Name: Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a avaliar a integridade das junções intercelulares em modelos de barreira hematoencefálica humana usando o ensaio de Amarelo de Lucifer. Este método rápido e econômico permite calcular a permeabilidade aparente em monocamadas de células hCMEC/D3.

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Os autores são gratos pelo apoio financeiro do 2017 New Investigator Award da associação americana de farmácia, um Hunkele temido Award doença da Universidade de Duquesne e da escola de farmácia start-up fundos para o laboratório Manickam. Gostaríamos de agradecer ao laboratório de vazamento (Duquesne University) para western blotting assistência e permitindo o uso de sua Odyssey 16-bit Imager. Nós igualmente gostaríamos de incluir uma nota especial da apreciação para kandarp Dave (laboratório de Manickam) para a ajuda com blotting ocidental.

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Os autores não têm nada a revelar.

Um papel fundamental do BBB é impedir a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas entre a circulação sistêmica e o cérebro para manter a hemostasia do microambiente neural. Uma das características do BBB é a capacidade das células endoteliais capilares para formar junções apertadas (TJs) que efetivamente selar a rota paracelular de transporte. Nós demonstramos um teste de LY Papp como um método quantitativo para determinar a cinética aparente da formação da barreira de TJ em monolayers cultivados de h...

A barreira hematoencefálica (BBB) é a barreira protetora que limita o afluxo de componentes plasmáticos no tecido cerebral e consiste em células endoteliais cerebrais, juntamente com células de apoio, como pericytes. O papel principal do BBB é servir como uma barreira que sela o espaço entre o sangue periférico e o sistema nervoso central (CNS) para manter a hemostasia do microambiente neural1,2. As pilhas endothelial capilares do cérebro selam eficazmente a via transcelulares paracelulares através da formação de junções apertadas intercelular (TJs)1. Esta barreira protetora permite glicose e nutrientes selecionados para entrar no cérebro, enquanto impede a maioria dos íons, substâncias tóxicas e drogas de passar por esta barreira apertada. Aparte de seu papel protetor, a função natural da barreira do BBB levanta um desafio severo no desenvolvimento de sistemas da entrega da droga que visam o CNS.
In vitro modelos de cultura celular do BBB são ferramentas úteis para estudar a sua biologia e para compreender os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a integridade da barreira TJ. Nós usamos a linha de pilha endothelial microvascular cerebral humana (hcmec/D3) como um in vitro modelo desde que é um modelo aceitado do endotélio do cérebro humano3 e recapitula muitas funções do BBB humano. hcmec/D3is uma das linhas celulares mais comumente utilizadas para modelar o BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Apesar de seus valores comparativamente baixos de resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de aperto de barreira, esta linha celular retém a maioria das propriedades morfológicas e funcionais das células endoteliais cerebrais, mesmo como uma monocultura na ausência de células gliais cocultivadas6,7. A linha celular hcmec/D3 expressa vários marcadores BBB,incluindo transportadores e receptores ativos até aproximadamente a passagem 35 sem sofrer desdiferenciação com fenótipos instáveis6,7,9 ,10,11. A característica mais marcante da linha celular hcmec/D3 como modelo in vitro BBB é sua capacidade de formar TJs5,9,11,12. Deve-se notar que, embora os modelos de BBB derivado de células-tronco mostraram maior permeabilidade em muitos estudos em comparação com a linha celular hCMEC/D3 e expressam alguns marcadores BBB, eles ainda estão a evoluir como o modelo de célula BBB mais comum13. É importante ressaltar que os modelos BBB derivados de células-tronco permanecem caracterizados em relação aos números máximos de passagem que permitem que as células mantenham fenótipos BBB estáveis14.
Três métodos primários são comumente usados para determinar a integridade da barreira TJ, incluindo a medida de TEER, medição do coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) de pequenas moléculas de traçador hidrófilo como sacarose, inulina, Lúcifer Yellow, etc. e imunocoloração de marcadores moleculares conhecidos de TJs tais como Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER é um método relativamente simples e quantitativo que mede a resistência elétrica através das monocamadas celulares cultivadas em substrato de membrana porosa5. No entanto, os valores de TEER podem ser influenciados por variáveis experimentais como a composição do meio de cultura e o tipo de instrumento de medida. Uma provável combinação desses fatores leva a uma ampla distribuição de valores de TEER variando de 2 a 1150 Ω cm2 na linha celular hCMEC/D3 cultivada por 2-21 dias13. A imunocoloração é um método Visual para determinar a presença de proteínas TJ através da rotulagem da proteína alvo usando anticorpos. No entanto, a imunocoloração envolve uma série de etapas experimentais, incluindo a necessidade de fixar/permeabilizar as células que podem resultar em artefatos experimentais e os sinais fluorescentes podem desaparecer ao longo do tempo. Os fatores acima podem levar a erros subjetivos que afetam a qualidade dos dados.
O foco preliminar deste trabalho é apresentar um ensaio aparente da permeabilidade de ly-based determina a cinética de uma formação confluente do monocamada em pilhas hcmec/D3 cultivadas. Embora outros sistemas avançados de BBB in vitro, tais como sistemas de cocultura, sistemas microfluílicos, sejam imita fisiologicamente mais relevantes com função de barreira significativamente melhorada15,16,17, o hcmec/D3 a instalação do transwell é um modelo simples e de confiança para estimar a cinética da formação de TJ e para ràpida a tela o efeito de formulações diferentes da droga na função da barreira. Em geral, os valores de Papp são consistentes para vários solutos hidrófilos em monolayers hCMEC/D3. Por exemplo, os valores doaplicativo P relatados para vários solutos de massa molecular baixa (como sacarose, manitol, ly, etc.) em diferentes modelos de BBB in vitro estão na ordem de 10-4 cm/min5,18,19 , 20. em nossa instalação experimental, as pilhas endothelial do cérebro são semeadas em uma membrana microporosa colagénio-revestida para o acessório da pilha e a formação do monocamada para imitar a barreira in vivo. O ly adicionado no lado apical é esperado atravessar as junções apertadas intercelular e acumular-se no lado basolateral. As concentrações maiores de LY no lado basolateral indicam uma barreira imatura, não-inteiramente funcional quando umas mais baixas concentrações refletirem o transporte restrito devido à presença de TJs funcionais tendo por resultado uma barreira madura.
LY é um corante hidrófilo com picos de excitação/emissão distintos e evita a necessidade de moléculas de traçador radiomarcar como sacarose, manitol ou inulina. Assim, os valores de fluorescência de LY podem ser usados para calcular diretamente sua permeabilidade paracelular através das monocamada BBB. Também, comparado a muitos corantes comercialmente disponíveis usados em campos biomédicos que sofrem de pequenas mudanças Stokes, como fluoresceina21, a mudança Stokes de ly é de cerca de 108 nm com separação espectral suficiente, permitindo assim que os dados de fluorescência ly como um leitura robusta para determinar a permeabilidade paracelular. Nós usamos a mancha ocidental como uma técnica ortogonal para demonstrar mudanças na expressão da proteína apertada do marcador da junção, ZO-1, sobre o tempo da cultura. A expressão ZO-1 detectada via Western blotting é usada para complementar os dados doaplicativo ly p e, em combinação, esses dados sugerem que as alterações observadas nos valores doaplicativo ly p são refletivas da formação de uma monocamada com aumento gradual na expressão do marcador de junção apertado, ZO-1.
Como apontado mais cedo, o foco central deste trabalho é demonstrar um ensaio de ly como uma técnica simples para monitorar a formação de um monocamada confluente com junções apertadas funcionais. No entanto, para demonstrar uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, medimos oaplicativo ly P em monolayers de NANOPARTÍCULAS de DNA-transfected hCMEC/D3. Os ácidos nucleicos podem ser condensados em nanopartículas de polieletrólitos com um diâmetro de 100-200 nm através da interacção ELECTROSTÁTICA entre os grupos de polímeros carregados positivamente e os grupos fosfato negativamente carregados de ácidos nucleicos22, 23. nós nos referimos a esses complexos como nanopartículas de DNA (DNA NPS) em nosso trabalho. Enquanto nossa intenção é transfecção células e expressar a proteína desejada, devemos garantir que as propriedades de barreira das monocamada hcmec/D3 não estão comprometidas. Nossos dados sugerem que um regime padrão do transfection do gene da luciferase de 4 h não mude mensurável a permeabilidade de ly que demonstra a utilidade do ensaio doapp de ly P para determinar mudanças na integridade da barreira de TJ.

<table><tbody><tr><td>Linha celular hCMEC/D3</td><td>Cedarlane Laboratories</td><td>102114.3C-P25</td><td>linha celular endotelial microvascular cerebral humana&nbsp;</td></tr><tr><td>gWizLuc</td><td>Aldevron&nbsp;</td><td>5000-5001</td><td>DNA plasmídico que codifica o gene luciferase</td></tr><tr><td>lucifer amarelo CH sal de dilítio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>155267</td><td></td></tr><tr><td>Transwell inserções com membranas de tereftalato de polietileno (PET) gravadas em trilha Falcon</td><td></td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de tecidos&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>Fundo Plano de 24 poços&nbsp;</td>Placas Imunológicas <td>Olympus Plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Pretas de 96 Poços&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>437111</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM 1X</td><td>Gibco</td><td>1951695</td><td>Spinner-mínimo essencial médio (S-MEM)</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Clonetics</td><td>CC-3156</td><td>Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)&nbsp;</td></tr>solução <tr><td>salina tamponada com fosfato 1X</td><td>HyClone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I&nbsp;</td><td>Descoberta Labware, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>354236 Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Lise de Cultura de Células 5X&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Beetle Luciferina, Sal de Potássio&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3&nbsp;</td><td>Leitor de Placa de Fluorescência</td> <td>Molecular Devices</td><td></td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Policlonal ZO-1&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>abcam</td><td>ab8245</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor680-conjugado AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>128817</td><td></td></tr><tr><td>12 poços, fundo plano</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>tampão RIPA (5X)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62524</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2503-10</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>para escaneamento de membranas de western blot</td></tr></tbody></table>

amarelo de lucifer-um marcador paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

A barreira sangue-cérebro BBB consiste em células endoteliais que formam uma barreira entre a circulação sistêmica e o cérebro para evitar a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas. Junções apertadas (TJ) efetivamente selar o espaço paracelular nas monocamadas resultando em uma barreira intacta. Este estudo descreve um ensaio de fluorescência com base em ly que pode ser usado para determinar o seu coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) e, por sua vez, pode ser usado para determinar a cinética da formação de monocamadas confluentes e a junção apertada resultante integridade de barreira em monocamada de hCMEC/D3. Nós demonstramos mais uma utilidade adicional deste ensaio para determinar a integridade funcional de TJ em pilhas transfected. Nossos dados do ensaio doaplicativo ly P mostram que as células hCMEC/D3 semeadas em uma configuração de transpoços efetivamente limitam o transporte de ly paracelular 7 dias-pós cultura. Como uma utilidade adicional do ensaio apresentado, nós igualmente demonstramos que o transfection da nanopartícula do ADN não altera o transporte de ly transcelulares paracelulares em monolayers de hcmec/D3.

Primeiramente, determinamos o efeito do tempo de cultivo na permeabilidade da LY para determinar a cinética aparente da formação de TJ. Os valores médios doaplicativo ly P do dia 1 a 10-post de semeadura são mostrados na Figura 2a. No dia 1, a média de Papp foi 4,25 x 10-4 cm/min e ligeiramente caiu para 3,32 x 10-4 cm/min no dia 2. O valor médio de Papp aumentou ligeiramente para 3,93 x 10-4 c...

Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Este protocolo é uma técnica robusta para determinar a integridade funcional das junções intercelulares em um modelo celular da barreira hematoencefálica humana. Este é um protocolo simples e bastante barato que permite calcular a permeabilidade aparente em um período de tempo mais curto em vez de executar um ensaio cinético mais longo. Este método também pode ser usado para determinar a integridade funcional de junções apertadas em células endoteliais cerebrais transfectadas com nanopartículas de DNA de polímeros.Para começar o revestimento celular, coloque as pastilhas da cultura tecidual com membranas microporosas em uma placa de cultura de 24 poços. Adicione 400 microliters de 0,15 miligramas por mililitro tipo um em cada inserção de cultura tecidual. Em seguida, incubar por uma hora em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.Balance a placa de 24 poços suavemente para permitir a propagação da solução de colágeno sobre a membrana microporosa nas pastilhas da cultura tecidual. Após uma hora, remova a solução de colágeno e lave suavemente a membrana microporosa com 0,4 mililitros de tampão PBS 1X. Agora, as células de placa hCMEC/D3 com uma densidade de 50.000 células por centímetro quadrado nas pastilhas celulares.Coloque a placa de 24 poços com a configuração da cultura tecidual na incubadora para permitir a fixação e proliferação celular. Incubar a placa por sete dias para permitir que as células atinjam 100% de confluência. Remova o meio de crescimento a cada dois dias e transfira 0,5 mililitros de mídia fresca pré-aquecida para as pastilhas de cultura tecidual.Repita o procedimento de chapeamento para a mancha ocidental para determinar alterações na expressão ZO-1 para transfecção de nanopartículas de DNA, e para o ensaio ATP determinar a viabilidade celular em células transfeccionadas. Para determinar a permeabilidade aparente lúcifer amarela, em cada dia pós-semeadura, remova o meio de crescimento e adicione 1,5 mililitros de tampão de transporte pré-aquecido ao lado basolateral do poço. Agora adicione 58,3 microliters de 20 micromolar solução Amarela Lúcifer ao lado apical de cada inserção trans-bem.Salve 50 microliters da solução para medições de fluorescência. Depois de remover completamente o tampão de PBS residual do lado apical, adicione a solução Lucifer Yellow o mais rápido possível para evitar a secagem das células. Certifique-se de volumes precisos da solução Lucifer Yellow no lado apical.Certifique-se de adicionar o mesmo volume preciso da solução Lucifer Yellow em todas as pastilhas. Trabalhe rapidamente para evitar secar as células. Incubar as células em um agitador de placa rotativa a 100 RPM e 37 graus Celsius por 60 minutos.Em seguida, remova 30 microliters da amostra lucifer amarela de cada compartimento apical. Transfira a solução Lucifer Yellow de 20 micromolares e as amostras laterais apical para tubos pré-rotulados. Agora diluir a amostra dez vezes usando o buffer de transporte.Remova 500 microliters de cada compartimento basolateral e transfira a amostra para tubos pré-rotulados. Prepare uma série de padrões Lúcifer Amarelo para a curva padrão. Adicione 100 microliters de cada amostra apical e basolateral padrão a cada poço de uma placa preta de 96 poços em duplicata.Use um leitor de microplaca de fluorescência para medir a intensidade da fluorescência amarela de Lúcifer e calcular a permeabilidade aparente, conforme descrito no texto manuscrito. O efeito do tempo de cultivo na permeabilidade lúcifer amarela foi usado para determinar a cinética aparente da formação de junção apertada. Os valores aparentes de permeabilidade diminuíram significativamente no sétimo dia em comparação com o primeiro dia, sugerindo que a barreira ficou mais apertada.Os valores aparentes de permeabilidade estabilizaram-se até o dia 10. Isso implicava que a formação da barreira estava completa e funcional, resultando na diminuição do transporte paracelular Amarelo Lúcifer. A mancha ocidental foi usada para detectar alterações na expressão da proteína de junção apertada ZO-1 ao longo do tempo.As duas bandas representam os dois isoforms zo-1. A análise da densitometria revelou que o valor do pixel do ZO-1 aumentou dos dias três para sete pós-semeadura, sugerindo que a proteína de junção apertada ZO-1 se formou continuamente dos dias três a sete. Após o tratamento de esgotamento do cálcio no sétimo dia pós-semeadura, a banda de ZO-1 era quase indetectável, indicando que o ZO-1 era incapaz de se formar na ausência de íons de cálcio.Como mostrado nos resultados, a mancha ocidental da proteína ZO-1 pode ser realizada para determinar mudanças no nível de expressão de proteínas de junção apertadas, complementando os dados de atividade funcional à base de Lúcifer Amarelo. Também descobrimos que a atividade funcional de junções apertadas em células endoteliais cerebrais humanas não foi afetada pela transfecção de nanopartículas de DNA.

lucifer-yellow-robust-paracellular-permeability-marker-cell-model

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Bioengenharia

Este vídeo descreve um ensaio de permeabilidade para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro usando moléculas de fluoresceína de sódio.

Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

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Direcionamento de drogas para tumores do sistema nervoso central é um grande desafio. Aqui descrevemos um protocolo para produzir um mímico in-vitro do tumor-barreira sangue-cérebro usando células murino e/ou humanas e discutir sua relevância para a previsibilidade do sistema nervoso central tumor direcionamento em vivo.

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A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

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Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Aprenda a avaliar a integridade das junções intercelulares em modelos de barreira hematoencefálica humana usando o ensaio de Amarelo de Lucifer. Este método rápido e econômico permite calcular a permeabilidade aparente em monocamadas de células hCMEC/D3.

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro (Vídeo) | JoVE Journal

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