Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro
19 de agosto de 2019
Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.
Este protocolo é uma técnica robusta para determinar a integridade funcional das junções intercelulares em um modelo celular da barreira hematoencefálica humana. Este é um protocolo simples e bastante barato que permite calcular a permeabilidade aparente em um período de tempo mais curto em vez de executar um ensaio cinético mais longo. Este método também pode ser usado para determinar a integridade funcional de junções apertadas em células endoteliais cerebrais transfectadas com nanopartículas de DNA de polímeros.
Para começar o revestimento celular, coloque as pastilhas da cultura tecidual com membranas microporosas em uma placa de cultura de 24 poços. Adicione 400 microliters de 0,15 miligramas por mililitro tipo um em cada inserção de cultura tecidual. Em seguida, incubar por uma hora em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.
Balance a placa de 24 poços suavemente para permitir a propagação da solução de colágeno sobre a membrana microporosa nas pastilhas da cultura tecidual. Após uma hora, remova a solução de colágeno e lave suavemente a membrana microporosa com 0,4 mililitros de tampão PBS 1X. Agora, as células de placa hCMEC/D3 com uma densidade de 50.000 células por centímetro quadrado nas pastilhas celulares.
Coloque a placa de 24 poços com a configuração da cultura tecidual na incubadora para permitir a fixação e proliferação celular. Incubar a placa por sete dias para permitir que as células atinjam 100% de confluência. Remova o meio de crescimento a cada dois dias e transfira 0,5 mililitros de mídia fresca pré-aquecida para as pastilhas de cultura tecidual.
Repita o procedimento de chapeamento para a mancha ocidental para determinar alterações na expressão ZO-1 para transfecção de nanopartículas de DNA, e para o ensaio ATP determinar a viabilidade celular em células transfeccionadas. Para determinar a permeabilidade aparente lúcifer amarela, em cada dia pós-semeadura, remova o meio de crescimento e adicione 1,5 mililitros de tampão de transporte pré-aquecido ao lado basolateral do poço. Agora adicione 58,3 microliters de 20 micromolar solução Amarela Lúcifer ao lado apical de cada inserção trans-bem.
Salve 50 microliters da solução para medições de fluorescência. Depois de remover completamente o tampão de PBS residual do lado apical, adicione a solução Lucifer Yellow o mais rápido possível para evitar a secagem das células. Certifique-se de volumes precisos da solução Lucifer Yellow no lado apical.
Certifique-se de adicionar o mesmo volume preciso da solução Lucifer Yellow em todas as pastilhas. Trabalhe rapidamente para evitar secar as células. Incubar as células em um agitador de placa rotativa a 100 RPM e 37 graus Celsius por 60 minutos.
Em seguida, remova 30 microliters da amostra lucifer amarela de cada compartimento apical. Transfira a solução Lucifer Yellow de 20 micromolares e as amostras laterais apical para tubos pré-rotulados. Agora diluir a amostra dez vezes usando o buffer de transporte.
Remova 500 microliters de cada compartimento basolateral e transfira a amostra para tubos pré-rotulados. Prepare uma série de padrões Lúcifer Amarelo para a curva padrão. Adicione 100 microliters de cada amostra apical e basolateral padrão a cada poço de uma placa preta de 96 poços em duplicata.
Use um leitor de microplaca de fluorescência para medir a intensidade da fluorescência amarela de Lúcifer e calcular a permeabilidade aparente, conforme descrito no texto manuscrito. O efeito do tempo de cultivo na permeabilidade lúcifer amarela foi usado para determinar a cinética aparente da formação de junção apertada. Os valores aparentes de permeabilidade diminuíram significativamente no sétimo dia em comparação com o primeiro dia, sugerindo que a barreira ficou mais apertada.
Os valores aparentes de permeabilidade estabilizaram-se até o dia 10. Isso implicava que a formação da barreira estava completa e funcional, resultando na diminuição do transporte paracelular Amarelo Lúcifer. A mancha ocidental foi usada para detectar alterações na expressão da proteína de junção apertada ZO-1 ao longo do tempo.
As duas bandas representam os dois isoforms zo-1. A análise da densitometria revelou que o valor do pixel do ZO-1 aumentou dos dias três para sete pós-semeadura, sugerindo que a proteína de junção apertada ZO-1 se formou continuamente dos dias três a sete. Após o tratamento de esgotamento do cálcio no sétimo dia pós-semeadura, a banda de ZO-1 era quase indetectável, indicando que o ZO-1 era incapaz de se formar na ausência de íons de cálcio.
Como mostrado nos resultados, a mancha ocidental da proteína ZO-1 pode ser realizada para determinar mudanças no nível de expressão de proteínas de junção apertadas, complementando os dados de atividade funcional à base de Lúcifer Amarelo. Também descobrimos que a atividade funcional de junções apertadas em células endoteliais cerebrais humanas não foi afetada pela transfecção de nanopartículas de DNA.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo robusto e economicamente viável para avaliar a integridade funcional das junções apertadas em um modelo celular da barreira hematoencefálica humana (BHE) utilizando um ensaio de fluorescência baseado em Amarelo de Luciferina (LY). O método permite o cálculo rápido do coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) para monitorar a formação das junções apertadas e a integridade da barreira em monocamadas de hCMEC/D3, inclusive após transfeção com nanopartículas de DNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Neurociência
- Pesquisa sobre barreira hematoencefálica
Antecedentes
- A BHE é formada por células endoteliais que restringem a passagem de íons não essenciais e substâncias tóxicas para o cérebro.
- Junções apertadas (TJs) selam o espaço paracelular, mantendo a integridade da barreira.
- A avaliação da integridade das junções apertadas é fundamental para pesquisas sobre a BHE e estudos de entrega de fármacos.
- Ensaios tradicionais de permeabilidade podem ser demorados e exigir muitos recursos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um ensaio simples, rápido e de baixo custo para avaliar a integridade das junções apertadas em monocamadas de hCMEC/D3.
- Determinar a cinética da formação das junções apertadas e da maturação da barreira.
- Avaliar o impacto da transfeção com nanopartículas de DNA na integridade da BHE.
Métodos Utilizados
- Revestimento de inserts para cultura de tecidos com colágeno tipo I e semeadura de células hCMEC/D3.
- Incubação por até 7 dias para obtenção de monocamadas confluentes.
- Aplicação de Amarelo de Luciferina no lado apical e medição do seu transporte para o lado basolateral por leitura de microplaca com fluorescência.
- Western blotting para expressão da proteína de junção justa ZO-1 e ensaio de ATP para viabilidade celular.
Resultados Principais
- As monocamadas de hCMEC/D3 limitaram significativamente o transporte paracelular de LY no dia 7, indicando a formação de uma barreira apertada.
- Os valores de Papp diminuíram ao longo do tempo, estabilizando após o dia 7, refletindo a maturação das junções apertadas.
- A expressão da proteína ZO-1 aumentou dos dias 3 a 7, confirmando o desenvolvimento das junções apertadas.
- A transfeção com nanopartículas de DNA não comprometeu a integridade das junções apertadas nem aumentou a permeabilidade ao LY.
Conclusões
- O ensaio de fluorescência baseado em LY é eficaz para a avaliação rápida da integridade das junções apertadas da BHE.
- Monocamadas de hCMEC/D3 formam junções apertadas funcionais dentro de 7 dias em cultura.
- A transfeção com nanopartículas de DNA não afeta negativamente as propriedades da barreira da BHE neste modelo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa da integridade da barreira hematoencefálica (BHE) é fundamental para a descoberta precoce de fármacos para o sistema nervoso central (SNC) e para a redução de riscos mecanicistas. O ensaio de permeabilidade do amarelo de luciferina (LY) oferece um método robusto, rápido e economicamente eficaz para avaliar a função das junções apertadas e a maturação da barreira em modelos celulares humanos da BHE. Essa capacidade reforça a confiança preditiva na seleção de modelos pré-clínicos e orienta o triagem de portfólios para terapêuticas direcionadas ao SNC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a validação funcional da integridade das junções apertadas em modelos da BHE para estudos de engajamento de alvos.
- Auxilia na desmistificação mecanicista ao quantificar alterações na permeabilidade paracelular durante o desenvolvimento do modelo.
- Facilita a confiança preditiva na função da barreira antes da triagem de compostos ou manipulação genética.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma leitura padronizada e reprodutível da integridade da barreira em plataformas de triagem baseadas em transwell.
- Fornece coeficientes quantitativos de permeabilidade (Papp) para avaliar a prontidão do ensaio e a maturidade do sistema.
- Permite a avaliação rápida da adequação do ensaio para estudos de permeabilidade de compostos ou de transportadores.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha a integridade do modelo BBB in vitro com a expressão do biomarcador translacional ZO-1 para continuidade pré-clínica.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de candidatos ao SNC ao confirmar a fidelidade do modelo após transfeção ou tratamento.
- Reduz o risco biológico em estágios avançados ao garantir que as propriedades da barreira relevantes para a doença sejam mantidas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de permeabilidade do LY situa-se na interface entre a descoberta inicial e a qualificação do modelo pré-clínico, permitindo testes de hipóteses e validação de modelos rápidos antes da identificação de compostos líderes ou estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a função das junções apertadas para apoiar o desenvolvimento de modelos de BBB baseados em hipóteses.
- Triagem: Estabelece limiares reprodutíveis de permeabilidade para fluxos de trabalho de avaliação de compostos.
- Análises: Fornece saídas quantitativas de Papp e dados de expressão de ZO-1 para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Garante que as propriedades da barreira in vitro estejam alinhadas com as expectativas in vivo para estudos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um ensaio padronizado e escalonável, adaptável a diferentes sistemas de modelos de BBB e modificações genéticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na integridade do modelo da BHE e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Fornece medições rápidas, padronizadas e reprodutíveis de permeabilidade para fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao permitir a qualificação precoce do modelo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas do SNC com base na função comprovada da barreira.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular, configuração de ensaios de fluorescência e interpretação de dados.
- Necessita de acesso a leitores de microplacas com fluorescência e infraestrutura padrão para cultura celular.
- Exige padronização entre equipes quanto ao tempo do ensaio, densidade celular e protocolos analíticos.
- Adaptável a diversos sistemas de modelos da BHE e compatível com perturbações genéticas ou farmacológicas.
- A sensibilidade do ensaio e sua interpretação dependem da confluência consistente da monocamada celular e da expressão das proteínas das junções apertadas.
