Name: Colletotrichum fioriniae Desenvolvimento em água e extratos florais baseado em clorofórmio Blueberry e Cranberry (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprenda bioensaios para monitorar o desenvolvimento do patógeno fúngico Colletotrichum fioriniae usando extratos florais de mirtilos e cranberries. Este método permite avaliar dinâmicas de patógenos em tempo real.

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Agradecemos a William S. Haines, fundo de pesquisa dotado de Cranberry Sr. e a New Jersey Blueberry e Cranberry Research Council, Inc. para suporte. Agradecemos também a Jennifer Vaiciunas (orientação e preparações florais), Christine Constantelos (cultura fúngica e preparações florais), David Jones (preparações florais e extrações), Langley Oudemans (preparações florais, filmagem/fotografia), Jesse Lynch (preparações florais), Roxanne Tumnalis (apoio geral) e inúmeros estagiários de estudante/verão.

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<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
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<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
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<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
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<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
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<li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os bioensaios para detectar a resposta c. fioriniae de extractos florais (FEs) foram desenvolvidos para a fruta mirtilo e cranberry podridão pathosystems mas podem ser facilmente adaptados a outras culturas hortícolas. O protocolo detalhado acima tem sido valiosa na aquisição de muitas importantes conjuntos de dados incluindo, mas não se limitando a: efeitos de FE em múltiplos isolados de inúmeros patógenos, tempo-curso informações referentes às fases de crescimento dos fungos na presença de vários FEs, comparação de técnicas de extração, inspeção de produtos químicos individuais na fioriniae c. crescimento e diferenciação, avaliação de órgão individual flor extrai, efeitos da temperatura na c. fioriniae , enquanto na presença de FE, efeitos de extrações de cera dependente de fenologia e efeitos florais da água da chuva. Através da utilização destas técnicas, dados gerados também deu uma compreensão muito mais clara de c. fioriniae vida dos estágios e parcialmente elucida porque o período de flor é tão crítico para o controle de muitas frutas apodrecendo patógenos.
Inicialmente, todas as flores foram processadas de forma idêntica para o ativo-FE, mas o processo de extração, mudou-se para a utilização de flores toda. Floral dissecção era demorada e teve muito pouco efeito sobre a bioatividade de FEs o resultante. No entanto, os órgãos florais individuais pode e tem sido avaliado usando este protocolo, mas muito cuidado deve ser tomado para não completamente macerar os tecidos florais (suplementar 1 filmecom precauções detalhadas no passo 2.3), como isto pode resultar em lançado compostos de fungos tóxicos/estático para o FE que poderia distorcer as avaliações microscópicas. Menos invasivas extrações como pass -FE (Supplemental Movie 2) e rw-FE são agora mais favoráveis devido a sua facilidade de aquisição. Além disso, essas técnicas de extração requerem apenas vácuo filtração para adquirir sugestões químicas florais biologicamente ativas.
As flores utilizadas em todas as extrações foram tipicamente refrigeradas para 0-3 dias antes da preparação do extrato. Um desafio do presente protocolo é de gerenciamento de tempo do volume de negócios FE (coleção campo através do armazenamento dos extratos). Isso foi agravado por numerosas amostras de várias fontes e datas. Flores congeladas não foram avaliadas de forma real, como descongeladas flores aparecem deterioradas e descoloridos. No entanto, uma vez que o FEs à base de água foram preparadas, repetidos de congelamento e descongelamento não tem mostrado nenhum efeito a bioatividade de fé, então contanto que o FE rapidamente são recongelados após preparação de bioensaio (FE viável para 3 ano de idade).
Extração baseado em clorofórmio permite a investigação de respostas do patógeno para ceras de superfície tridimensional floral/frutas em um plano bidimensional, através da evaporação do ch-FE em lamelas de vidro. No entanto, é improvável que o reais estruturas cristalinas das ceras depositadas de ch-FE são idênticas à superfície da qual foram recolhidos. Significado às técnicas suplementares devem ser implementadas se resposta fúngica a cera específica estruturas na vivo é o foco principal de investigação. Baseado em clorofórmio extrai precisa de manutenção de armazenamento mais do que as extrações à base de água. Além de manter o ch-FE extratos no escuro, a cultura de células PTFE revestida tubo tampões e parafilm envoltório precisam ser verificadas regularmente para detectar possíveis vazamentos por evaporação de vedação e substituído, se necessário.
O conceito de escoamento de águas pluviais floral de monitoramento está enraizado na ideia de promover ferramentas de monitoramento de sites específicos da doença. Os dispositivos de captação de água da chuva podem ser adaptados para muitas outras arquiteturas de planta, desde que o dispositivo de recolha capta água da chuva que tem executado fora flores. Essa abordagem fornece informações sobre ou não estímulo floral está presente no campo em um determinado momento e pode ser monitorado ao longo da temporada. Alternativamente, dispositivos de coleta podem ser implantados em vários locais do dossel para determinar até onde sugestões florais foram lavadas durante qualquer dado umectante-evento. No futuro, experiências, rw-FE ditarão quando aplicações de fungicida devem começar e quando eles podem acabar com segurança. Além disso, através da monitorização extrações de cera dependente de fenologia (protocolo seção 9), a importância do período de flor à biologia do patógeno tornou-se ainda mais evidente. Essa seção também foi incluída para demonstrar a flexibilidade destes bioensaios, fornecendo métodos que permitem a comparação lado a lado das ceras de superfície de anfitrião que são temporalmente separados. Os dados gerados usando as técnicas de extração floral e bioensaios representam indicadores tangíveis da estimulação do patógeno, classes químicas específicas importantes à biologia do patógeno e alvos de estratégias de controle futuro.

Colletotrichum fioriniae provoca uma podridão de frutos de Highbush Blueberry (Vaccinium corymbosum L.) e o grande americano Cranberry (V. macrocarpon Aiton)1,2. Este patógeno foi recentemente delineado do c. acutatum espécies complexas3,4,5,6 e é um agente causal da antracnose de mirtilo e membro da podridão fruta amora complexos, além de causar inúmeras outras plantas doenças no mundo7. C. fioriniae tem uma latente, hemibiotrophic estilo de vida8, com infecções ocorrem durante o desenvolvimento de bloom e sintoma não se tornando aparente até que a fruta está em fase final de maturação9. Em blueberry e cranberry, fruta podre é apenas adequadamente controlada com aplicações de fungicida, feitas durante o período de flor. O patógeno overwinters em mirtilo dormente broto floral escalas10 e sporulates durante a flor. Conídios são movimentados em todo o dossel através de respingo de chuva dispersão11,12 e acúmulo de inóculo tem sido fortemente correlacionado a flor período13. Resposta de espécies de Colletotrichum às flores de anfitrião não é exclusiva de Vaccinium, como flores são importantes componentes da fruta de citrino post flor caiam (PFD)14 , bem como morango antracnose15, em ambos os casos causando o patógeno para esporular. Todos esses casos destacam a necessidade de métodos eficazes avaliar a dinâmica temporal das sugestões químicas florais na c. fioriniae e outros patógenos que infectam durante a flor. Os insights fornecidos pelos métodos descritos aqui estão se tornando cada vez mais valiosos.
Este protocolo detalha os métodos de aquisição de extrato floral (FE) e orienta a avaliação das respostas de c. fioriniae para FE através da lamela de vidro bioensaios15,16. As técnicas de extração florais são divididas em dois tipos principais; extrações de à base de água (ativo-FE, passiva (pass -FE) e campo baseado em água da chuva (rw-FE)) e extrações de17 baseado em clorofórmio (ch-FE). Inspeção de água mobilizada floral sugestões químicas permitem as extrações à base de água. Estes tacos mobilizados são prováveis componentes importantes do Tribunal de infecção, pois FE aumenta consideravelmente a velocidade de infecção16, além de fornecer a umidade necessária para a infecção ocorrer. Além disso, eles representam uma condição mais natural como estímulo floral pode ser lavado em toda o dossel durante eventos-umectante como observadas anteriormente em blueberry e outros sistemas de colheita14,16. Extracções florais baseado em clorofórmio (ch-FE) também fornecem informações valiosas referentes a resposta do patógeno a superfície do hospedeiro ceras17,18, elucidar os estágios iniciais de crescimento de conídios uma vez depositados em suscetíveis órgãos de host (ou seja, flores, ovários e frutos em desenvolvimento). Resposta do patógeno a mudanças sazonais na superfície ceras host também pode ser monitorada usando este protocolo. Por conseguinte, bioensaios são adaptados para trabalhar com FE à base de água ou FE baseado em clorofórmio para atenuar as diferenças inerentes entre estes dois materiais.
Os dados gerados a partir de bioensaios revelaram que extrações à base de água estimulam níveis mais elevados de conidiation secundário que extrações baseado em clorofórmio onde não havia uma resposta definitiva appressorial, implicando, portanto, vários compostos presente na fé. Curiosamente, ambos dessas respostas de crescimento foram observados quando usar água da chuva que tinha funcionado fora flores de mirtilo e amora, indicando vários compostos estimulatórios pode ser lavado da superfície das flores. Assim, monitoramento para estimulação floral irá fornecer insights sobre a probabilidade de sucesso do patógeno em um sistema agrícola.
O objetivo final do presente protocolo é fornecer uma metodologia para geração de base biológica obter informações sobre patógenos fúngicos planta em resposta a sinais químicos florais, bem como metodologias de iniciação que podem utilizar esta informação floral para auxiliar na processos de gestão e tomada de decisões específicas da doença.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m tamanho de poro, filtro esterilizante de acetato</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>Clarificação de extrato floral de mirtilo (FE)&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 &micro; l pipeta com pontas</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento, qualquer marca dentro do alcance será adequada</td></tr><tr><td>40-200 &micro; l pipeta com pontas</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento, qualquer marca dentro do alcance será adequada</td></tr><tr><td>5-40 &micro; l pipeta com pontas</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento, qualquer marca dentro do alcance será adequada</td></tr><tr><td>Copo de spray de tinta descartável para pistola de ar com adaptador de conexão&nbsp;</td><td>Harbor Freight</td><td>97098</td><td>Blueberry rainwater (rw-)FE collection</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Amsco</td><td>3011</td><td>Equipamento, preparação de meios</td></tr><tr><td>Esteira de malha de barra (folha de malha de plástico)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>Passive (pass)-FE collection</td></tr><tr><td>Temporizador de bancada</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-47</td><td>Equipamento, preparação FE</td></tr><tr><td>Mangueira de pressão/vácuo preta</td><td>VWR</td><td>62994-795 Componente de</td><td>filtro de vácuo</td></tr><tr><td>Funil Buchner</td><td>Coors USA</td><td>60240</td><td>Componente de filtro de vácuo, aceita discos de papel de filtro de 55 mm</td></tr><tr><td>Queimador de Bunsen&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Carbonato de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Equipamento RC 5B Plus</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>Equipamento, coleção rw-FE</td></tr><tr><td>Gaze (grau 50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS240</td><td>Equipamento, preparação FE</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>Químico, triclorometano: grau de ensaio, &ge; 99% puro, para biologia molecular, ágar de farinha de milho livre de peróxido</td></tr><tr><td>(CMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp; Meios de pré-mistura, armazenamento isolado em inclinações</td></tr><tr><td>Mancha azul-algodão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>Lactofenol mancha azul-algodão</td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>Componente do meio</td></tr><tr><td>Prensa de perfuração</td><td></td><td></td> <td>Delta-Equipment, coleção rw-FE</td></tr><tr><td>Água ultrapura EASYpure LF</td><td>Barnstead</td><td>D738</td><td>Equipamento, fonte de água deionizada</td></tr><tr><td>Etanol (95%)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de filtro químico (500 ml)</td><td>Pyrex</td><td>No. 5340</td><td>Componente de filtro a vácuo</td></tr><tr><td>Capuz de fumaça</td><td></td> <td>Hamilton-Equipamento, uso de clorofórmio</td><td></td></tr> <tr><td>Funil (7 X 7 cm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>Coleção Cranberry rw-FE, preparação FE</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro genérica&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-101</td><td>Bioassay condutância</td></tr><tr><td>Garrafa de spray de bomba de plástico genérica</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>pass-FE collection, pelo menos 250 ml de capacidade</td></tr><tr><td>Tubos de cultura de células de vidro</td><td>-</td><td>-Armazenamento</td> <td>de lamínulas de vidro ch-FE</td></tr><tr><td>(22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>Bioassay conductance</td></tr><tr><td>Glass Van Tieghem cells (tubos de vidro cortados à mão)</td><td>- </td><td>-</td><td>Bioensaio de clorofórmio (ch)-FE, (8 mm OD 6 mm ID)</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro (1-100 &micro; l)</td> <td>Hamilton Co. Inc.</td><td>#710</td><td>ch-FE bioensaio</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lactofenol mancha azul-algodão</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Ácido lático</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>Lactofenol mancha azul-algodão</td></tr><tr><td>Capuz de fluxo laminar</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>Equipamento, ambiente de trabalho estéril</td></tr><tr><td>Sonda metálica (genérica)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Mistura de tratamento aquoso para armazenamento e preparação</td></tr><tr><td>Microscópio, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Argamassa (cerâmica)</td><td>Coors USA</td><td>60313</td><td>Componente de filtro a vácuo</td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo&nbsp;</td><td>Coleção de flores</td> <td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td></tr><tr><td>Discos de papel (toalhas de papel cortadas)</td> <td>Office Basics</td><td>KCC01510</td><td>controle de umidade em bioensaio</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Filme de parafina de plástico&nbsp;</td></tr><tr><td>Pilão (cerâmica)</td><td>Coors USA</td><td>60314</td><td>Componente de filtro a vácuo</td></tr><tr><td>Cristais de fenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A92-100</td><td>Lactofenol mancha azul-algodão</td></tr><tr><td>Sacos plásticos (~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td><td>Equipamento, refrigeração de flores</td></tr><tr><td>Pratos de cultura de células plásticas (9 cm de diâmetro)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>(placa de Petri), condutância de bioensaio</td></tr><tr><td>Tampas revestidas com politetrafluoretileno (PTFE)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td><td>Armazenamento de copos ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex (100 ml)</td><td>Pyrex</td><td>No. 1000</td><td>Preparação de ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex bread--</td><td></td><td></td><td>coleção pass-FE</td></tr><tr><td>Cilindro graduado Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipamento, preparação FE</td></tr><tr><td>Recipiente de plástico selado (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Condutância de bioensaio</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação pontiaguda</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Equipamento, para cortar discos de pano de queijo e papel</td></tr><tr><td>Coador de malha de aço inoxidável</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>Preparação da broca de passo ch-FE</td></tr><tr><td>(step-bit)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, coleção rw-FE</td></tr><tr><td>Laço estéril (combi-loop)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602</td><td>Preparação da cultura</td></tr><tr><td>Fio de telefone (fios internos)</td><td>-</td><td>-</td><td>Coleção Blueberry rw-FE</td></tr><tr><td>Cesta de tubos de ensaio&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>Substituição prontamente disponível para cesta de malha de plástico [morango]&nbsp;</td></tr><tr><td>V8 Juice</td><td>Campbell's Soup</td> <td>Company-Componente</td> <td>de mídia fúngica</td></tr><tr><td>Cestas de malha plástica vintage [morango]</td> <td>Coleção Doação-passa-FE, pode substituir a cesta de tubo de ensaio (470137-792)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie (Vortex)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812 Preparação de</td><td>suspensão de esporos</td></tr><tr><td>Whatman No. 1 Qualitativo 55 mm círculos</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Componente de filtro a vácuo</td></tr><tr><td>Laços de torção de plástico branco (100 mm)</td><td>Coleção Uline</td><td>S-566W</td><td>Cranberry rw-FE</td></tr></tbody></table>

colletotrichum fioriniae desenvolvimento em água e extratos florais baseado em clorofórmio blueberry e cranberry

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Para monitorar com precisão a fenologia do período de flor e a dinâmica temporal das sugestões químicas florais na fruta fungosas patógenos a apodrecer, foram desenvolvidos métodos de extração floral e lamela bioensaios utilizando Colletotrichum fioriniae. No mirtilo e amora, esse patógeno é otimamente controlado aplicando fungicidas durante o período de flor por causa da dramatização de flores na fase inicial da infecção. O protocolo detalhado aqui descreve como florais extratos (FE) foram obtidas utilizando água, clorofórmio e métodos de campo baseada em água da chuva para uso posterior em bioensaios de lamela de vidro correspondente. Cada FE serviu para fornecer um conjunto de informações diferentes: resposta de fioriniae c. a química floral mobilizada sugestões na água (à base de água), resposta de patógeno a flor e ceras de superfície de frutas (baseado em clorofórmio) e baseado no campo de monitoramento de coletados floral da água da chuva, movendo-se em vitro observações para um cenário agrícola. O FE é genericamente descrito como qualquer ou clorofórmio-à base de água, com um bioensaio apropriado descrito para compensar as diferenças inerentes entre estes dois materiais. Água da chuva que havia fugido de flores foi coletada em dispositivos exclusivos para cada cultura, aludindo à flexibilidade e à aplicação desta abordagem para outros sistemas de colheita. Bioensaios são rápidos, baratos, simples e fornecem a capacidade de gerar spatiotemporal e site-specific informações sobre a presença de compostos florais estimulatórios de várias fontes. Esta informação, finalmente, melhor informará estratégias de gestão de doença, como FE diminuir o tempo necessário para a infecção ocorrer, assim fornecendo a introspecção mudando os riscos para a infecção do patógeno sobre a estação de crescimento.

Os resultados apresentados aqui são alguns exemplos dos muitos ensaios que podem ser executados usando esta metodologia. Figura 1 é um guia ilustrado para o bioensaio de FE à base de água e é complementada pela Figura 2 , que dá seguimento para o bioensaio de FE baseado em clorofórmio. A Figura 3 fornece um guia visual para o que pode ser esperado após a avaliação microscópica de c. fioriniae a 24 h, em ambos os bioensaios e clorofórmio-à base de água (em comparação com controles SDW). Figura 4 detalha um estudo do tempo-curso de 24 h com c. fioriniae na presença da variedade de uva 'Stevens' ch-FE e dá uma referência visual para um resultado de importação desta pesquisa: FE diminuiu o tempo necessário para formar estruturas de infecção comparado a SDW. Figura 5 fornece um exemplo de dados coletados de um bioensaio de lamela usando o escoamento de águas pluviais floral amora (CB "Flor" rw-FE). A Figura 6 representa outro importante resultado: ovário floral ch-FE era muito mais estimulante do que fruta ch-FE, indicando a importância da flor do ciclo de vida de c. fioriniae. As fotos suplementares e filmes fornecem importantes elementos visuais das flores utilizadas nas extrações e a água da chuva floral coleção dispositivos/implantação, além de filmes que Visualizar o ativo e passivo - extração ( processos à base de água).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figura 1 : Visão geral da base de água floral extrair bioensaio (FE). Este ensaio foi utilizado para extratos florais à base de água com flores tanto mirtilo e amora: active -floral extrai (ativo-FE), passivo -floral extrai (passe-FE) e escoamento de águas pluviais floral (rw-FE). A - FE parte normalmente constitui o fator experimental/variável. Por outro lado a - FE parte pode permanecer constante e inoculação pós de tempo horas/pontos pode ser avaliada. Tornou-se preferência para análise de campo 4 ampliação de X 200. Abreviaturas: Estéril deionizada, SDW; Área por campo de visão, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figura 2 : Visão geral da base de clorofórmio floral extrair bioensaio (ch-FE). Este ensaio foi utilizado para tanto mirtilo e cranberry (fruta e flores, ovários). Apenas um tipo de mistura de tratamento aquoso foi usado neste ensaio, 1 suspensão de esporos de parte para 2 partes SDW (para manter a concentração conidiais consistente devido a evaporação de ch-FE). Este ensaio pode ser usado para comparar vários ch-FE (ceras de várias superfícies de planta), ou Múltiplo tempo pontos/horas após inoculação usando um único ch-FE. Abreviaturas: Estéril deionizada, SDW; Células de Van Tieghem [vidro], VanT. célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figura 3 : Comparação visual de Colletotrichum fioriniae na presença de FE à base de água e FE-ch. No mirtilo ensaio 'Bluecrop' (ativo-FE, à base de água) (isolar fungo: BB #10) e amora 'Stevens' baseado em clorofórmio (ch-FE) (isolar fungo: CB-PMAP182) extratos florais foram comparados aos controles SDW. Um aumento dramático na conidiation secundária (anéis) e formação de apressório (setas) foram observados quando comparando conídios na presença de SDW (controle) (A) ativo-FE (B) no pós-inoculação de 24 h. No entanto, conidiation secundário não era tão evidente quando se compara o clorofórmio bioensaio SDW controle (C) ch-FE (D); em vez disso, c. fioriniae crescimento para formação de appressorial. Mostrada é uma resposta comum para cada tipo de extração, à base de água e baseado em clorofórmio, independentemente do anfitrião/floral espécies descritas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figura 4 : Estudo do tempo-curso (24 h) com Colletotrichum fioriniae na presença de FE-ch. Neste ensaio, um controle SDW (A-D) e amora 'Stevens' ch-FE (E-F) foram inspecionados visualmente em 0, 6, 12 e 24 h após inoculação (um exemplo de pontos de tempo variável em vez de comparar vários FE). Formação de apressório (setas) começou às 6h em ch-FE e aumentou ao longo de pontos de tempo subsequente. Este resultados escapa ao fator importante da biologia do patógeno durante o período da flor: flores reduzem o tempo necessário para formar estruturas de infecção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figura 5 : Exibição gráfica de dados coletados usando rw-FE em um bioensaio. Águas pluviais executado fora flores amoras (CB "Flor" rw-FE) e águas pluviais virgem que não tinham tocado qualquer tecidos de planta amora (rw-FE "Chão") de um único evento-umectante, mais um padrão ativo, à base de água floral extracto de airela (CB ativo -FE) (controle positivo) e SDW (controle negativo) foram submetidos a um bioensaio lamela à base de água e avaliados para o crescimento de c. fioriniae . CB "Flor" rw-FE tinha o mesmo nível de formação secundária de conidiation e apressório como o padrão CB ativo-FE na inoculação após 24 h, indicando que os dispositivos de coleta foram eficazes na captura de estimulantes florais lançados durante um umectantes-evento. Conídios totais é composto de primária (depositado), conídios e recém-formado conídios secundários. Letras indicam diferenças significativas no p &lt; 0,05 de acordo com menos diferença Fischer significativa teste (LSD); conídios em maiusculas, totais; minúsculos, apressórios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figura 6 : Fenologia cranberry baseado ch-FE bioensaio, inspeção visual. Gestão de doença para a fruta apodrecer fungos frequentemente envolve aplicações de fungicida de tempo de florescer. Aqui, extratos de baseado em clorofórmio amoras (ch-FE) de vários estágios de crescimento de cranberry ('Stevens') visualmente foram avaliados para o efeito de superfície ceras em c. fioriniae no pós-inoculação de 24 h. Ovários, coletados em junho (A), frutos imaturos coletados em julho e agosto (B, C), coletados de fruta colhida em outubro (D)e um controle SDW (E) foram inspecionadas para formação de appressorial (setas). Ovário ch-FE tinha a maior magnitude da formação appressorial, indicando que esta fenologia da planta (flor) é criticamente importante para o ciclo de vida de c. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Suplementar Figura 1: inflorescência de mirtilo. Flores de mirtilo foram coletadas para extrações durante plena floração (abril-maio, em Nova Jersey, EUA) (mostradas 'Bluecrop'). Observe a sobreposição de corolas/ovários de flores adjacentes e a arquitetura geral da inflorescência comparada ao suplementar a Figura 2 (airela na vertical). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Suplementar Figura 2: Cranberry eretas. Flores de amora foram coletadas para extrações durante plena floração (junho-julho, em Nova Jersey, EUA) (mostradas 'Stevens'). Note-se a estágios variados flor em uma inflorescência amora única (vertical) e o gancho, gotículas de água, mantendo a forma do corolla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Suplementar Figura 3: implantação de águas pluviais de mirtilo (flor). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais floral mirtilo, colocado diretamente sob um cluster de inflorescências. Observe o arame revestido de plástico usado para orientar verticalmente o dispositivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Suplementar Figura 4: implantação de águas pluviais de mirtilo (tronco). Dispositivo de recolha em águas pluviais floral mirtilo concluído, colocado a meio caminho para baixo a haste entre uma inflorescência e a coroa da sarça. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Suplementar Figura 5: implantação de águas pluviais de mirtilo (coroa). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais floral de mirtilo, colocado na base da sarça (coroa). Nota de fios revestidos plásticos podem ser removidos se não for necessário. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Suplementar Figura 6: implantação de águas pluviais de mirtilo (terra). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais virgem, colocado adjacente de arbustos de mirtilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Suplementar Figura 7: implantação de Cranberry da água da chuva (close-up). Concluído o dispositivo de recolha de águas pluviais floral amora, com 2 colunas enfiadas sob os laços do fio ordenadamente cruzados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Suplementar Figura 8: implantação de águas pluviais Cranberry. Múltiplos completaram dispositivos amora floral da água da chuva, implantados em um pântano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Suplementar 1 filme: extratos florais ativos, à base de água (ativo -FE). Suporte de vídeo suplementar as seguintes etapas 2.3-2.5.1. Mirtilo 'Bluecrop' as flores foram usadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Suplementar Movie 2: passiva, extratos florais à base de água (passe-FE). Suporte de vídeo suplementar seguinte etapas 3.3-3.4. Mirtilo 'Bluecrop' as flores foram usadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Suplementar Movie 3: implantação de dispositivos de captação de águas pluviais floral amora. Suporte de vídeo suplementar seguindo passo 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>

Aqui, os bioensaios projetados para monitorar o desenvolvimento de um patógeno fúngico, Colletotrichum fioriniae, na presença de extractos florais mirtilo ou arando sobre as lamelas de vidro são descritos. Água, clorofórmio e água da chuva de campo - base floral extração técnicas são detalhadas bem como introspecção como esta informação pode ser aplicada.

Colletotrichum fioriniae Desenvolvimento em água e extratos florais baseado em clorofórmio Blueberry e Cranberry

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Este protocolo fornece um sistema barato e adaptável para avaliar a dinâmica temporal das pistas fluoroquímicas em Colletotrichum fiorniae e outros patógenos vegetais que infectam o termo bloom. Novos dispositivos de coleta de água da chuva permitem que o usuário monitore estimulantes naturais e condições que afetam o desenvolvimento de patógenos de forma quase em tempo real. Inicie este procedimento com uma cultura de Colletotrichum fiorniae de um hospedeiro naturalmente infectado, como descrito no protocolo de texto.Quando as colônias começam a esporular, listrar conidia em outro ágar V 8 Juice contendo prato de cultura celular para produzir uma cultura esporulante de alta densidade. Após sete dias de crescimento, use um laço estéril padrão para coletar uma pequena quantidade de conídio da cultura de alta densidade, tocando levemente o laço para a massa conidial. Misture isso em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de água deionizada estéril.Vórtice esta amostra por 10 segundos. Usando uma pipeta padrão, mergulhe várias vezes para misturar ainda mais a amostra. Em seguida, coloque uma gota da amostra vórtice no hemótmetro e estime as concentrações de esporos.Ajuste a concentração para 0,1 milhão de conidia por mililitro de água destilada estéril com um volume final de cinco mililitros. Isso é referido como a suspensão do esporo e só é feito imediatamente antes de ser usado em qualquer bioensaio. Para realizar a extração floral à base de clorofórmio, limpe todos os componentes com 95% de etanol duas vezes.Em seguida, limpe os componentes duas vezes com clorofórmio para evitar contaminação para cada extração. Não limpe as tampas forradas do PTFE com clorofórmio, pois as danificará. Após a limpeza, reserve os componentes para secar de cabeça para baixo.Combine uma parte das flores processadas a nove partes de clorofórmio em um béquer adicionando flores e, em seguida, clorofórmio. Gire suavemente por 30 segundos e coe através de uma tela de aço inoxidável no segundo béquer. Despeje o extrato à base de clorofórmio do segundo béquer no tubo de cultura de vidro e afixe a tampa PTFE.Enrole a tampa com parafilm para evitar a evaporação. Armazene o extrato floral à base de clorofórmio resultante na escuridão para reduzir a degradação da luz a quatro graus Celsius até o uso experimental. Repita extrações com várias amostras para fornecer réplicas.Para criar um dispositivo de coleta para cada local selecionado, use um passo ligado a uma prensa de perfuração para fazer um furo na parte inferior de um copo de spray. Em seguida, corte uma linha reta do topo do buraco até a boca do copo de spray. Agora faça quatro orifícios equidistantes grandes o suficiente para enfiar o fio revestido de plástico na boca do copo de spray.Conecte uma extremidade dos fios revestidos de plástico deixando uma extremidade livre. Faça um furo grande o suficiente para enfiar o spray de tinta ou o adaptador de copo em uma tampa de tampa centrífuga de 50 mililitros. Sele os fios do adaptador com parafilm para evitar vazamentos.Coloque-o tanto na tampa centrífuga quanto na porção roscada do copo do pulverizador. Em seguida, conecte o tubo de centrífuga de 50 milímetros acasalado. Crie quatro dispositivos de coleta por local de amostragem.Implante dispositivos em locais selecionados flexionando copos de pulverizador para caber em hastes. Oriente o lado cortado do copo do pulverizador para cima usando os fios revestidos de plástico presos a outras hastes. Isso garante que a água que passa sobre as flores seja capturada.Para coletar água da chuva de flores de cranberry, primeiro o calor pune oito orifícios equidistantes ao redor da boca do funil usando uma sonda de metal. Insira laços de torção em quatro dos orifícios. Conecte as outras extremidades ao local oposto desse buraco formando um padrão de cruzamento limpo.Enrole o funil a vapor com parafilm e reserve. Faça um furo grande o suficiente para inserir o funil para baixo em uma tampa centrífuga de 50 mililitros com um passo. Insira o funil preparado na tampa centrífuga.Após a chuva ou a irrigação aérea, remova e substitua a porção inferior do tubo de centrífuga. Os tubos de coleta de água da chuva devem ser rapidamente alterados após eventos de molhar, pois são propensos à degradação de contaminantes naturais mobilizados no escoamento, como bactérias e outros fungos. Coloque duas camadas de discos de papel dentro de pratos culturais e mergulhe com dois mililitros de água destilada estéril.Em seguida, misture volumes iguais de água destilada e extrato floral à base de água em dois tubos de microcentrífugo mililitro. Em seguida, adicione um volume igual da suspensão do esporo aos dois tubos de microcentrífugo preparados. A preparação resultante é referida como uma mistura de tratamento aquoso.Para o controle, omita a porção do extrato floral e substitua por água destilada estéril para manter as concentrações conidiais consistentes. Agora coloque tampas de vidro pré-limpas em cima das toalhas de papel encharcadas dentro do prato de cultura celular. Coloque uma gota de 40 microliter de mistura de tratamento aquoso no centro de uma tampa.Repita isso para tratamentos desejados, incluindo o controle. Em seguida, fechar o prato cultura celular. Uma vez dispensados todos os tratamentos e réplicas, coloque todos os pratos de cultura celular replicados em um recipiente plástico selado e incubar a 25 graus Celsius no escuro.Em pontos de tempo pré-determinados, adicione 10 microliters de fixação às gotículas parando o crescimento e semi-preservando a montagem. Uma vez que um fixador tenha sido adicionado, inverta cuidadosamente as tampas colocando cada um deles lado gotícula para baixo em um slide de microscópio de vidro para facilitar o exame microscópico. Quando todas as tampas estiverem nos slides do microscópio de vidro, deixe-as se acomodar e seque parcialmente no capô de fluxo por 20 minutos.Conte todas as conídias presentes no deslizamento de cobertura, incluindo coníscia primária, coníddia germinada, e conidia secundária recém-formada, bem como apressoria. Trabalhe em 400 vezes ou 200 vezes, totalizando uma área de 3.808 milímetros quadrados. Em uma capa de fluxo laminar, adicione dois volumes iguais de água destilada estéril e um volume de suspensão de esporos a um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.Reserve esta mistura de tratamento aquoso para bioensaões de extrato floral à base de clorofórmio. Em um capô de fumaça, coloque uma Célula Van T em uma tampa de vidro dentro do prato de cultura de células plásticas preparadas. Dispense 33 microliters de extrato floral desejado à base de clorofórmio no centro da célula e deixe secar.Não toque nas paredes da cela. Para o tratamento de controle, adicione clorofórmio virgem. Uma vez que o extrato floral à base de clorofórmio tenha secado, dispense 99 microliters da mistura de tratamento aquoso preparada com uma pipeta padrão no centro da Célula Van T.Em seguida, feche todos os pratos da cultura celular e incubar. Em pontos de tempo pré-determinados, adicione 15 microlitadores de um fixador à Célula Van T e deixe descansar por pelo menos cinco minutos para garantir a coloração fúngica adequada. Depois desse tempo, remova cuidadosamente a célula Van T.Executar etapas de inversão de deslizamentos e de aquisição de dados como antes. Após avaliação microscópica de C.fiorniae às 24 horas após a inoculação, a comparação da conidia na presença de água destilada estéril versus extrato floral à base de água revela um aumento dramático na conidição secundária e na formação de apressorium. No entanto, a conidição secundária não foi tão aparente quando comparamos o bioensato de clorofórmio estéril controle de água destilado com extratos à base de clorofórmio.Em vez disso, o crescimento de C.fiorniae mudou para a formação apressorial. Neste ensaio, um controle de água destilado estéril e extrações florais à base de clorofórmio de cranberry foram inspecionados visualmente a zero, seis, 12 e 24 horas após a inoculação. A formação de appressorium começou em seis horas no extrato floral à base de clorofórmio e aumentou constantemente ao longo dos pontos de tempo subsequentes.Esse resultado corrobora a constatação de que as flores reduzem o tempo necessário para formar estruturas de infecção. O manejo de doenças para fungos apodrecidos de frutas muitas vezes envolve aplicações de fungicidas em tempo de floração. Aqui, extratos à base de clorofórmio de cranberry de múltiplos estágios de crescimento de cranberry foram avaliados visualmente para as ceras de superfície eficazes em C.fiorniae às 24 horas após a inoculação.Os ovários coletados em junho, frutas imaturas coletadas em julho e, em agosto, frutas colhidas coletadas em outubro, e um controle de água destilado estéril foram inspecionados para formação apressorial. Extratos à base de clorofórmio tiveram a maior magnitude da formação apressorial indicando a importância da floração no ciclo de vida de C.fiorniae. O patógeno é o componente mais importante deste protocolo.Os fungos devem ser movidos para novas mídias rotineiramente para manter a consistência entre os ensaios. Qualquer trabalho com clorofórmio deve ser realizado em um capô de fumaça por razões de segurança. Isso inclui a preparação de materiais e vidros, procedimentos de extração e condutância do bioensaio à base de clorofórmio.Combinações de pontos de tempo, patógenos, coleções florais de água da chuva ou extrações de hospedeiros podem ser utilizadas para avaliar várias interações hospedeiro-patógeno. Os dispositivos de coleta de água da chuva e os bioensa periódicos associados permitirão que outros trabalhem com estimulantes de hospedagem mobilizados durante eventos pluviais em inúmeros sistemas de caminhos.

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