Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal
8 de dezembro de 2018
Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.
O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como combinar o uso de micro fluidez com microeletos para gerar a plataforma adequada para o estudo da comunicação neuronal e propagação de sinais axonacionais. Olá, sou Paulo Aguiar e sou o PI do Laboratório de Neurociências em Neuroengenharia e Computação do INEB, usado para codificação para engenharia biomédica na Universidade do Porto, Portugal. Entender a transmissão de informações em circuitos neurológicos continua sendo um dos maiores desafios da neurociência.
Hoje, vou mostrar como podemos combinar matrizes individuais de micro atuadores com micro fluidez e ferramentas de software desenvolvidas aqui em nosso laboratório, para detectar e caracterizar potenciais de ação propagadores. Usamos essa configuração em uma variedade de estudos, ou seja, codificação neural e decodificação, e em comunicações entre neurônios sensoriais e outros tipos de células. Acreditamos que a demonstração visual deste protocolo é crucial.
Uma vez que a montagem de matrizes micro fluidas e micro eletrodos é essa dificuldade de gerenciamento, e difícil de reproduzir apenas reproduzindo protocolos. Para o mercado, as vendas cultas nesta plataforma não são simples, como os ABAs convencionais, e requer atenção especial para as células sentadas e ímãs de cultura. Essa configuração nos permite estudar várias propriedades relacionadas à comunicação, como velocidade e direção de propagação, em um ambiente bem controlado.
Embora o procedimento de gravação seja simples, a análise dos dados requer conhecimento e o uso das ferramentas computacionais certas. No dia anterior à sessão celular, comece preparando os dispositivos micro fluidos, limpando com fita de vinil. Pressione suavemente a fita contra o dispositivo para alcançar todas as áreas do micro fluido.
O plasma de ar limpa o MEA por três minutos para limpar a superfície e torná-la mais hidrofílica. Dentro de uma capa de fluxo laminar, submergir os micro fluidos em 70% de etanol. Deixe-os secar.
Coloque cada MEA em uma placa de petri e esterilize por 15 minutos de exposição à luz UV. Em seguida, vá para a área central do MEA com 500 microliters de solução PEI. Incubar por pelo menos uma hora.
Dentro de uma capa de fluxo laminar, aspire a solução de revestimento PEI da superfície MEA. Em seguida, lave os MEAs quatro vezes com um mililitro de água estéril. Com a ajuda de um microscópio estéril, colocado dentro da capa de fluxo laminar.
Centralizar o chip MEA e adicionar um mililitro de água estéril à área central do MEA. Em seguida, coloque o dispositivo micro fluido no topo da superfície MEA e alinhe cuidadosamente a rede microativa microgrooves do MEA. Aspire a água excessiva e incuba durante a noite a 37 graus, para permitir a fixação completa.
No dia seguinte, carregue os poços com laminina, e incuba novamente. Após a coleta dos susseds embrião, prossiga para a dissecção do córtex pré-frontal. Comece expondo cuidadosamente o cérebro, usando um par de fórceps.
Então, remova suavemente o cérebro da cavidade. Cubra com H-HBSS frio. Quando presente, remova e descarte as lâmpadas olfativas.
Finalmente, dissecar o córtex pré-frontal. Certifique-se da remoção completa das meninges. Repita este procedimento para ambos os hemisférios.
Para o número de cérebros necessários para o seu estudo. Dentro de uma capa de fluxo laminar, colete os fragmentos do córtex anteriormente dissecados em um total de cinco mililitros de H-HBSS. Em seguida, transfira esses fragmentos para um tubo crônico estéril de 15 mililitros.
Pipeta, e tem 2,3 mililitros de solução de trippsina recém-preparada para o tubo contendo os fragmentos do córtex. Misture a suspensão e incubar a 37 graus por 15 minutos. Agitar a cada cinco minutos.
Em seguida, descarte o supernatante contendo a trippsina, adicione H-HBSS contendo FBS, para inativar o restante da trippsina. Gentilmente agitar. Deixe os fragmentos do córtex se acalmarem, e descarte o supernatante.
Lave duas vezes com H-HBSS, para remover o FBS, e descarte o supernatante novamente. Adicione tecidos basais neurais suplementados e mecanicamente dissociados, pipetando lentamente para cima e para baixo. Descarte o tecido restante filtrando a suspensão do sal através de um coador celular.
Em seguida, misture 20 microliters de suspensão celular com 20 microliters de azul tripano. Transfira 10 microliters para uma câmara de Neubauer, e conte o número de células viáveis. Imediatamente antes da cela sentar, remova a laminina de todos os poços do micro EF. Em seguida, adicione o pequeno volume de meio supernante a cada poço do compartimento axonal.
Lentamente semeou cinco microliters de suspensão celular para o compartimento somal. Incubar a 37 graus durante uma hora para permitir a fixação celular ao substrato. Depois de uma hora, encha suavemente cada poço com meio complementado quente.
Adicione pequenos volumes para evitar o desprendimento celular. Em seguida, transfira o micro EF para uma incubadora. Aqui é mostrado uma cultura em cinco dias in vitro.
Após uma semana, as culturas começam a exibir atividade espontânea. Antes de realizar gravações, use um controlador de temperatura para comer a placa base de fogo pré-amp. Em seguida, coloque o micro EF no pré-amplificador e feche e trave a tampa.
Para gravar, abra o software experimental multicanal. Defina a taxa de amostragem para 20 kilohertz. Arraste o filtro e as caixas gravadas e conecte-as sequencialmente para registrar dados crus e filtrados.
Inicie a aquisição de dados para visualizar os sinais e registrar rapidamente. Os dados gravados podem ser rapidamente explorados usando o analisador multicanal. Aqui, a propagação do sinal ao longo dos microgrooves já está clara.
Para identificar e caracterizar esses eventos de propagação, abra sua gravação no micro spike hunter. Clique no botão de informações do arquivo para acessar as configurações de gravação e selecione o conjunto de micro eletrodos para análise. Defina o limiar para propagar a detecção de eventos.
E ler rapidamente os dados. O software listará todas as sequências detectadas. O usuário pode então avaliar a velocidade de propagação como a informação, entre pares de micro eletrodos, e com base em sua inter distância e correlação cruzada.
A ferramenta de quimiografo permite que o usuário estime manualmente a velocidade de propagação. Aqui é mostrado um evento de propagação. Detectado ao longo de quatro micro eletrodos dentro de um microgroove.
Esses eventos podem ser representados em uma trama de Rasser. Aqui está a atividade de propagação ao longo de 11 microgrooves para os primeiros dois minutos de gravação. O microgroove alto e de baixa atividade são coloridos em amarelo e vermelho, respeitosamente.
Observe a sincronização da atividade ao longo dos 11 microgrooves. A sincronização é independente da taxa de atividade. Como pode ser visto nas variações da taxa de disparo instantânea dos dois microgrooves.
Microgrooves também funcionam como amplificadores de sinal axonal, como mostrado na caixa e na trama dos bigodes. Nós mostramos como combinar micro fluidíficas com MEAs, e como cultivar neurônios neles. Além disso, como gravar e extrair dados significativos dessas gravações.
Esperamos que essa demonstração seja útil para sua pesquisa, por que você pode querer estudar a comunicação em circuitos neurais.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo demonstra a integração de matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronais. Enfatiza a importância da demonstração visual e do uso de uma ferramenta computacional de fácil utilização para análise de dados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neuroengenharia
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Compreender a transmissão de informações em circuitos neurais é um grande desafio na neurociência.
- Matrizes de microeletrodos permitem o registro da atividade elétrica de neurônios.
- Dispositivos microfluídicos possibilitam o controle preciso do ambiente celular.
- A combinação dessas tecnologias pode aprimorar o estudo da comunicação neuronal.
Objetivo do Estudo
- Criar uma plataforma para estudar a comunicação neuronal e a propagação de sinais axonais.
- Detectar e caracterizar potenciais de ação propagados em culturas neuronais.
- Facilitar a pesquisa em codificação e decodificação neural.
Métodos Utilizados
- Integração de matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos.
- Uso de ferramentas de software desenvolvidas para análise de dados.
- Demonstração visual do protocolo para maior clareza.
- Aplicação em diversos estudos envolvendo neurônios sensoriais.
Resultados Principais
- Detecção e caracterização bem-sucedidas de potenciais de ação.
- Compreensão aprimorada dos mecanismos de comunicação neuronal.
- Demonstração da eficácia do protocolo em aplicações de pesquisa.
- Desenvolvimento de uma ferramenta computacional de fácil uso para análise de dados.
Conclusões
- O uso combinado de matrizes de microeletrodos e microfluídica é eficaz para estudar a atividade neuronal.
- Essa abordagem pode avançar a pesquisa em neurociência e neuroengenharia.
- Protocolos visuais são essenciais para a reprodutibilidade e o entendimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma microfluídica-MEA aborda um desafio fundamental na descoberta de fármacos em neurociência: isolar a propagação do sinal axonal do ruído somático em culturas neuronais. Ao permitir gravações de alta resolução e de longo prazo da propagação de potenciais de ação com relação sinal-ruído aprimorada, o método possibilita a desmistificação mecanicista de alvos envolvidos em neurodesenvolvimento, neurodegeneração e neuroregeneração. Ele fornece confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao quantificar fenótipos relacionados à comunicação, como velocidade de condução e padrões de disparo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar a sinalização axonal para esclarecer a comunicação específica de vias em circuitos neuronais.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da validação funcional de alvos que modulam a velocidade de propagação do potencial de ação e a falha de condução.
- Valor Preditivo: Quantifica a transmissão anterógrada do potencial de ação e os mecanismos de codificação para orientar a triagem de portfólios com base no engajamento funcional do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara culturas neuronais validadas e compartimentalizadas para avaliação de compostos em etapas subsequentes, com alinhamento controlado de axônios e acoplamento a microeletrodos.
- Resultados Quantitativos: Fornece medidas reprodutíveis e de alta resolução da velocidade de propagação, falha de condução e taxa de disparo, garantindo triagem confiável de compostos.
- Escalabilidade e Reutilização: Permite a padronização da plataforma em estudos de comunicação entre neurônios sensoriais e em configurações de co-cultivo, favorecendo a transferibilidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença Modela processos neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos por meio do rastreamento da propagação do sinal axonal ao longo de semanas in vitro.
- Continuidade Translacional Conecta a descoberta à validação pré-clínica mediante a quantificação de fenótipos de comunicação relevantes para a disfunção e reparo de circuitos.
- Avanço Ajustado ao Risco Informa decisões de prosseguir ou não com base em métricas objetivas do potencial de neuroregeneração e da fidelidade da codificação de informações.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes, fornecendo leituras funcionais que conectam triagem fenotípica e validação mecanicista em sistemas neuronais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias e a redução de riscos biológicos ao isolar as contribuições axonais na atividade da rede em microambientes controlados.
- Triagem: Fornece culturas neuronais prontas para ensaios, reprodutíveis e com leituras eletrofisiológicas padronizadas para avaliação de efeitos de compostos.
- Análises: Permite a comparação quantitativa de condições por meio de métricas derivadas da análise de sequências de potenciais de ação, como velocidade de propagação, falha de condução e taxa de descarga.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao modelar dinâmicas de comunicação axonal relevantes para neurodegeneração e neuroregeneração.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da comunicação de neurônios sensoriais e sistemas de cocultivo em diversas áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na propagação do sinal neuronal.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e a reprodutibilidade por meio do desenho de cultivo compartimentalizado e da estabilidade de longo prazo.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos envolvidos em patologias baseadas em circuitos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco por meio de fenótipos quantificáveis de comunicação axonal ligados a mecanismos da doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de dispositivos microfluídicos, cultura de neurônios e registro eletrofisiológico.
- Depende do acesso a matrizes de microeletrodos, limpeza por plasma, capelas de fluxo laminar e sistemas de registro com temperatura controlada.
- Necessita padronização entre equipes para garantir alinhamento consistente dos dispositivos, semeadura celular e protocolos de troca de meio.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a diferentes tipos neuronais ou configurações de co-cultivo além de culturas derivadas do córtex pré-frontal.
- Limitações práticas incluem a complexidade técnica da montagem de MEAs microfluídicos e a necessidade de ferramentas computacionais especializadas para análise de propagação de potenciais de ação.
