ao invés de tBLASTn da proteína-proteína.</li>
		<li>Fazer um banco de dados de explosão da referência da proteína [makeblastdb - dbtype prot-em protein_reference.fasta-fora protein_reference.db] e depois [blastp-longest_orfs.pep - db protein_reference.db de consulta-fora BLAST_results.txt - outfmt 6]. Certifique-se de salvar os resultados como um arquivo para processamento a jusante e usar tabular (outfmt 6) para garantir que os scripts de Python podem analisá-los corretamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mapa lê para o Assembly
Nota: Este método pode ser usado se o conjunto de dados de referência consiste de leituras de genômicas crus, ao invés de sequências montadas ou sequências de Sanger, em qual caso uso BLAST (passo 2.1).
<ol><li>Usando o BWA-MEM v. 0.7.1219 ou bowtie220, mapear o baixado lê cru (raw_reads.fastq) para a montagem de consulta. A saída será formato de Sam. Comandos são os seguintes: primeiro índice do assembly: [bwa índice your_assembly.fasta] e mapeie o lê [bwa mem your_assembly.fasta raw_reads.fastq > mapped.sam]. (Nota do ' >' símbolo aqui não é um maior-do que assinar; em vez disso, ele instrui a saída para ir para o arquivo mapped.sam).</li>
</ol>4. usar Python Script para remover quaisquer sequências de correspondência
Nota: Dotado de trabalho de scripts Python 2.7.
<ol><li>Após a etapa 2, use subtrativa script Python usando o comando [./Non-matching_sequences.py your_assembly.fasta BLAST_results.txt]. Antes de executar o script, certifique-se de que o arquivo de saída de explosão é no formato 6 (tabular). O script de saída será um arquivo com sequências não-correspondentes em formato fasta chamado your_assembly.fasta_non-matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta e também a correspondência de sequências para registros, como your_assembly.fasta_matching_sequences_BLAST_ arquivo Results.txt.FASTA. A não-correspondência será o mais importante, como uma fonte de potenciais sequências de T para o teste e mais ciclos de genómica subtrativa.</li>
	<li>Após a etapa 3, execute o removeUnmapped.py de script Python para tomar como entrada o Sam da etapa 3.1 e identifica os nomes de sequências de consulta, sem qualquer correspondência lê e salva-los para um novo arquivo de texto. Use o comando [./removeUnmapped.py mapped.sam] e a saída será mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt. (O programa irá gerar um arquivo de sam enxuta com leituras tudo desmapeadas removidas; este ficheiro pode ser ignorado para fins do presente protocolo, mas pode ser útil para outras análises).</li>
	<li>Como a saída da etapa anterior é uma lista de nomes de sequência em um arquivo de texto chamado mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt, extrair um arquivo fasta com essas sequências: [./getContig.py your_assembly.fasta mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt]. A saída será um arquivo chamado mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt.fasta.</li>
</ol>5. projetar Primers para a sequência que permanece
Nota: neste momento há um arquivo fasta contendo sequências de candidato T. Esta seção descreve qPCR experimentalmente teste se provêm de T ou de regiões desconhecidas do R. Se a subtração na etapa 4 removido todas as sequências, então a montagem inicial falhou incluir T ou subtração pode ter sido muito rigorosa.
<ol><li>Use o Geneious21 para determinar sequências ideal da primeira demão manualmente.<ol>
<li>Destaca-se uma sequência de candidato de 21-28 bp para o primer para a frente. Evite execuções de 4 ou mais de qualquer base. Tente uma região com uma combinação razoavelmente uniforme de todos os basepairs de destino. Um único G ou C na extremidade 3' é benéfica, ajudando a ancorar o primer.</li>
		<li>Clique na guia estatísticas no lado direito da tela para ver os que a sequência estimado temperatura de fusão (Tm) como a região do candidato é realçada. Olhar para obter uma temperatura de fusão entre 55-60 ° C, evitando repetições e corridas longas de G/C.</li>
		<li>Siga as etapas 5.1.1. e 5.1.2 escolher um primer reverso, situado a 150-250 pares de bases 3' do primer para a frente. Enquanto os comprimentos de primeira demão não precisa corresponder, o Tm previsto deve ser tão próximo quanto possível para o Tm do primer para a frente. Não se esqueça de inverter a sequência de complemento (se o botão direito do mouse em Geneious enquanto a sequência é realçada é uma opção do menu).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use a função de Primer Design , que se encontra na barra de ferramentas superior na janela de sequência.<ol>
<li>Clique no botão de Projeto da primeira demão . Inserir a região para amplificar sob a Região de destino.</li>
		<li>Sob a guia de características , insira o tamanho desejado, temperatura de fusão (Tm) e % GC (consulte a etapa 5.1.1.).</li>
		<li>Clique em Okey para ter as primeiras demão geradas. Encomendar os primers através de um serviço personalizado de oligo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valide as primeiras demão com DNA de controle (codificação tanto T e R) para otimizar o tempo Tm e extensão. Uso regular Taq e eletroforese em gel para ver o tamanho da banda, mas otimização também pode ser realizada com qPCR seguindo os métodos na etapa 6.<ol>
<li>Fazer 10 diluições X de primers para diante e reversos para que os primers têm uma concentração de 10 μM.</li>
		<li>Use uma mistura PCR de 0,5 μL de dNTP, 0,5 μL de primer para a frente, 0,5 μL de primer reverso, 0,1 μL da Taq polimerase, 2 μL de modelo, 0,75 μL de magnésio, 2,5 μL de tampão e 18.15 μL de água para que haja 25 μL por modelo, com uma concentração de 5 ng / ΜL.</li>
		<li>Teste os primers em diferentes temperaturas de fusão no programa do PCR. Geralmente o desempenho ideal é derreter observadas temperaturas ligeiramente abaixo do predito Tm dos primers, mas não geralmente acima de 60 ° C. Também testar a extensão ideal vezes usando este guia: 1 min por 1000 bp (assim, geralmente de 10 a 30 segundos dependendo do comprimento do amplicon).</li>
		<li>Realize a eletroforese em gel de ponto de extremidade para confirmar que os primers amplificam a sequência esperada. Corra 25 μL do produto qPCR misturado com 5 μL de 6 X tintura de glicerol em um gel de agarose 2% TAE a 200 V por 20 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. qPCR validação da sequência restantes
Nota: Este passo requer primers validados e condições do PCR estabelecidas na etapa 5.
<ol><li>Executar cada modelo em triplicado com a seguinte mistura; 12,5 μL de mistura de mestre PowerSYBR Green, 0,5 μL de primer para a frente com uma concentração de 10 μM, 0,5 μL de primer reverso com uma concentração de 10 μM, 10.5 μL de água e 1 μL de DNA de modelo (em uma concentração de 2 ng/μL) , para que cada um contém bem 25 μL de volume total.</li>
	<li>Execute um programa de qPCR informado pelo validado temperatura e tempo de extensão da etapa 4. Projetamos e validado todos os primers para ser compatível com um ciclo de dois estágios, 95 ° C por 10 min iniciais derreter, em seguida, 40 ciclos de 95 ° C por 30 s e 60 ° C por 1 min. No entanto, um programa de três estágios (derreter-recoze-estender) pode ser o mais ideal para as primeiras demão e deve ser adaptado, se necessário. Recomendamos que curvas de desnaturação finais ser gerado pelo menos a primeira vez que os primers são empregados de qPCR para validar a amplificação de um único produto de DNA.</li>
	<li>Medida qPCR/SYBR Green sinaliza em relação a actina (ou qualquer outro controle adequado 'R') por CT. para todos os casos de calcular a média e o desvio padrão de 2-(gene Ct - Ct β-actina).</li>
	<li>(Opcional) Realize a eletroforese em gel de ponto de extremidade para confirmar a deteção do tamanho correto do produto por qPCR. Aqui, correr 25 μL do produto qPCR misturado com 5 μL de 6 x tintura de glicerol em um gel de agarose 2% TAE a 200 V por 20 min.</li>
</ol>7. repita com uma nova referência para Pare os dados.
Nota: Se o passo 6 validado as sequências identificadas de T, termina o ciclo aqui(Figura 2). No entanto, uma série de considerações pode motivar uma continuação do ciclo, por exemplo, se muitas sequências R permanecem no arquivo ou se nenhuma das sequências candidato T foram validadas por qPCR na etapa 6.
<ol><li>Obter uma nova referência. Esta etapa permite uma nova iteração do ciclo e pode incluir dados brutos de genômicos, dados brutos de RNA-seq ou outros conjuntos de dados montados. Recursos valiosos para dados de referência incluem o banco de dados do genoma no National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) que armazena montado genomas acessíveis através de FTP (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/), e a expressão do Gene Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) onde lê a sequência de geração primas são armazenados. Projetos de genoma podem fornecer seus dados de sequência primas através de outros sites de projeto-associado e bancos de dados.</li>
</ol>

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species%3A+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biologyogy+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li>
<li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li>
<li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics%27+GemCode+Sequencing+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li>
<li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed-field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto subtrativa genómica é poderosa, não é uma abordagem do bolinho-cortador, que exigem personalização em diversas etapas-chave e a seleção cuidadosa de sequências de referência e amostras de teste. Se o assembly de consulta é de má qualidade, etapas de filtragem pode isolar apenas artefatos de montagem. Portanto, é importante validar completamente novo de assembly usando um protocolo de validação adequada para o projeto específico. Para RNA-seq, orientações são fornecidas sobre o Trinity site<sup class="xr...

A finalidade desse método é identificar uma alvo romance (T) sequência genômica, ou DNA ou RNA, de um contexto genômico, ou uma referência (R) (Figura 1). O método é mais útil se o destino não pode ser separado fisicamente, ou que seria caro para fazê-lo. Somente alguns organismos perfeitamente terminar de genomas para subtração, então uma inovação chave do nosso método é a combinação de computacionais e métodos de banco em um ciclo, possibilitando que os pesquisadores isolar sequências de destino quando a referência é imperfeita, ou um projecto genoma de um organismo não-modelo. No final de um ciclo, qPCR teste é usado para determinar se é necessário mais subtração. Uma sequência de candidato validado T mostrará a deteção estatisticamente maior em amostras de T-positivas conhecidas por qPCR.
Encarnações do método têm sido implementadas na descoberta de novos alvos de drogas bacteriana que não têm acolhimento homologs1,2,3,4 e identificação de novos vírus de hospedeiros infectados 5,6. Além da identificação de T, o método pode melhorar r: recentemente usamos o método para identificar 936 faltando genes do genoma de referência de zebra finch e um novo gene de um cromossomo apenas germline (T)7. Genómica subtrativa é particularmente valiosa quando T é provável ser extremamente divergentes de sequências conhecidas, ou quando a identidade de T é amplamente indefinida, como a zebra finch restrito germline cromossoma7.
Por não exigir uma identificação positiva de T previamente, a principal vantagem da genómica subtrativa é que é imparcial. Em um estudo recente, Readhead et al analisou a relação entre a doença de Alzheimer e abundância viral em quatro regiões do cérebro. Para identificação viral, Readhead et al criou um banco de dados de 515 vírus8, limitando severamente as agentes virais que seu estudo poderia identificar. Genómica subtrativa poderia ter sido usada para comparar o saudável e genomas de Alzheimer para isolar possíveis novos vírus associados com a doença, independentemente de sua semelhança com os agentes infecciosos conhecidos. Enquanto existem 263 vírus multiplataforma em humanos conhecidos, estima-se que existem aproximadamente 1,67 milhões por descobrir espécies virais, com 631.000-827.000 deles tendo um potencial de infectar seres humanos9.
Isolamento de vírus romance é uma área na qual subtrativa genómica é particularmente eficaz, mas alguns estudos podem não precisar de um método tão rigoroso. Por exemplo, estudos de identificação de novos vírus utilizaram imparcial sequenciamento do elevado-throughput seguido por transcrição reversa e BLASTx para sequências viral5 ou enriquecimento de viral de ácidos nucleicos para extrair e reverter transcrevem sequências virais 6. enquanto estes estudos empregado novo de sequenciamento e montagem, subtração não foi usada porque as sequências de destino foram positivamente identificadas através da explosão. Se o vírus estavam totalmente inédita e não relacionados (ou distantemente relacionados) para outros vírus, genômica subtrativa teria sido uma técnica útil. O benefício da genómica subtrativa é que sequências que são completamente novas podem ser obtidas. Se o genoma do organismo é conhecida, pode ser subtraída para fora para deixar qualquer sequências virais. Por exemplo, em nosso estudo publicado isolamos uma sequência viral romance de zebra finch através de genómica subtrativa, embora não fosse nossa intenção original7.
Genómica subtrativa também provou ser útil na identificação de alvos de vacina bacteriana, motivados pelo aumento dramático da resistência aos antibióticos,1,2,3,4. Para minimizar o risco de reação auto-imune, pesquisadores reduziu os possíveis alvos de vacina subtraindo quaisquer proteínas que têm homologs no hospedeiro humano. Um estudo particular, olhando pseudotuberculosis Corynebacterium, realizada a subtração de genomas de vertebrados anfitrião de vários genomas bacterianas para garantir que alvos possíveis drogas não afectaria as proteínas nos anfitriões levando a efeitos colaterais 1. o fluxo de trabalho básico desses estudos é baixar o proteome bacteriano, determinar as proteínas vitais, remover proteínas redundantes, use BLASTp para isolar as proteínas essenciais e BLASTp contra o anfitrião proteome para remover qualquer proteínas com homologs do anfitrião 1 , 2 , 3 , 4. neste caso, genómica subtrativa certifique-se de que as vacinas desenvolvidas não terá quaisquer efeitos fora do alvo no anfitrião1,2,3,4.
Costumávamos subtrativa genomics identificar o primeiro gene codificantes de proteínas restrito germline cromossomo (GRC) (no caso, T), que é encontrado em germlines mas não somático tecido de ambos os sexos10. Antes deste estudo, as informações genômicas só que era conhecidas sobre o GRC eram uma região repetitiva11. Montagem de novo foi a RNA sequenciado do ovário e teste os tecidos (R + T) de adultos zebra finches. A eliminação computacional de sequências foi realizada utilizando publicado somáticas (músculo) genoma sequência (R1)12, seu bruto (Sanger) ler dados (R2) e um de transcriptoma (R3) somática (cérebro)13. O uso sequencial de três referências foi guiado pelo qPCR teste na etapa 5 de cada ciclo (Figura 2A), mostrando que a filtragem adicional era necessária. O gene de α-SNAP a descoberta foi confirmado através de qPCR de DNA e RNA e clonagem e sequenciamento. Mostramos em nosso exemplo que este método seja flexível: não é dependente de correspondência de ácidos nucleicos (DNA versus RNA) e a subtração pode ser realizada com referências (R) que são compostas de módulos (assemblies) ou leituras crus.

<table><tbody><tr><td>Accustart II Taq DNA Polimerase</td><td>Quanta Bio</td><td>95141</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Blasic (BLAST)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td></tr><tr><td>Gravata borboleta 2</td><td></td><td></td><td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td></tr> <tr><td>BWA-MEM v. 0.7.12</td><td></td><td></td><td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td></tr><tr><td>Geneious</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>PEAR v. 0.9.6</td><td></td><td></td><td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td></tr><tr><td>Computador Pessoal</td><td>Biomatters</td><td></td><td>http://www.geneious.com/</td></tr> <tr><td>PowerSYBR qPCR mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Python v. 2.7</td><td></td><td></td><td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td></tr> <tr><td>Reptile v.1.1</td><td></td><td></td><td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td></tr><tr><td>Stratagene Mx3005P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>TransDecoder v. 3.0.1</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td></tr> <tr><td>Trinity v. 2.4.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td></tr></tbody></table>

sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Genómica subtrativa pode ser usada em qualquer pesquisa onde o objetivo é identificar a sequência de um gene, proteína ou região geral que está incorporado em um contexto maior genoma. Genómica subtrativa permite que um pesquisador isolar uma sequência do alvo do interesse (T) sequenciamento abrangente e subtraindo elementos genéticos conhecidos (referência, R). O método pode ser usado para identificar sequências de romance como mitocôndrias, cloroplastos, vírus, ou germline restrito de cromossomos e é particularmente útil quando T não pode ser facilmente isolado de R. começando com os dados completos de genômicos (R + T), o método usa base Local alinhamento pesquisa ferramenta (explosão) contra uma sequência de referência, ou sequências, para remover as sequências conhecidas correspondentes (R), deixando para trás o alvo (T). Para subtração funcionar melhor, R deve ser um projecto relativamente completo que está faltando T. Desde sequências restantes após subtração são testados através de quantitativos Polymerase Chain Reaction (qPCR), R não precisa ser completa para o método de trabalho. Aqui temos link passos computacionais com etapas experimentais em um ciclo que pode ser iterado conforme necessário, sequencialmente, removendo várias sequências de referência e refinar a busca por T. A vantagem da genómica subtrativa é que uma sequência totalmente inédita do alvo pode ser identificada mesmo nos casos em que a purificação física é caro, difícil ou impossível. Uma desvantagem do método é encontrar uma referência adequada para subtração e obtenção de T-positivo e negativo de amostras para testes de qPCR. Descrevemos nossa implementação do método na identificação do primeiro gene cromossomo germline restrito de zebra finch. Nesse caso a filtragem computacional envolveu três referências (R), removidas sequencialmente em três ciclos: um assembly genômica incompleto, dados brutos de genômicos e transcriptomic dados.

Após a explosão de execução, o arquivo de saída terá uma lista de sequências de consulta que correspondem ao banco de dados. Após a subtração de Python, um número de sequências não correspondentes será obtido e testado por qPCR. Os resultados do presente e próximos passos, são discutidos abaixo.
Resultado negativo. Há dois possíveis resultados negativos que podem ser vistos depois da explosão para a sequência de...

O propósito do presente protocolo é usar uma combinação de computacional e pesquisa do banco para encontrar romance sequências que não podem ser separadas facilmente uma sequência co purificante, que pode ser apenas parcialmente conhecida.

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Nosso protocolo é significativo porque pode ser usado para identificar sequências genômicas que não podem ser isoladas de sequências de co-purificação, que podem ser apenas parcialmente conhecidas. As principais vantagens dessa técnica é que ela é barata, usando principalmente software livre que pode ser baixado, bem como flexível. Você pode aplicá-lo a muitas questões biológicas.As aplicações potenciais incluem identificar alvos de vacinas bacterianas e identificar vírus cujas sequências são extremamente diferentes dos micróbios conhecidos. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema no qual o desconhecido não possa ser separado experimentalmente, desde que a sequência de referência sem o alvo genômico esteja disponível. Esta técnica requer alguma tentativa e erro, por isso a paciência é importante.Você pode precisar de problemas para filmar os programas. Você pode usar programas diferentes dos que descrevemos aqui. Use os manuais do usuário o máximo possível.A demonstração visual deste método é útil porque o trabalho computacional depende de uma compreensão básica de como a programação da linha de comando é estruturada. Para começar, use Trimmomatic 0.32 para remover adaptad

novel-sequence-discovery-by-subtractive-genomics

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Estratégia de genética molecular para encontrar mutações de novo causando doenças comuns, tais como autismo e esquizofrenia.

A estratégia para identificar mutações de novo em Distúrbios comuns, tais como autismo e esquizofrenia

Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

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Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

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Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

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